Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio przebrzosławny jest idealnym modelem do obrazowania zachowań komórek podczas rozwoju in vivo. Zarodki danio są zapładniane zewnętrznie, co sprawia, że są łatwo dostępne na wszystkich etapach rozwoju. Ponadto ich przejrzystość optyczna umożliwia obrazowanie dynamiki komórkowej i molekularnej o wysokiej rozdzielczości w naturalnym środowisku nienaruszonego zarodka. Stosujemy metodę obrazowania na żywo w celu analizy zachowań komórek podczas migracji komórek grzebienia neuronalnego oraz wzrostu i prowadzenia aksonów neuronalnych.
Obrazowanie na żywo jest szczególnie przydatne w zrozumieniu mechanizmów regulujących procesy ruchliwości komórek. Aby zwizualizować szczegóły ruchliwości komórkowej, takie jak aktywność protrusyjna i dynamika molekularna, korzystne jest znakowanie pojedynczych komórek. U danio pręgowanego iniekcja plazmidowego DNA prowadzi do przejściowego mozaikowego wzorca ekspresji i oferuje wyraźne zalety w porównaniu z innymi metodami znakowania komórek. Na przykład linie transgeniczne często znakują całe populacje komórek, co może utrudniać wizualizację drobnych wypustek (lub zmian w rozkładzie molekularnym) w pojedynczej komórce. Ponadto iniekcja DNA w stadium jednej komórki jest mniej inwazyjna i bardziej precyzyjna niż iniekcje barwników w późniejszych stadiach.
W niniejszej pracy opisujemy metodę znakowania poszczególnych rozwijających się neuronów lub komórek grzebienia nerwowego oraz obrazowania ich zachowania in vivo. Wstrzykujemy plazmidowe DNA do embrionów w stadium jednej komórki, co prowadzi do mozaikowej ekspresji transgenu. Wektory zawierają specyficzne dla danych komórek promotory, które sterują ekspresją interesującego genu w podgrupie neuronów sensorycznych lub komórek grzebienia nerwowego. Przedstawiamy przykłady komórek znakowanych GFP celowanym w błonę komórkową lub sondą biosensorem, która umożliwia wizualizację F-aktyny w żywych komórkach1.
Erica Andersen, Namrata Asuri i Matthew Clay wnieśli równy wkład w tę pracę.
Protokół
1. Montaż szkiełek do iniekcji i szkiełek do obrazowania
Preparaty do wstrzykiwania:
- Przygotuj elastomer silikonowy Sylgard zgodnie z instrukcją producenta.
- Użyj preparatu Sylgard do połączenia trzech standardowych szkiełek przedmiotowych, nakładając jedno szkiełko na przecięcie dwóch pozostałych, które ułożone są obok siebie długimi krawędziami. Górne szkiełko tworzy kąt prosty lub „ściankę” pomiędzy szkiełkiem górnym a dolnymi.
- Pozostaw Sylgard do zastygnięcia na noc. Tak przygotowane szkiełka mogą być użyte ponownie.
Preparat do obrazowania:
- Używamy prostokątnych płytek ze stali nierdzewnej dociętych do rozmiaru standardowego szkiełka przedmiotowego (75mm X 25mm X 1mm), aby komora pasowała do uchwytu szkiełek na stoliku mikroskopu. Na środku prostokąta wycina się otwór o średnicy 1,5 cm.
- Do metalowego prostokąta przytwierdza się szkiełko nakrywki o powierzchni 2 mm2 za pomocą Sylgardu. Należy użyć takiej ilości Sylgardu, która zapewni szczelne zamknięcie szkiełka nakrywkowe. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego, embriony zostaną zamontowane na tej nakrywce i obrazowane od dołu.
- Sylgard pozostawia się do zastygnięcia przez noc. Płytki te można wykorzystać wielokrotnie; pomiędzy użyciami oczyszcza się je 70% etanolem.
2. Przygotowanie konstruktów DNA
Aby uzyskać ekspresję transgenu w sposób tkankowo specyficzny, klonuje się gen zainteresowania za promotorem specyficznym dla danej komórki. Wykorzystujemy cis-element regulacyjny danio-pręgowanego neurogenina 1 gen (-3,1 ng/ml)2 lub dla sox10 gen (-4,9sox10)3 w celu sterowania ekspresją odpowiednio w neuronach sensorycznych lub komórkach grzebienia neuronalnego. Aby zwizualizować dynamikę komórek i błon, wyrazamy fluorofory cytoplazmatyczne lub zlokalizowane w błonie. W celu obrazowania rozkładu F-aktyny wyrazamy DNA kodujące domenę homologii kalponiny utrofiny połączoną z mCherry (UtrCH-mCherry). Sonda biosensorowa UtrCH-mCherry pozwala na wizualizację F-aktyny bez zakłócania dynamiki aktyny1Konstrukty DNA te generujemy przy użyciu strategii klonowania opartego na rekombinacji Invitrogen Gateway.4 oraz wektory dostarczone w zestawie Tol2kit dla danio przebrzanego5.
- Wygenerować wektor(y) ekspresyjne, wykorzystując technologię Multisite-Gateway oraz wektory z zestawu zebrafish Tol2kit5. Plazmidy zawierają szkielet Tol2 z pT2KXIGDin.
- Oczyścić DNA plazmidowe za pomocą zestawu QIAfilter Plasmid Midi Prep (QIAGEN Inc.) i eluować w sterylnej wodzie. DNA nie wymaga linearyzacji przed iniekcją.
3. Wstrzykiwanie konstruktów DNA
- Rozcieńcz DNA do końcowego stężenia od 10 do 50 μg/ml DNA w wodzie z dodatkiem 0,2% czerwieni fenolowej (w celu wizualizacji podczas wstrzykiwania).
- Napełnij i skalibruj igłę: Napełnij od tyłu dociągniętą igłę kapilarną około 1 μl roztworu DNA i włóż ją do uchwytu igły w aparaturze do mikroiniekcji (stosujemy Picospritzer). Za pomocą precyzyjnej pęsety odłam końcówkę igły tak, aby otwór wierzchołka miał średnicę około 10 μm. Zmierz średnicę kropli w oleju mineralnym za pomocą mikrometru okularowego. Dostosuj ustawienie czasu trwania ciśnienia, aby uzyskać kroplę o objętości około 1 nl.
- Zbierz zarodki w stadium 1 komórki w podłożu dla zarodków E3 (5mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,3mM CaCl2, 0,33mM MgSO4*7H2O, pH 7,0).
- Przenieś około 30-60 zarodków na szkiełko do iniekcji i ustaw je w prawym kącie utworzonym przez górne i dolne szkiełko. Usuń większość podłoża E3, aby zarodki były przytrzymywane do szkiełka przez napięcie powierzchniowe.
- Użyj zgiętej szpilki sekcyjnej, aby obrócić zarodki tak, by komórka przylegała do ścianki szkiełka do iniekcji.
- Za pomocą mikromanipulatora przeprowadź igłę przez chorion zarodka, przez żółtko i do pojedynczej komórki zarodka. Wstrzyknij do komórki 0,5-1 nl roztworu DNA.
- Przenieś zarodki do naczyń Petriego z podłożem E3 i inkubuj w temperaturze 28,5°C. W razie potrzeby rozwój można spowolnić, inkubując zarodki w niższej temperaturze.
4. Montaż embrionów do obrazowania
- Usuń błony chorionowe z embrionów za pomocą precyzyjnej pęsety około godzinę przed osiągnięciem przez embriony pożądanego wieku do obrazowania (w naszym przypadku około 14–17 godzin po zapłodnieniu).
- Wybierz embriony z komórkami znakowanymi, korzystając z mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w moduł fluorescencji. Używamy obiektywu 4X (powiększenie 40X) w mikroskopie Nikon AZ10 ze względu na połączenie długiego dystansu roboczego i dużego powiększenia.
- Umieść zarodek w probówce do mikrowirówki z około 50 μl E3 zawierający 0,2% anestetyku Tricaine (stężenie 10X).
- Dodaj 500 μl 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze E3 z 10 mM HEPES (przechowywany w 42°C), rozcieńczając Tricaine do stężenia końcowego 0,02%.
- Natychmiast przenieść zarodek w kropli agarozy na szkiełko nakrywkowe slajdu do obrazowania, używając szklanej pipety o szerokim wylocie.
- Zanim agaroza stwardnieje, ustaw zarodek tak, aby obszar z oznakowanymi komórkami był skierowany w dół, przylegając do dolnego szkiełka nakrywki (stroną grzbietową dołu w przypadku komórek grzebienia neuronalnego oraz stroną grzbietowo-boczną dołu w przypadku neuronów czuciowych rdzenia kręgowego).
- Montaż komory obrazującej: Jedną stronę plastikowego pierścienia (średnica zewnętrzna 2 cm, wysokość 3 mm) pokryć silikonowym smarem próżniowym i przytwierdzić do metalnego szkiełka do obrazowania. Drugą stronę pierścienia pokryć smarem.
- Napełnić komorę roztworem E3 zawierającym 10 mM HEPES oraz 0,02% trikainy. Uszczelnić górną część komory, mocując 2-milimetrowy2 szkiełko nakrywkę do nasmarowanej tłuszczem górnej powierzchni pierścienia.
5. Obrazowanie 4D zachowań komórkowych przy użyciu konfokalnego mikroskopu Olympus FV10 z mikroskopem IX81
Szczegóły akwizycji obrazów będą zależeć od specyfiki Twojego systemu mikroskopowego. Poniżej opisano proces akwizycji time-lapse dla konfokalnego mikroskopu Olympus FV100. Patrz poprzedni protokół JoVE dotyczący akwizycji time-lapse z wykorzystaniem systemu konfokalnego Zeiss LSM 5106.
- Umieść komorę obrazującą w uchwycie na preparaty na stole mikroskopu i ustaw ostrość na embrion, korzystając z obiektywu 10X lub 20X w świetle przechodzącym.
- Przełącz na obiektyw 60X (N.A. 1,2 lub wyższa) i ustaw ostrość na znakowaną komórkę przy użyciu epifluorescencji. Używamy obiektywu z imersją olejową (UPLSAPO 60xO N.A. 1,35) lub imersją wodną (UPLSAPO 60xW N.A. 1,20).
- W oprogramowaniu FV (Ver 1.7c) kliknij XY repeat, aby rozpocząć skanowanie laserowe.
- Dostosuj ustawienia akwizycji i parametry sterowania obrazowaniem (moc lasera, prędkość skanowania, HV, wzmocnienie oraz poziomy offsetu), aby zoptymalizować sygnał, utrzymując moc lasera na minimalnym poziomie (25% lub mniej), aby zapobiec uszkodzeniu tkanki i ograniczyć fotobielenie.
- Aby uzyskać serię Z, ustaw górną i dolną granicę stosu Z oraz wielkość kroku. Upewnij się, że ikona Depth jest aktywna, tak aby w ikonie XY Sweep podświetlone były wartości XY i Z. Rozpocznij akwizycję, klikając ikonę XYZ Sweep.
- Aby uzyskać serię time-lapse, ustaw interwał czasowy i liczbę punktów czasowych w sekcji TimeScan w oknie Acquisition Settings. Kliknij ikonę Time w oknie Image Acquisition Control, tak aby w ikonie XY Sweep podświetlone były wartości XY(Z) i T. Rozpocznij akwizycję, klikając ikonę XY(Z)T Sweep.
- Alternatywnie do konfiguracji time-lapse można użyć TimeController. Programowanie to jest przydatne przy generowaniu dużych zbiorów danych, ponieważ nie przekracza ono przydzielonej pamięci. W sekcji Device otwórz okno TimeController. Utwórz nowe zadanie obrazowania (Imaging Task). Otworzy się okno parametrów obrazu. Kliknij przycisk FV Status, aby zaktualizować ustawienia akwizycji. Upewnij się, że w sekcji Terminate zaznaczone są opcje Save i Delete. Ustaw nazwę pliku wyjściowego i kliknij OK, aby zapisać ustawienia i zamknąć okno. Użyj funkcji Loop, aby ustawić żądany interwał czasowy i liczbę punktów czasowych. Kliknij Ready i Start, aby rozpocząć akwizycję. Funkcje Pause i Z-shift mogą być wykorzystywane do ponownego ustawienia ostrości podczas obrazowania.
6. Reprezentatywne wyniki
Ryciny i filmy przedstawiają przykłady neuronów sensorycznych oraz komórek grzebienia neuronalnego znakowanych fluoroforami targetowanymi do błony komórkowej lub sondą biosensora aktyny.
Rycina 1. Obrazy konfokalne (projekcje z) a Tg(ngn1:gfp-caax) zarodek transgeniczny wstrzyknięty z 25 pg ngn1:mCherry-caax DNA. mCherry-CAAX znakuje jeden neuron na czerwono (A) na tle, w którym wszystkie neurony sensoryczne Rohona-Bearda są znakowane na zielono (B). C) Złożony obraz obu kanałów, zielonego i czerwonego. Pasek skali = 50 μm.
Rycina 2. Konfokalne projekcje z neuronów w embrionach wstrzykniętych z ilością ~20 pg ngn1:mCherry-UtrCH DNA A) Neuron sensoryczny Rohona-Bearda w embrionie w 16,5 hpf. Sygnał F-aktyny jest silny w stożkach wzrostu (groty strzałek) oraz w wypustkach wzdłuż nowo utworzonych aksonów. B) Neuron w embrionie w 20. godzinie rozwoju (hpf), wykazujący silny sygnał F-aktyny w stożkach wzrostu rozgałęzionego aksonu obwodowego (groty strzałek) oraz słabszy sygnał w bardziej dojrzałych aksonach centralnych (strzałki). Pasek skali = 50 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Optymalne stężenie wstrzykiwanego DNA będzie się różnić w zależności od wielkości i siły konstruktu promotora i powinno zostać określone empirycznie. Wstrzyknięcie zbyt dużej ilości DNA może prowadzić do powstania niezdrowych embrionów z rozległą śmiercią komórek, natomiast zbyt mała ilość spowoduje, że tylko bardzo niewielka część wstrzykniętych embrionów będzie wykazywać ekspresję transgenu. Poziom ekspresji DNA koreluje z siłą sygnału fluoroforu, która różni się między poszczególnymi komórkami. Podczas sortowania embr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejsza praca była finansowana przez NIH R01 NS042228 dla M.C.H. Konfokalny mikroskop Olympus FV1000 został zakupiony dzięki grantowi NIH na wspólną aparaturę S10RR023717 dla Katedry Zoologii UW (PI Bill Bement).
Erica Andersen, Namrata Asuri i Matthew Clay wnieśli równy wkład w tę pracę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Trykaina (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoalanu) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Zestaw do elastomeru silikonowego Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Zestaw QIAfilter Plasmid Midi | Qiagen | 12243 | |
| Agaroza niskotopliwa | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
Bibliografia
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
