Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Podsumowanie

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Streszczenie

Badania nad limfocytami B wykazały, że aktywacja CD40 poprawia ich zdolność do prezentacji antygenu. Po stymulacji interleukiny-4 i ligandu CD40 (CD40L), ludzkie limfocyty B mogą zostać bez trudności namnożone z niewielkich ilości krwi obwodowej w ciągu 14 dni do bardzo dużych ilości wysoko oczyszczonych limfocytów CD40-B (>10⁹komórek na pacjenta) od zdrowych dawców, jak i od pacjentów onkologicznych^1-4Komórki CD40-B wykazują ekspresję istotnych cząsteczek odpowiedzialnych za homing do węzłów chłonnych i mogą przyciągać limfocyty Tin vitro⁵Ponadto wydajnie pobierają, przetwarzają i prezentują antygeny limfocytom T^6,7Wykazano, że komórki CD40-B nie tylko aktywują naiwne, ale również powiększają pulę pamięciowych limfocytów T^8,9W związku z tym komórki B aktywowane przez CD40 (komórki CD40-B) były badane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w immunoterapii komórkowej1,5,10. Aby dalej zbadać, czy komórki CD40-B indukują skuteczną odpowiedź limfocytów T in vivo oraz aby przeanalizować leżący u podstaw ten mechanizm, opracowaliśmy system hodowli komórkowych do generowania mysich komórek B aktywowanych przez CD40. Wykorzystując splenocyty lub oczyszczone komórki B od myszy C57BL/6 do aktywacji CD40, zidentyfikowano następujące optymalne warunki: rozpoczynając od splenocytów myszy C57BL/6 (haplotyp H-2b), limfocyty są oczyszczane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i hodowane wspólnie z komórkami HeLa wykazującymi ekspresję rekombinowanego mysiego ligandu CD40 (tmuCD40L HeLa)¹¹Komórki są przesiewane co 3-4 dni, a kluczowe komponenty, takie jak CD40L, interleukina-4, 2-merkaptoetanol i cyklosporyna A, są uzupełniane. W niniejszym protokole demonstrujemy, jak uzyskać w pełni aktywowane mysie komórki B aktywowane przez CD40 (mCD40B) o fenotypie APC podobnym do ludzkich komórek CD40-B (Ryc. 1a,b). Stymulacja CD40 prowadzi do szybkiego wzrostu i ekspansji wysoce czystych (>90%) komórek B CD19+ w ciągu 14 dni hodowli komórkowej (Ryc. 1c,d). Aby uniknąć kontaminacji komórkami nietransfekowanymi, ekspresja mysiego ligandu CD40 na transfektantach musi być regularnie kontrolowana (Ryc. 2). Mysie komórki B aktywowane przez CD40 mogą być wykorzystywane do badania aktywacji i różnicowania komórek B, a także do badania ich potencjału do pełnienia funkcji APC in vitro i in vivo. Ponadto stanowią one obiecujące narzędzie do opracowania terapeutycznych lub profilaktycznych szczepionek przeciwnowotworowych i pomogą w odpowiedzi na pytania dotyczące bezpieczeństwa i immunogenności tego podejścia.¹²Empty source HTML. No content to translate.

Protokół

Protokół generowania mysich limfocytów B aktywowanych CD40 (mCD40B) ze splenocytów podzielony jest na dwie części: Część A przedstawia przygotowanie komórek HeLa wykazujących ekspresję ligandu CD40 mysiego (tmuCD40L HeLa), które zostaną wykorzystane jako komórki pokarmowe unieruchomione na płytce. Część B opisuje właściwą hodowlę mysich mCD40-B.

A. Przygotowanie komórek karmicielskich (tmuCD40L HeLa)

tmuCD40L HeLa to adherentna ludzka linia komórek nabłonkowych, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki są pasażowane dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowania ich przez okres dłuższy niż 6 tygodni.

1. Usuń stare pożywkę z kultury pierwotnej za pomocą sterylnej pipety i przemyj komórki 10 mL 1x PBS. Po przemyciu odessij PBS.
2. Dodaj 4 mL 1x Trypsyny/EDTA do kolby 75 cm² i inkubuj przez 10-15 minut w 37°C. Delikatnie opukaj kolbę, aby odczepić komórki.
3. Dodaj 10 mL pożywki typu dzikiego i delikatnie zamieszaj, aby zatrzymać trawienie trypsyną.
4. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 50 mL sterylną pipetą i odwiruj komórki przy 265 x g przez 7 minut.
5. Usuń nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL pożywki typu dzikiego. Policz liczbę komórek w aliquocie zawiesiny komórkowej i przygotuj trzy probówki 50 mL z odpowiednią liczbą komórek:
   1. 2.5 x 10⁶ komórek do pasażowania
   2. 0.4 x 10⁶ komórek/dołek do napromieniowania wykorzystywanego do hodowli mysich komórek B CD40
   3. pozostała część do zamrożenia (jeśli jest wymagane).
6. Odwiruj komórki przy 265 x g przez 7 minut.
7. Usuń nadsącz.
   1. Do pasażowania: resuspenduj 2.5 x 10⁶ komórek w 10 mL pożywki selekcyjnej w kolbie do hodowli komórkowej 75 cm² (gęstość komórek 2.5 x 10⁵ komórek/mL) i inkubuj komórki w 37°C z 5 % CO₂. Wykonuj pasaż komórek dwa razy w tygodniu.
   2. Do hodowli mysich komórek B CD40: potrzebne jest 2.4 x 10⁶ komórek na jedną płytkę 6-dołkową. Resuspenduj komórki tmuCD40L HeLa w pożywce typu dzikiego przy gęstości 0.2 x 10⁶ komórek/mL i napromieniuj je dawką 78 Gy. Rozlej 2 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka i inkubuj w 37°C z 5 % CO₂. Użyj przygotowanych płytek do stymulacji komórek B, gdy komórki tmuCD40L HeLa będą przylegać (minimum 4 godziny: sprawdź przyleganie pod mikroskopem; nie czekaj dłużej niż 24 h przed rozpoczęciem stymulacji komórek B). (Kontynuuj z sekcją B).

B. Hodowla mysich limfocytów B CD40

I. Przygotowanie splenocytów do stymulacji CD40 (dzień 0):

Uwaga: przed kontynuacją należy upewnić się, że komórki karmionki przylegają do podłoża. Zawsze należy dodawać świeże roztwory mysiej interleukiny-4, β-merkaptoetanolu i cyklosporyny A do pożywki wzrostowej bezpośrednio przed użyciem.

1. Wykonać sekcję śledziony myszy C57BL/6 (haplotyp H-2b) i wypłukać ją dwukrotnie w 10-20 mL DMEM uzupełnionego Gentamycyną [15μg/mL], przenosząc organ końcówką pipety 10mL z jednej probówki do drugiej. Należy unikać przenoszenia zanieczyszczeń (np. sierści) myszy. Rozdrobić śledzionę, przeciskając ją przez sitko komórkowe (100μm), a następnie wypłukać sitko kolejnymi 10 mL medium. Splenocyty odwirować przy 265 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej, resuspender w 7mL medium do komórek muCD40-B i wyizolować limfocyty za pomocą centryfugacji gęstościowej w Ficollu. W tym celu nanieść komórki na 5 mL Mouse-Pancollu (podgrzanego do temperatury pokojowej) w probówce 15 mL i wirować przy 450 x g przez 30 min bez hamowania w temperaturze pokojowej.
2. Odessać większość górnej warstwy, pozostawiając nienaruszoną warstwę limfocytów na granicy faz. Przenieść warstwę limfocytów do nowej probówki 50 mL, wypłukać raz w 30mL DMEM z Gentamycyną [15μg/mL], wirowując przy 265 x g przez 7 min w celu usunięcia pozostałych komórek. Odrzucić nadsącz i resuspender komórki w 10 mL medium płuczącego mCD40-B. Określić liczbę komórek w alikwocie zawiesiny komórkowej poprzez ich policzenie.
3. Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 265 x g przez 7 minut. Dla płytki 6-dołkowej wymagane jest 5 x 10⁶ komórek/dołek, czyli 30 x 10⁶ komórek na płytkę.
4. Usunąć nadsącz i resuspender limfocyty w stężeniu 1,25 x 10⁶ komórek/mL w medium hodowlanym mCD40-B, świeżo uzupełnionym o 1 U/mL interleukiny-4 jako czynnik wzrostu, 100 μM β-merkaptoetanolu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A w celu zapobiegania namnażaniu się limfocytów T (podane stężenia odnoszą się do jednego mL medium hodowlanego!).
5. Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tmuCD40L HeLa.
6. Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny limfocytów (1,25 x 10⁶ komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
7. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C w atmosferze 5 % CO₂.
8. W 3. dniu przeprowadzić repasaż komórek (kontynuować zgodnie z sekcją II.1.).

II. Subkultura komórek mCD40B (dzień 3, a następnie dwa razy w tygodniu):

1. Zebrać skupiska komórek mCD40B poprzez energiczne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL, a następnie przenieść je do probówki 50 mL.
2. Wirować przy 265 x g przez 7 minut i całkowicie zastąpić nadsącz medium płuczącym mCD40-B. Podczas zliczania liczby komórek w alikwocie, odwirować komórki przy 265 x g przez 7 minut. Resuspendować komórki mCD40B w medium hodowlanym mCD40-B do stężenia 0,75 x 10⁶ komórek/mL.
3. Do medium dodać świeże roztwory mysiej interleukiny-4 w stężeniu 1 U/mL, 100 μM β-merkaptoetanolu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A.
4. Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, która była wcześniej inkubowana z napromieniowanymi komórkami tmuCD40L HeLa.
5. Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny komórek mCD40B (0,75 x 10⁶ komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
6. Inkubować płytki w temperaturze 37°C w atmosferze 5 % CO₂.
7. Ponownie pasażować komórki co 3-4 dni, aby po łącznie 14 dniach uzyskać wysoko oczyszczone mysie limfocyty B aktywowane CD40.

C. Rozwiązywanie problemów: Co zrobić, jeśli komórki CD40-B nie rosną?

1. Czy sprawdzono ekspresję ligandu CD40 w komórkach karmicielskich?
2. Czy unieruchomione na płytce komórki karmicielskie użyte do stymulacji mają więcej niż 24h?
3. Czy występuje zanieczyszczenie mycoplasma?
4. Czy roztwór interleukiny-4 użyty do suplementacji był świeżo rozmrożony i czy posiadał odpowiednią aktywność biologiczną?
5. Czy β-Mercaptoethanol oraz cyklosporyna A zostały dodane w prawidłowym stężeniu?

Rycina 1a.

Rycina 1b.

Rycina 1d.

Rycina 2.

Dyskusja

Modyfikacje niniejszego protokołu są możliwe, zwłaszcza w odniesieniu do pochodzenia stymulatora CD40 oraz rodzaju użytego szczepu myszy, co również pozwala na wydajne generowanie aktywowanych przez CD40 limfocytów B myszy. Ahmadi i wsp. wykazali podobne wyniki dla fibroblastów mysich przetransfekowanych mysim ligandem CD40. W tym kontekście można z pewnością wykluczyć prezentację ksenoantygenu, a intensywne badania dotyczące bezpieczeństwa i toksyczności in vivo nie wykazały oznak stanu zapalnego ani reakcji au...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A. Przygotowanie pożywek:
1. Pożywka dla komórek feeder typu dzikiego
RPMI 1640
L-Glutamina, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
2. Pożywka selekcyjna dla komórek feeder
RPMI 1640
L-Glutamina, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
Hygromycyna B, 0,2 mg/mL
3. Pożywka do płukania mCD40-B
D-MEM
L-Glutamina, 580 μg/mL
Glukoza, 4,5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
4. Pożywka hodowlana mCD40-B
D-MEM
L-Glutamina, 580 μg/mL
Glukoza, 4,5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
MEM, 0,1mM (1x)
FBS, 10%
B. Różne odczynniki:
RPMI 1640	Invitrogen	REF 21875
D-MEM	Invitrogen	REF 41965
PBS Dulbecco’s (10x)	PAA Laboratories	Cat No H15-011
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
FBS	Lonza Inc.	Cat No DE14-802C
Bufor HEPES	PAA Laboratories	Cat No S11-001
MEM NEAA	Invitrogen	REF 11140
Hygromycyna B	PAA Laboratories	Cat No P02-015
Rekombinowana mysia interleukina-4	Immunotools	Cat No 12340045
Cyklosporyna A	Novartis AG	Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsyna/EDTA (10x)	Invitrogen	REF 15400-054
C. Różne materiały:
Sterylne końcówki do pipet	Sarstedt Ltd
Płytka 6-dołkowa	Nalge Nunc international	Cat No 140675
Probówka stożkowa 50 mL	BD Biosciences	Cat No 352070
Flask do hodowli tkankowych	Sarstedt Ltd	Cat No 83.1813.002