Robotyka i dynamiczna analiza obrazu do badań ekspresji genów w tkankach roślinnych

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę wprowadzania, śledzenia i analizy ilościowej ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyki do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również użycie ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Streszczenie

Ekspresja genów w tkankach roślinnych jest zwykle badana przez destrukcyjną ekstrakcję związków z tkanek roślinnych do analiz in vitro. Przedstawione tutaj metody wykorzystują gen białka zielonej fluorescencji (gfp) do ciągłego monitorowania ekspresji genów w tych samych fragmentach tkanek w czasie. Gen gfp umieszczono pod kontrolą regulacyjną różnych promotorów i wprowadzono do tkanek liścieni fasoli poprzez bombardowanie cząstkami. Liścienie zostały następnie umieszczone w zrobotyzowanym systemie zbierania obrazów, który składał się z fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego z kamerą cyfrową i dwuwymiarowej platformy robotycznej zaprojektowanej specjalnie w celu umożliwienia bezpiecznego mocowania naczyń hodowlanych. Obrazy były zbierane z tkanek liścieni co godzinę przez 100 godzin, aby wygenerować profile ekspresji dla każdego promotora. Każda zebrana seria 100 obrazów została najpierw poddana ręcznemu wyrównaniu obrazu za pomocą ImageReady, aby upewnić się, że ogniska wyrażające GFP są konsekwentnie zachowywane w wybranych polach analizy. Określone obszary serii o wymiarach 300 x 400 pikseli zostały następnie wybrane do dalszej analizy, aby zapewnić pomiary intensywności GFP za pomocą oprogramowania ImageJ. Obrazy wsadowe zostały rozdzielone na kanały czerwony, zielony i niebieski, a obszary ekspresji GFP zostały zidentyfikowane za pomocą funkcji progowej ImageJ. Po odjęciu fluorescencji tła (odjęciu wartości szarości pikseli niewyrażających ekspresji od każdego piksela) w odpowiednich kanałach czerwonym i zielonym, intensywność GFP obliczono, mnożąc średnią wartość skali szarości na piksel przez całkowitą liczbę pikseli wyrażających GFP w każdym kanale, a następnie dodając te wartości zarówno dla kanału czerwonego, jak i zielonego. Wartości intensywności GFP zebrano dla wszystkich 100 punktów czasowych, aby uzyskać profile ekspresji. Różnice w profilach ekspresji GFP wynikały z różnic w takich czynnikach, jak siła promotora, obecność supresora wyciszającego lub charakter promotora. Oprócz ilościowego określenia intensywności GFP, serie obrazów wykorzystano również do generowania animacji poklatkowych za pomocą ImageReady. Animacje poklatkowe ujawniły, że zdecydowana większość komórek wykazywała stosunkowo szybki wzrost ekspresji GFP, po którym nastąpił powolny spadek. Niektóre komórki czasami wykazywały nagłą utratę fluorescencji, co może być związane z szybką śmiercią komórki. Zaobserwowano również pozorny transport GFP przez błonę i ścianę komórkową do sąsiednich komórek. Animacje poklatkowe dostarczyły dodatkowych informacji, których nie można było uzyskać za pomocą profili intensywności GFP lub zbiorów obrazów z pojedynczych punktów czasowych.

Protokół

Poniższa metodologia przedstawia protokół analizy obrazu ekspresji genów za pomocą automatycznego systemu zbierania obrazów. Dla ułatwienia wyjaśnienia, ogólne podejście podzielono na cztery etapy: 1) przygotowanie nasion, 2) wprowadzenie genów za pomocą bombardowania cząstkami, 3) zbieranie obrazów przez roboty oraz 4) analiza obrazu. Chociaż ta ogólna metodologia może być wykorzystywana do wielu innych zastosowań, obecne zestawy protokołów opierają się na wykorzystaniu genu białka zielonej fluorescencji (gfp), który jest użytecznym genem reporterowym do śledzenia ekspresji genów w tym samym fragmencie żywej tkanki w czasie.

I. Przygotowanie nasion

1. Nasiona fasoli (Phaseolus lunatus cv. Henderson-Bush) można zakupić lub najlepiej zebrać z roślin uprawianych w komorze wzrostowej (50% wilgotności względnej, 16/8 h jasno: ciemno, 25/23°C dzień/noc). Jakość nasion po zbiorach można utrzymać poprzez przechowywanie nasion w temperaturze -20°C.
2. Przygotuj pojemniki Magenta GA7 do kiełkowania nasion. Złóż bibułę filtracyjną lub ręczniki papierowe, aby zmieściły się na dnie pudełek w kolorze magenta. Dodaj ~25 ml wody dejonizowanej do każdego pojemnika, aby zwilżyć ręczniki papierowe i odlej niewchłoniętą wodę. Autoklaw zwilżonych pudełek zawierających papier przez 20 minut.
3. Używając jednorazowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, sterylizuj nasiona w 10% dostępnym w handlu roztworze wybielacza (20 nasion w 20-40 ml) przez 20 minut, wstrząsając na wytrząsarce żyratorowej przy 60 obr./min.
   Uwaga: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym.
4. Opłucz nasiona 4-7 razy sterylną wodą dejonizowaną z delikatnym mieszaniem przez 30 sekund podczas każdego płukania.
5. Umieść 5-6 sterylnych nasion między warstwami złożonego papieru znajdującymi się w każdym sterylnym pudełku w kolorze magenta.
6. Inkubować nasiona przez 4 dni w następujących warunkach: 25°C, 16/8 h światło:ciemno i 40 ^{μEm-2 s-1}.

II. Wprowadzenie do genu za pomocą bombardowania cząsteczkami

1. Zbuduj konstrukty genów przy użyciu swojego ulubionego wektora ekspresyjnego z genem reporterowym, który można monitorować w żywych tkankach. Zaprojektowaliśmy wektor wyrażenia o wysokiej liczbie kopii, przydatny do analiz elementów promotora i promotora. Wektor ten zawiera gen gfp, który służy do wizualizacji funkcji elementu promotora/promotora w przekształconych tkankach.
2. Na około 1-2 godziny przed bombardowaniem należy wyciąć liścienie fasoli z kiełkujących siewek i usunąć okrywy nasienne. Liścienie nadające się do bombardowania powinny być od żółtego do jasnozielonego, płaskie i wolne od jakichkolwiek uszkodzeń, które mogłyby przeszkadzać w dalszej analizie obrazu.
3. Liścienie należy umieścić na pożywce hodowlanej OMS zawierającej sole MS¹, witaminy B5², 3% sacharozy i 0,2% żelrytu (pH 5,7) natychmiast po wycięciu.
4. Wytrącić konstrukt DNA na cząstkach wolframu M10 (Sylvania, Towanda, PA, USA). Do probówki o pojemności 0,6 ml dodaj 25 μl cząstek wolframu (cząstki są ponownie zawieszane w sterylnej wodzie, 100 mg ^ml-1, bezpośrednio przed użyciem), 5 μl DNA (1 μg ^μl-1), 25 μl 2,5 M chlorku wapnia (Sigma-Aldrich Cat. C3881-500G) i 10 μl 100 mM spermidyny (Sigma Cat. S-2626). Krótko zwirować, aby dokładnie wymieszać wszystkie składniki.
5. Preparat DNA należy inkubować na lodzie przez 5 minut. Następnie usunąć i wyrzucić 50 μl supernatantu.
6. Ponownie zawiesić cząstki pokryte DNA przez wirowanie i natychmiast usunąć podwielokrotność 2 μl. Powtórz ten etap wirowania za każdym razem, gdy podwielokrotność jest usuwana z probówki. Pokryte cząstki należy przechowywać w lodzie i zużyć w ciągu 15 minut.
7. Przez górną część filtra strzykawkowego umieść 2 μl powlekanych cząstek na środku sitka filtra. Umieść jednostkę filtrującą zawierającą powlekane cząstki w jednostce podtrzymującej filtr w komorze pistoletu na cząstki.
8. Umieść liścienie fasoli adaksjalną stroną do góry na przegrodzie i umieść przegrodę w komorze pistoletu na cząstki stałe. Przegroda, która składa się z sitka stopionego na dnie zlewki, służy jako platforma do podtrzymywania tkanek podczas bombardowania.
9. Bombarduj tkanki za pomocą pistoletu na cząstki (w tej metodologii używamy prostego i niedrogiego pistoletu do napływu cząstek³, PIG, zaprojektowanego w naszym laboratorium) w następujący sposób: a) otworzyć zawór prowadzący do próżni w celu opróżnienia komory, b) gdy próżnia osiągnie 760 mm (30 cali) Hg, aktywować elektrozawór i uwolnić hel do napędzania cząstek, c) Po bombardowaniu cząstkami zamknij zawór przewodu podciśnienia i uwolnij podciśnienie za pomocą zaworu wydechowego. Ciśnienie helu używane do przyspieszania cząstek wynosi 50 PSI.
10. Po uwolnieniu próżni otwórz drzwi komory, aby pobrać bombardowane liścienie i włóż liścienie, stroną adaksjalną do góry, do pożywki hodowlanej OMS.
    
    Uwaga: W celu kwantyfikacji i profilowania ekspresji zwykle bombardujemy co najmniej trzy liścienie na każdy konstrukt DNA. Kontrola pozytywna, która jest zwykle konstruktem DNA, który daje dobrze zbadany profil ekspresji genów, jest dołączona jako odniesienie.

III. Automatyczne zbieranie obrazów

1. Włącz lampę rtęciową i odczekaj 30 minut, aż lampa się nagrzeje.
2. Włącz źródła zasilania kamery CCD Spot-RT (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA) oraz sterownika silnika platformy robotycznej, który napędza ruch platformy robotycznej.
3. Ustaw zestaw filtrów do wykrywania GFP (zestaw filtrów GFP2; Ex. 480/40 nm, Em. 510 LP) w mikroskopie preparacyjnym MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Szwajcaria).
4. Wysterylizuj zagęszczone pokrywki szalek Petriego z poliwęglanu, spryskując je 70% etanolem. Specjalistyczne pokrywki, używane do przykrycia podstawy szalki Petriego, zapobiegają kondensacji pary wodnej podczas zbierania obrazu⁴.
5. Umieść płytki z bombardowanymi liścieniami na platformie robotycznej (Arrick Robotics, Hurst, TX, USA) automatycznego systemu zbierania obrazów. Platforma robotyki jest napędzana przez silnik krokowy i składa się ze stołu do mocowania 8 szalek Petriego. Platforma zbudowana jest z poliwęglanu, polipropylenu i aluminium. Płyty są mocowane na miejscu poprzez dokręcenie bocznej dociskowej z tworzywa sztucznego.
6. Otwórz niestandardową aplikację, która steruje zarówno platformą robotyki, jak i akwizycją obrazu. Otwórz także programowy przełącznik sterownika światła białego.
7. W zakładce "ruch silnikowy" kliknij "silnik włączony" i "samochód kempingowy". Po tym, jak oprogramowanie ustawi platformę w pozycji wyjściowej, jesteśmy gotowi do rozpoczęcia wprowadzania pozycji dla każdego liścienia.
8. W zakładce "ruch silnikowy" należy wybrać pierwszą płytę. Platforma umieści środek szalki Petriego pod obiektywem mikroskopu. Za pomocą przycisków przesuwania odległości precyzyjnie ustaw pierwszy liścienie do zebrania obrazu. Przy włączonym kontrolerze światła białego obszar docelowy można obserwować na monitorze komputera, włączając funkcję "trybu na żywo".
9. W przypadku pierwszego liścienia ustaw ostrość i powiększenie (preferowane jest powiększenie 1,6x) za pomocą ręcznych pokręteł na mikroskopie preparacyjnym. Regulacja ostrości dla pozostałych liścieni na tej samej płycie odbywa się za pomocą trzech poziomujących znajdujących się pod każdą płytą, na platformie robotyki.
10. Po ustawieniu obszaru zainteresowania kliknij przycisk "dodaj tę pozycję". Oprogramowanie doda współrzędne tego regionu do pliku harmonogramu pozycji, a platforma powróci do środka płyty.
11. Ustaw pozycje i ostrość dla wszystkich pozostałych liścieni na płytkach za pomocą przycisków przesuwania odległości i ręcznych poziomujących. Po wprowadzeniu wszystkich współrzędnych wszystkich liścieni zapisz współrzędne harmonogramu pozycji.
12. Wprowadź parametry kolekcji obrazów. W zakładce "ustawienia obrazu" wybierz żądany rodzaj światła; biały lub niebieski. Do wykrywania GFP należy używać tylko światła niebieskiego. Wprowadź także ustawienie ekspozycji. Chociaż możemy modyfikować czas ekspozycji niezależnie dla koloru czerwonego, niebieskiego i zielonego, zazwyczaj używamy tych samych ustawień dla dokumentacji fotograficznej GFP (20, 14 i 14 sekund odpowiednio dla kanałów czerwonego, zielonego i niebieskiego), co pozwala nam na bezpośrednie i spójne porównania między różnymi konstruktami DNA.
13. W tej samej zakładce "ustawienia obrazu" określ pusty folder, w którym obrazy będą przechowywane. Każda seria obrazów zostanie zapisana w tym folderze głównym w niezależnych folderach, ponumerowanych sekwencyjnie zgodnie z kolejnością pozycji wprowadzonych dla liścieni.
14. Przejdź do zakładki "kontrola czasu przechwytywania" i ustaw przedział czasowy akwizycji obrazu oraz całkowitą liczbę cykli zbierania obrazów. Obrazy są zwykle zbierane co godzinę przez 100 godzin, generując dobrze zdefiniowane profile ekspresji genów.
15. Akwizycję obrazu należy rozpocząć od kliknięcia przycisku "uruchom harmonogram!" znajdującego się w zakładce "harmonogram pozycji".
16. Pod koniec 100-godzinnego zbierania obrazów przenieś wszystkie obrazy z komputera sterującego robotem na dowolny dysk twardy lub komputer o dużej pojemności w celu dalszej analizy obrazu. Obrazy o wysokiej rozdzielczości (1600 x 1200 pikseli) są zbierane jako pliki TIF o wielkości ~5 Mb każdy.

IV. Analiza obrazu

1. Zbierz 100 sekwencyjnych obrazów z każdego folderu za pomocą programu Adobe ImageReady.
   1. Otwórz ImageReady i zaimportuj wszystkie sekwencyjne obrazy składające się na serię jako klatki.
   2. Zmień rozmiar oryginalnych obrazów na 800 x 600 pikseli. Zebrane obrazy mają wysoką rozdzielczość, co generuje duże pliki, które mogą spowolnić przetwarzanie obrazu.
   3. Przewiń obrazy i znajdź miejsca widoczne na większości obrazów.
   4. Powiększ do 300% wybrane miejsca. Wyrównanie obrazów przy użyciu większego powiększenia pozwala na bardziej precyzyjną rejestrację.
   5. Wstaw warstwę na wszystkich obrazach i upewnij się, że jest widoczna we wszystkich ramkach. Zaznacz położenie miejsca (miejsc) za pomocą narzędzia "pędzel".
   6. Zacznij wyrównywać wszystkie klatki za pomocą narzędzia "przesuń" i weź znaczniki na warstwie jako odniesienie.
   7. Po zakończeniu wyrównywania usuń warstwę używaną jako odniesienie i zapisz obrazy jako pojedynczy plik "psd". Ponadto wyeksportuj wszystkie klatki jako pojedynczy plik "mov" przy użyciu najwyższej rozdzielczości. Ręczne wyrównanie każdej serii zdjęć zajmuje ~10 min.
2. Wykonaj kwantyfikację ekspresji genów za pomocą ImageJ.
   1. Otwórz oprogramowanie ImageJ i otwórz plik "mov" zapisany wcześniej w ImageReady.
   2. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wybierz obszar o wymiarach 400 x 300 pikseli i przytnij obraz. Ten nowy plik powinien być zapisany jako plik "avi".
   3. Podziel sekwencyjne obrazy, znajdujące się w nowym pliku "avi" na kanały czerwony, niebieski i zielony, klikając "obraz", "kolor" i "podział RGB" w ImageJ.
   4. Odejmij fluorescencję tła od wszystkich obrazów w kanałach zielonym i czerwonym. Korzystając z serii obrazów kanału zielonego, wybierz obszar o wymiarach 20 x 20 pikseli z regionu z komórkami bez ekspresji i zapisz jego lokalizację w narzędziu "Menedżer ROI", tak aby ten sam obszar został zaznaczony w obu kanałach. Gdy kwadrat o wymiarach 20 x 20 pikseli jest aktywny w zielonym kanale, przejdź do polecenia "wtyczki" znajdującego się na pasku zadań ImageJ, a następnie kliknij narzędzie wtyczki "odejmij zmierzony zwrot z inwestycji dla każdego wycinka".
   5. W ImageJ kliknij "Obraz", "dostosuj", a następnie "próg", aby zdefiniować lub podzielić piksele wyrażające GFP. Dostosuj poziomy progów, przeciągając pasek w oknie progu, aby uzyskać średni rozmiar plamki 20–30 pikseli.
   6. Określ wyrażenie GFP za pomocą wtyczki, którą zaprojektowaliśmy do pomiaru średniej wartości skali szarości na piksel i całkowitej liczby pikseli wyrażających GFP.
   7. Skopiuj średnie wyjściowe wartości skali szarości do pliku ImageJ i wklej je do programu Microsoft Office Excel. Oblicz wyrażenie GFP dla każdego kanału (czerwonego i zielonego), mnożąc średnią wartość skali szarości na piksel przez całkowitą liczbę pikseli wyrażających GFP dla każdego kanału. Suma wartości wyrażeń dla obu kanałów daje wyrażenie GFP. Wartości mogą być używane do ilustrowania profili ekspresji genów i dokonywania bezpośrednich porównań. Animacje poklatkowe mogą być również generowane za pomocą plików "mov" lub "avi", zapewniając unikalną i przejrzystą wizualizację profilu ekspresji genów.

V. Reprezentatywne wyniki

Opisana tutaj procedura zbierania i analizy obrazów za pomocą robota (Rys. 1) pozwala na uzyskanie dużej ilości danych ilościowych na temat ekspresji genów w krótkim czasie. W przypadku charakterystyki promotora roślinnego przy użyciu genu gfp, metodologia ta jest przydatna nie tylko do tworzenia profili ekspresji przejściowej (ryc. 2), ale także do szczegółowego śledzenia ekspresji GFP w przejściowo i stabilnie przekształconych tkankach roślinnych^5,6. Krótkie animacje poklatkowe generowane na podstawie zebranych obrazów sekwencyjnych są cennym narzędziem do dogłębnych analiz ekspresji genów w czasie w tkankach roślinnych. Metodologia ta ma również duże zastosowanie do oceny czynników, które bezpośrednio wpływają na ekspresję genów. Na przykład przejściowa ekspresja GFP w obecności różnych supresorów wyciszania pochodzenia wirusowego została z powodzeniem zbadana przy użyciu naszego zautomatyzowanego systemu gromadzenia i analizy obrazów^7,8.

Rysunek 1. Procedura analizy obrazu składa się z czterech głównych kroków. (A) Akwizycja serii obrazów za pomocą zrobotyzowanego systemu zbierania obrazów, (B) separacja obrazów na kanały czerwony, niebieski i zielony, (C) segmentacja wyrażających pikseli poprzez dostosowanie poziomów progowych oraz (D) uzyskanie wyników wyjściowych zawierających wartości skali szarości i zliczanie ostrości wyrażające GFP.

Rysunek 2. Wykres przedstawiający różne profile ekspresji przejściowej sterowane przez promotory roślin połączone z gfp. Dane zostały zebrane za pomocą naszego zrobotyzowanego systemu gromadzenia obrazów i przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageReady i ImageJ.

Dyskusja

Wykorzystanie robotyki ma ogromne zastosowanie w różnych aspektach życia człowieka; W szczególności roboty są skutecznie wykorzystywane do wykonywania czynności w niebezpiecznych środowiskach, do automatyzacji żmudnych i złożonych czynności oraz do wykonywania zadań w bardziej precyzyjny sposób. W biologii molekularnej, a w szczególności w analizach ekspresji genów, roboty mogą pomóc nie tylko w śledzeniu cech genów, ale także wzrostu i rozwoju tkanek w czasie. Wiele zjawisk biologicznych zachodzi dynamicznie, co może być trudne do śledzenia za pomocą obserwacji pojedynczych punktów czasowych.

Wykorzystanie genu gfp do badań ekspresji przynosi dodatkowe korzyści w zakresie obserwacji odpowiedzi i wzrostu tkanek. W naszych procedurach eksperymentalnych GFP pozwala nam śledzić ekspresję genów w tym samym fragmencie tkanki w czasie, ponieważ wykrywanie GFP jest nieniszczące. Co więcej, nasza wersja białka GFP jest wystarczająco stabilna, aby umożliwić wykrycie, ale wykazuje również pewien obrót, aby zminimalizować akumulację w tkankach roślinnych, co pozwala nam śledzić zarówno wzrost, jak i spadek ekspresji genów.

Wykorzystaliśmy już nasz zrobotyzowany system gromadzenia i analizy obrazów w szerokim zakresie zastosowań. Przewidujemy duży potencjał dla wielu zastosowań biologicznych, w których pożądane jest dynamiczne zrozumienie zjawiska. Na przykład wzrost i rozwój tkanek roślinnych można śledzić za pomocą naszego systemu, który dostarcza cennych informacji/wglądu w te procesy. Ponadto dynamikę transportu białek za pomocą genów reporterowych, takich jak gfp, można łatwo zobrazować za pomocą animacji poklatkowych. Metodologia opisana w niniejszym raporcie jest technicznie złożona, ale koncepcyjnie prosta. Nasze wyniki są solidne, a nowe zastosowania są stale odkrywane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ImageJ	Software	Narodowe Instytuty Zdrowia		http://rsbweb.nih.gov/ij/