Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Podsumowanie

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Streszczenie

Ekspresję genów w tkankach roślin zazwyczaj bada się poprzez destrukcyjną ekstrakcję związków z tkanek roślinnych w celuin vitroanalizy. Przedstawione tutaj metody wykorzystują zielone białko fluorescencyjne (gfp) gen do ciągłego monitorowania ekspresji genów w tych samych fragmentach tkanek w czasie.gfpgen został poddany kontroli regulacyjnej różnych promotorów i wprowadzony do tkanek kotyledonowych fasoli lima za pomocą bombardowania cząsteczkami. Kotyledony zostały następnie umieszczone w zrobotyzowanym systemie zbierania obrazów, który składał się z fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z kamerą cyfrową oraz dwuwymiarowej platformy robotycznej zaprojektowanej specjalnie w celu zapewnienia bezpiecznego mocowania naczyń hodowlanych. Obrazy tkanek kotyledonowych były gromadzone co godzinę przez 100 godzin w celu wygenerowania profili ekspresji dla każdego promotora. Każda zebrana seria 100 obrazów została najpierw poddana ręcznemu wyrównaniu obrazów za pomocą programu ImageReady, aby upewnić się, że ogniska wykazujące ekspresję GFP były konsekwentnie utrzymywane w wybranych polach analizy. Następnie, do dalszej analizy wybrano konkretne regiony serii o wymiarach 300 x 400 pikseli, aby uzyskać pomiary intensywności GFP przy użyciu oprogramowania ImageJ. Obrazy seryjne zostały rozdzielone na kanały czerwony, zielony i niebieski, a obszary wykazujące ekspresję GFP zidentyfikowano za pomocą funkcji progowania w programie ImageJ. Po odjęciu fluorescencji tła (odjęcie wartości szarości pikseli niewykazujących ekspresji od każdego piksela) w odpowiednich kanałach czerwonym i zielonym, intensywność GFP obliczono poprzez pomnożenie średniej wartości skali szarości na piksel przez całkowitą liczbę pikseli wykazujących ekspresję GFP w każdym kanale, a następnie zsumowanie tych wartości dla kanału czerwonego i zielonego. Wartości intensywności GFP zbierano dla wszystkich 100 punktów czasowych, aby uzyskać profile ekspresji. Zróżnicowanie profili ekspresji GFP wynikało z różnic w czynnikach takich jak siła promotora, obecność supresora wyciszania lub charakter promotora. Oprócz kwantyfikacji intensywności GFP, serie obrazów zostały również wykorzystane do stworzenia animacji time-lapse za pomocą programu ImageReady. Animacje time-lapse wykazały, że zdecydowana większość komórek wykazywała stosunkowo szybki wzrost ekspresji GFP, po którym następował powolny spadek. W niektórych komórkach sporadycznie obserwowano nagłą utratę fluorescencji, co może być związane z szybką śmiercią komórki. Zaobserwowano również pozorny transport GFP przez błonę i ścianę komórkową do sąsiednich komórek. Animacje time-lapse dostarczyły dodatkowych informacji, których nie można było uzyskać za pomocą profili intensywności GFP lub zbierania obrazów w pojedynczych punktach czasowych.

Protokół

Poniższa metodologia przedstawia protokół analizy obrazu ekspresji genów z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu zbierania obrazów. Dla ułatwienia wyjaśnienia ogólne podejście podzielono na cztery etapy: 1) przygotowanie nasion, 2) wprowadzenie genów za pomocą bombardowania cząstkami, 3) robotyczne zbieranie obrazów oraz 4) analiza obrazu. Choć ta ogólna metodologia może być stosowana w szerokim zakresie innych zastosowań, niniejsze zestawy protokołów opierają się na użyciu genu białka zielonego fluorescencyjnego (gfp), który jest użytecznym genem reporterowym do śledzenia ekspresji genów w tym samym fragmencie żywej tkanki w czasie.

I. Przygotowanie nasion

1. Nasiona fasoli limskiej (Phaseolus lunatus cv. Henderson-Bush) można zakupić lub, co jest rozwiązaniem idealnym, zebrać z roślin hodowanych w komorze wzrostowej (względna wilgotność 50%, cykl światła i ciemności 16/8 h, temperatura dzień/noc 25/23°C). Jakość nasion po zbiorach można utrzymać, przechowując je w temperaturze -20°C.
2. Przygotować pojemniki Magenta GA7 do kiełkowania nasion. Złożyć papier filtracyjny lub ręczniki papierowe tak, aby pasowały do dna pudełek Magenta. Do każdego pojemnika dodać ~25 ml wody dejonizowanej w celu nawilżenia ręczników papierowych, a następnie odlać niepochłoniętą wodę. Pudełka z nawilżonym papierem autoklawować przez 20 min.
3. Używając jednorazowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, wysterylizować nasiona w 10% roztworze komercyjnego wybielacza (20 nasion w 20-40 ml) przez 20 min, wstrząsając na wytrząsarce gyratorowej z prędkością 60 rpm.
   Uwaga: Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
4. Płukać nasiona 4-7 razy sterylną wodą dejonizowaną, delikatnie mieszając przez 30 s podczas każdego płukania.
5. Umieścić 5-6 sterylnych nasion pomiędzy warstwami złożonego papieru w każdym sterylnym pudełku Magenta.
6. Inkubować nasiona przez 4 dni w następujących warunkach: 25°C, cykl światła i ciemności 16/8 h oraz natężenie światła 40 μEm^-2 s^-1.

II. Wprowadzanie genów za pomocą bombardowania cząsteczkami

1. Zbuduj konstrukty genowe, używając preferowanego wektora ekspresyjnego z genem reporterowym, który można monitorować w żywych tkankach. Opracowaliśmy wektor ekspresyjny o wysokiej liczbie kopii, użyteczny do analizy promotorów i elementów promotorowych. Wektor ten zawiera gen gfp, który służy do wizualizacji funkcji promotora/elementu promotorowego w transformowanych tkankach.
2. Około 1-2 h przed bombardowaniem wyciąć zawiercie fasoli szerokolistnej z kiełkujących siewek i usunąć łupiny nasion. Zawiercie odpowiednie do bombardowania powinny mieć kolor od żółtego do jasnozielonego, być płaskie i wolne od wszelkich uszkodzeń, które mogłyby zakłócić dalszą analizę obrazu.
3. Bezpośrednio po wycięciu umieścić zawiercie na pożywce OMS zawierającej sole MS¹, witaminy B5², 3% sacharozy i 0,2% Gelrite (pH 5,7).
4. Wytrącić konstrukt DNA na cząstkach wolframu M10 (Sylvania, Towanda, PA, USA). Do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 0,6 ml dodać 25 μl cząsteczek wolframu (cząsteczki resuspenderowane w sterylnej wodzie, 10 mg ml^-1, bezpośrednio przed użyciem), 5 μl DNA (1 μg μl^-1), 25 μl 2,5 M chlorku wapnia (Sigma-Aldrich Kat. C381-50G) oraz 10 μl 10 mM spermidyny (Sigma Kat. S-2626). Krótko wymieszać na wortexie, aby dokładnie połączyć wszystkie składniki.
5. Inkubować preparat DNA na lodzie przez 5 min. Następnie odpiąć i usunąć 50 μl supernatantu.
6. Resuspender pokryte DNA cząsteczki za pomocą wortexa i natychmiast pobrać porcję 2 μl. Powtarzać ten krok wortexowania przy każdym pobraniu porcji z probówki. Pokryte cząsteczki należy przechowywać na lodzie i wykorzystać w ciągu 15 min.
7. Przez górną część filtra strzykawkowego nanieść 2 μl pokrytych cząsteczek na środek siatki filtra. Umieścić jednostkę filtrującą z pokrytymi cząsteczkami w uchwycie filtra wewnątrz komory pistoletu do cząsteczek.
8. Umieścić zawiercie fasoli szerokolistnej stroną adaksjalną do góry na przegrodzie, a następnie umieścić przegrodę w komorze pistoletu do cząsteczek. Przegroda, składająca się z siatki wtopionej w dno zlewki, służy jako platforma do podtrzymywania tkanek podczas bombardowania.
9. Bombardować tkanki za pomocą pistoletu do cząsteczek (w tej metodologii używamy prostego i niedrogiego pistoletu Particle Inflow Gun³, PIG, zaprojektowanego w naszym laboratorium) w następujący sposób: a) otworzyć zawór prowadzący do pompy próżniowej, aby odessać powietrze z komory, b) po osiągnięciu próżni 760 mm (30 in) Hg aktywować solenoid i wypuścić hel, aby napędzić cząsteczki, c) po bombardowaniu cząsteczkami zamknąć zawór linii próżniowej i zwolnić próżnię za pomocą zaworu upustowego. Ciśnienie helu użyte do przyspieszania cząsteczek wynosi 50 PSI.
10. Po zwolnieniu próżni otworzyć drzwi komory, aby wyłowić bombardowane zawiercie i przenieść je, stroną adaksjalną do góry, z powrotem na pożywkę OMS.
    
    Uwaga: Do celów kwantyfikacji i profilowania ekspresji zazwyczaj bombardujemy minimum trzy zawiercia dla każdego konstruktu DNA. Jako punkt odniesienia dołączana jest kontrola pozytywna, która zazwyczaj jest konstruktem DNA dającym dobrze zbadany profil ekspresji genu.

III. Zautomatyzowany pobór obrazów

1. Włącz lampę rtęciową i odczekaj 30 min aż lampa się rozgrzeje.
2. Włącz źródła zasilania dla kamery CCD Spot-RT (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA) oraz sterownika silnika platformy robotycznej, który napędza ruch platformy.
3. Ustaw zestaw filtrów do detekcji GFP (zestaw filtrów GFP2; Ex. 480/40 nm, Em. 510 LP) w mikroskopie stereologicznym MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Switzerland).
4. Sterylizuj pogrubione pokrywki szalek Petriego, spryskując je 70% etanolem. Specjalistyczne pokrywki służące do przykrycia podstawy szalki zapobiegają kondensacji podczas gromadzenia obrazów⁴.
5. Umieść szalki zawierające bombardowane kotyledony na platformie robotycznej (Arrick Robotics, Hurst, TX, USA) zautomatyzowanego systemu gromadzenia obrazów. Platforma robotyczna jest napędzana przez zestaw silników krokowych i składa się ze stołu umożliwiającego zamocowanie 8 szalek Petriego. Platforma jest wykonana z poliwęglanu, polipropylenu i aluminium. Szalki są mocowane w pozycji poprzez dokręcenie bocznej plastikowej śruby ustalającej.
6. Otwórz dedykowaną aplikację programową, która steruje zarówno platformą robotyczną, jak i akwizycją obrazu. Otwórz również przełącznik sterownika światła białego w oprogramowaniu.
7. W zakładce „motor motion” kliknij „motor on” oraz „motor home”. Po zorientowaniu platformy przez oprogramowanie do pozycji domyślnej, można przystąpić do wprowadzania pozycji dla każdego kotyledonu.
8. W zakładce „motor motion” wybierz pierwszą szalkę. Platforma ustawi środek szalki Petriego pod obiektywem mikroskopu. Używając przycisków dystansu ruchu, precyzyjnie ustaw pierwszy kotyledon do gromadzenia obrazu. Przy włączonym sterowniku światła białego obszar docelowy można obserwować na monitorze komputera, uruchamiając funkcję „live mode”.
9. Dla pierwszego kotyledonu ustaw ostrość i powiększenie (preferowane powiększenie 1,6x) za pomocą pokręteł manualnych w mikroskopie stereologicznym. Regulację ostrości dla pozostałych kotyledonów na tej samej szalce wykonuje się za pomocą trzech śrub poziomujących znajdujących się pod każdą szalką na platformie robotycznej.
10. Po ustawieniu obszaru zainteresowania kliknij przycisk „add this position”. Oprogramowanie doda współrzędne tego obszaru do pliku harmonogramu pozycji, a platforma powróci do centrum szalki.
11. Ustaw pozycje i ostrość dla wszystkich pozostałych kotyledonów na szalkach, używając przycisków dystansu ruchu i manualnych śrub poziomujących. Po wprowadzeniu wszystkich współrzędnych wszystkich kotyledonów zapisz współrzędne harmonogramu pozycji.
12. Wprowadź parametry gromadzenia obrazów. W zakładce „image setting” wybierz pożądany rodzaj światła: białe lub niebieskie. Do detekcji GFP należy używać wyłącznie światła niebieskiego. Wprowadź również ustawienia czasu ekspozycji. Chociaż czas ekspozycji można modyfikować niezależnie dla kolorów czerwonego, niebieskiego i zielonego, zazwyczaj stosujemy te same ustawienia dla dokumentacji fotograficznej GFP (odpowiednio 20, 14 i 14 s dla kanałów czerwonego, zielonego i niebieskiego), co pozwala na bezpośrednie i spójne porównania różnych konstruktów DNA.
13. W tej samej zakładce „image setting” określ pusty folder, w którym będą przechowywane obrazy. Każda seria obrazów zostanie zapisana w tym folderze głównym w niezależnych folderach, numerowanych sekwencyjnie zgodnie z kolejnością wprowadzonych pozycji kotyledonów.
14. Przejdź do zakładki „capture time control” i ustaw odstęp czasu akwizycji obrazu oraz całkowitą liczbę cykli gromadzenia obrazów. Obrazy są zazwyczaj gromadzone co godzinę przez 100 h, co pozwala uzyskać dobrze zdefiniowane profile ekspresji genów.
15. Rozpocznij akwizycję obrazu, klikając przycisk „run schedule!” znajdujący się w zakładce „position schedule”.
16. Po zakończeniu 10-godzinnego gromadzenia obrazów przenieś wszystkie pliki z komputera sterującego robotem na dowolny dysk twardy o dużej pojemności lub komputer w celu dalszej analizy obrazu. Obrazy o wysokiej rozdzielczości (160 x 120 pikseli) są gromadzone jako pliki TIF o rozmiarze ok. 5 Mb każdy.

IV. Analiza obrazu

1. Złóż 10 kolejnych obrazów z każdego folderu za pomocą programu Adobe ImageReady.
   1. Otwórz ImageReady i zaimportuj wszystkie kolejne obrazy tworzące serię jako klatki.
   2. Zmień rozmiar oryginalnych obrazów na 80 x 60 pikseli. Zebrane obrazy mają wysoką rozdzielczość, co generuje duże pliki, które mogą spowolnić przetwarzanie obrazu.
   3. Przejrzyj obrazy i znajdź punkt(y) widoczne na większości z nich.
   4. Przybliż wybrany punkt(y) do 30%. Wyrównanie obrazów przy większym powiększeniu pozwala na bardziej precyzyjną rejestrację.
   5. Wstaw warstwę nad wszystkimi obrazami i upewnij się, że jest ona widoczna we wszystkich klatkach. Zaznacz położenie punktu(ów) za pomocą narzędzia „pędzel”.
   6. Zacznij wyrównywać wszystkie klatki za pomocą narzędzia „przesuń”, przyjmując znaczniki na warstwie jako punkt odniesienia.
   7. Po zakończeniu wyrównywania usuń warstwę służącą jako odniesienie i zapisz obrazy jako pojedynczy plik „psd”. Wyeksportuj również wszystkie klatki jako pojedynczy plik „mov” w najwyższej rozdzielczości. Ręczne wyrównywanie każdej serii obrazów zajmuje ok. 10 min.
2. Przeprowadź kwantyfikację ekspresji genów za pomocą programu ImageJ.
   1. Uruchom oprogramowanie ImageJ i otwórz plik „mov” zapisany wcześniej w ImageReady.
   2. Używając narzędzia zaznaczania, wybierz obszar o wymiarach 40 x 30 pikseli i przytnij obraz. Ten nowy plik należy zapisać jako plik „avi”.
   3. Rozdziel kolejne obrazy znajdujące się w nowym pliku „avi” na kanały czerwony, niebieski i zielony, klikając w ImageJ kolejno „image”, „color” i „RGB split”.
   4. Odejmij fluorescencję tła od wszystkich obrazów w kanałach zielonym i czerwonym. Korzystając z serii obrazów w kanale zielonym, wybierz obszar 20 x 20 pikseli w regionie z komórkami niewykazującymi ekspresji i zapisz jego położenie w narzędziu „ROI Manager”, aby ten sam obszar został wybrany w obu kanałach. Przy aktywnym kwadracie 20 x 20 pikseli w kanale zielonym przejdź do polecenia „plugins” na pasku zadań programu ImageJ, a następnie kliknij narzędzie wtyczki „subtract measured ROI for each slice”.
   5. W ImageJ kliknij „Image”, „adjust”, a następnie „threshold”, aby zdefiniować lub segmentować piksele wykazujące ekspresję GFP. Dostosuj poziomy progu, przesuwając suwak w oknie progu, aby uzyskać średnią wielkość punktu wynoszącą 20-30 pikseli.
   6. Określ ekspresję GFP za pomocą wtyczki, którą zaprojektowaliśmy do pomiaru średniej wartości skali szarości na piksel oraz całkowitej liczby pikseli wykazujących ekspresję GFP.
   7. Skopiuj uzyskane średnie wartości skali szarości z ImageJ i wklej je do programu Microsoft Office Excel. Oblicz ekspresję GFP dla każdego kanału (czerwonego i zielonego), mnożąc średnią wartość skali szarości na piksel przez całkowitą liczbę pikseli wykazujących ekspresję GFP dla każdego kanału. Suma wartości ekspresji dla obu kanałów daje całkowitą ekspresję GFP. Wartości te mogą służyć do ilustracji profili ekspresji genów i przeprowadzania bezpośrednich porównań. Pliki „mov” lub „avi” mogą być również wykorzystane do generowania animacji time-lapse, zapewniając unikalną i przejrzystą wizualizację profilu ekspresji genów.

V. Reprezentatywne wyniki

Opisana tutaj procedura robotycznego gromadzenia i analizy obrazów (Rys. 1) umożliwia pozyskanie dużej ilości danych ilościowych dotyczących ekspresji genów w krótkim czasie. W przypadku charakterystyki promotorów roślinnych z wykorzystaniem genu gfp, metodologia ta jest użyteczna nie tylko do tworzenia profili ekspresji przejściowej (Rys. 2), ale także do szczegółowego śledzenia ekspresji GFP w tkankach roślin poddanych transformacji przejściowej i stabilnej^5,6. Krótkie animacje time-lapse, generowane z zebranych sekwencyjnie obrazów, stanowią cenne narzędzie do pogłębionej analizy ekspresji genów w czasie w tkankach roślinnych. Metodologia ta znajduje również szerokie zastosowanie w ocenie czynników bezpośrednio wpływających na ekspresję genów. Na przykład, za pomocą naszego zautomatyzowanego systemu gromadzenia i analizy obrazów pomyślnie zbadano przejściową ekspresję GFP w obecności różnych supresorów wyciszania pochodzenia wirusowego^7,8.

Rycina 1. Procedura analizy obrazów składa się z czterech głównych etapów. (A) Pozyskanie serii obrazów za pomocą robotycznego systemu zbierania obrazów, (B) rozdzielenie obrazów na kanały czerwony, niebieski i zielony, (C) segmentacja pikseli wykazujących ekspresję poprzez dostosowanie poziomów progowych oraz (D) uzyskanie wyników końcowych zawierających wartości w skali szarości oraz liczbę ognisk wykazujących ekspresję GFP.

Rysunek 2. Wykres przedstawiający różne profile ekspresji przejściowej sterowanej przez promotory roślinne połączone z gfpDane zostały zebrane przy użyciu naszego robotycznego systemu akwizycji obrazów, a następnie przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageReady oraz ImageJ.

Dyskusja

Wykorzystanie robotyki znajduje ogromne zastosowanie w różnych aspektach ludzkiego życia; w szczególności roboty są skutecznie wykorzystywane do wykonywania czynności w niebezpiecznych środowiskach, do automatyzacji żmudnych i złożonych działań oraz do realizacji zadań w bardziej precyzyjny sposób. W biologii molekularnej, a konkretnie w analizach ekspresji genów, roboty mogą pomóc w śledzeniu nie tylko cech genów, ale także wzrostu i rozwoju tkanek w czasie. Wiele zjawisk biologicznych zachodzi dynamicznie, co może być trudne do monitorowania przy użyciu obserwacji w pojedynczym punkcie czasowym.

Wykorzystanie genu gfp w badaniach nad ekspresją niesie ze sobą dodatkowe korzyści w obserwacji odpowiedzi i wzrostu tkanek. W naszych procedurach eksperymentalnych GFP pozwala nam śledzić ekspresję genu w tym samym fragmencie tkanki w czasie, ponieważ detekcja GFP jest metodą niedestrukcyjną. Co więcej, zastosowana przez nas wersja białka GFP jest wystarczająco stabilna, aby umożliwić detekcję, ale wykazuje również pewną rotację w celu zminimalizowania akumulacji w tkankach roślinnych, co pozwala nam śledzić zarówno wzrost, jak i spadek ekspresji genu.

Wykorzystaliśmy już nasz robotyczny system gromadzenia i analizy obrazów w szerokim zakresie zastosowań. Przewidujemy wysoki potencjał dla wielu zastosowań biologicznych, w których pożądane jest dynamiczne zrozumienie danego zjawiska. Na przykład wzrost i rozwój tkanek roślinnych mogą być śledzone za pomocą naszego systemu, co dostarcza cennych informacji na temat tych procesów. Ponadto dynamika transportu białek z wykorzystaniem genów reporterowych, takich jak gfp, może być łatwo wizualizowana za pomocą animacji poklatkowych (time-lapse). Metodologia opisana w niniejszym raporcie jest technicznie złożona, lecz koncepcyjnie prosta. Nasze wyniki są wiarygodne, a stale odkrywane są nowe zastosowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ImageJ	Oprogramowanie	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/