Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Podsumowanie

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Streszczenie

Badania nad limfocytami B wykazały, że aktywacja CD40 poprawia ich zdolność do prezentacji antygenu. Po stymulacji interleukiny-4 i ligandu CD40 (CD40L), ludzkie limfocyty B mogą zostać bez trudności namnożone z niewielkich ilości krwi obwodowej w ciągu 14 dni do bardzo dużych ilości wysoko oczyszczonych limfocytów CD40-B (>10⁹komórek na pacjenta) od zdrowych dawców, jak i od pacjentów onkologicznych^1-4Komórki CD40-B wykazują ekspresję istotnych cząsteczek odpowiedzialnych za homing do węzłów chłonnych i mogą przyciągać limfocyty Tin vitro⁵Ponadto wydajnie pobierają, przetwarzają i prezentują antygeny limfocytom T^6,7Wykazano, że komórki CD40-B nie tylko aktywują naiwne, ale również powiększają pulę pamięciowych limfocytów T^8,9W związku z tym komórki B aktywowane przez CD40 (komórki CD40-B) były badane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w immunoterapii komórkowej1,5,10. Aby dalej zbadać, czy komórki CD40-B indukują skuteczną odpowiedź limfocytów T in vivo oraz aby przeanalizować leżący u podstaw ten mechanizm, opracowaliśmy system hodowli komórkowych do generowania mysich komórek B aktywowanych przez CD40. Wykorzystując splenocyty lub oczyszczone komórki B od myszy C57BL/6 do aktywacji CD40, zidentyfikowano następujące optymalne warunki: rozpoczynając od splenocytów myszy C57BL/6 (haplotyp H-2b), limfocyty są oczyszczane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i hodowane wspólnie z komórkami HeLa wykazującymi ekspresję rekombinowanego mysiego ligandu CD40 (tmuCD40L HeLa)¹¹Komórki są przesiewane co 3-4 dni, a kluczowe komponenty, takie jak CD40L, interleukina-4, 2-merkaptoetanol i cyklosporyna A, są uzupełniane. W niniejszym protokole demonstrujemy, jak uzyskać w pełni aktywowane mysie komórki B aktywowane przez CD40 (mCD40B) o fenotypie APC podobnym do ludzkich komórek CD40-B (Ryc. 1a,b). Stymulacja CD40 prowadzi do szybkiego wzrostu i ekspansji wysoce czystych (>90%) komórek B CD19+ w ciągu 14 dni hodowli komórkowej (Ryc. 1c,d). Aby uniknąć kontaminacji komórkami nietransfekowanymi, ekspresja mysiego ligandu CD40 na transfektantach musi być regularnie kontrolowana (Ryc. 2). Mysie komórki B aktywowane przez CD40 mogą być wykorzystywane do badania aktywacji i różnicowania komórek B, a także do badania ich potencjału do pełnienia funkcji APC in vitro i in vivo. Ponadto stanowią one obiecujące narzędzie do opracowania terapeutycznych lub profilaktycznych szczepionek przeciwnowotworowych i pomogą w odpowiedzi na pytania dotyczące bezpieczeństwa i immunogenności tego podejścia.¹²Empty source HTML. No content to translate.

Protokół

Protokół generowania mysich limfocytów B aktywowanych CD40 (mCD40B) ze splenocytów podzielony jest na dwie części: Część A przedstawia przygotowanie komórek HeLa wykazujących ekspresję ligandu CD40 mysiego (tmuCD40L HeLa), które zostaną wykorzystane jako komórki pokarmowe unieruchomione na płytce. Część B opisuje właściwą hodowlę mysich mCD40-B.

A. Przygotowanie komórek karmicielskich (tmuCD40L HeLa)

tmuCD40L HeLa to adherentna ludzka linia komórek nabłonkowych, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki są pasażowane dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowania ich przez okres ....

Dyskusja

Modyfikacje niniejszego protokołu są możliwe, zwłaszcza w odniesieniu do pochodzenia stymulatora CD40 oraz rodzaju użytego szczepu myszy, co również pozwala na wydajne generowanie aktywowanych przez CD40 limfocytów B myszy. Ahmadi i wsp. wykazali podobne wyniki dla fibroblastów mysich przetransfekowanych mysim ligandem CD40. W tym kontekście można z pewnością wykluczyć prezentację ksenoantygenu, a intensywne badania dotyczące bezpieczeństwa i toksyczności in vivo nie wykazały oznak stanu zapalnego ani reakcji au.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A. Przygotowanie pożywek:
1. Pożywka dla komórek feeder typu dzikiego
RPMI 1640
L-Glutamina, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
2. Pożywka selekcyjna dla komórek feeder
RPMI 1640
L-Glutamina, 300 μg/mL
FBS, 10%
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
Hygromycyna B, 0,2 mg/mL
3. Pożywka do płukania mCD40-B
D-MEM
L-Glutamina, 580 μg/mL
Glukoza, 4,5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
4. Pożywka hodowlana mCD40-B
D-MEM
L-Glutamina, 580 μg/mL
Glukoza, 4,5 mg/mL
HEPES, 10 mM
Gentamycyna, 15 μg/mL
MEM, 0,1mM (1x)
FBS, 10%
B. Różne odczynniki:
RPMI 1640	Invitrogen	REF 21875
D-MEM	Invitrogen	REF 41965
PBS Dulbecco’s (10x)	PAA Laboratories	Cat No H15-011
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
FBS	Lonza Inc.	Cat No DE14-802C
Bufor HEPES	PAA Laboratories	Cat No S11-001
MEM NEAA	Invitrogen	REF 11140
Hygromycyna B	PAA Laboratories	Cat No P02-015
Rekombinowana mysia interleukina-4	Immunotools	Cat No 12340045
Cyklosporyna A	Novartis AG	Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsyna/EDTA (10x)	Invitrogen	REF 15400-054
C. Różne materiały:
Sterylne końcówki do pipet	Sarstedt Ltd
Płytka 6-dołkowa	Nalge Nunc international	Cat No 140675
Probówka stożkowa 50 mL	BD Biosciences	Cat No 352070
Flask do hodowli tkankowych	Sarstedt Ltd	Cat No 83.1813.002