Opisano szczegółowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksów naprawy DNA w komórkach Bacillus subtilis.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA w Bacillus subtilis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarówno prokarionty, jak i eukarionty reagują na uszkodzenia DNA poprzez złożony zestaw zmian fizjologicznych. Zmiany w ekspresji genów, redystrybucja istniejących białek oraz montaż nowych kompleksów białkowych mogą być stymulowane przez różnorodne uszkodzenia DNA i niedopasowane pary zasad DNA. Mikroskopia fluorescencyjna służy jako potężne narzędzie eksperymentalne do wizualizacji i kwantyfikacji tych oraz innych odpowiedzi na uszkodzenia DNA, a także do monitorowania stanu replikacji DNA w obrębie złożonej architektury podkomórkowej żywej komórki. Fuzje translacyjne między fluorescencyjnymi białkami reporterowymi a komponentami aparatu replikacji i naprawy DNA były wykorzystywane do określenia sygnałów, które kierują białkami naprawczymi DNA do ich swoistych miejsc uszkodzeń.in vivooraz aby zrozumieć, w jaki sposób białka te są zorganizowane wewnątrz komórek bakteryjnych. Ponadto fuzje transkrypcyjne i translacyjne połączone z promotorami indukowanymi uszkodzeniami DNA pozwoliły ujawnić, które komórki w populacji aktywowały odpowiedzi na stres genotoksyczny. W niniejszym przeglądzie przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania montażu kompleksów naprawy DNA i replikacji DNA w pojedynczych komórkach bakteryjnych. W szczególności praca ta skupia się na obrazowaniu białek naprawy niedopasowań, rekombinacji homologicznej, replikacji DNA oraz białka indukowanego systemem SOS wBacillus subtilisWszystkie opisane tutaj procedury można z łatwością zastosować do obrazowania kompleksów białkowych w różnych gatunkach bakterii.
Protokół
Hodowla kultur komórkowych do mikroskopii
1. Na jeden lub dwa dni przed obrazowaniem przygotuj szczep B. subtilis zawierający białko fuzyjne translacyjne, które chcesz zwizualizować. Konieczne będzie przeprowadzenie próbnych rund kroków 1A i 1B, aby ustalić, które warunki hodowli zapewniają najlepsze obrazy Twojego szczepu. W większości przypadków komórki powinny być obrazowane w fazie wzrostu wykładniczego.
- W przypadku niektórych szczepów B. subtilis (w szczególności szczepów, które rosną słabo ze względu na integrację fuzji translacyjnej między genem zainteresowania a GFP w jego locus endogennym), w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów konieczny jest wstępny wzrost przez dwa dni przed obrazowaniem. Pierwszego dnia należy wysiać metodą smugową badany szczep B. subtilis na agar LB z selektywnym antybiotykiem (lub antybiotykami) i inkubować przez noc w temperaturze 30°C. Drugiego dnia należy zaszczepić 100 μl 0,85% roztworu soli fizjologicznej pojedynczą kolonią i wykonać trzy 10-krotne rozcieńczenia seryjne na płytkach z agarem LB (z antybiotykami selektywnymi), wysiewając po 100 μL każdego rozcieńczenia, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 30°C. Trzeciego dnia należy wybrać płytkę z rozcieńczeniem wykazującym lekki wzrost zlewający się komórek. Lekki wzrost zlewający się na płytce zapewni środowisko wzrostowe zdrowym, rosnącym wykładniczo inokulum startowym, co może przynieść doskonałe wyniki obrazowania (patrz krok 4). Krok ten jest szczególnie przydatny w celu uzyskania najwyższej jakości obrazowania błon z użyciem barwnika FM4-64.
- Inne szczepy B. subtilis można po prostu nanieść za pomocą sterylnego wymazaka na selektywne podłoże agar LB w celu uzyskania pojedynczych kolonii w dniu poprzedzającym obrazowanie i inkubować przez noc w temperaturze 30°C. Następnego dnia komórki z tej płytki będą wystarczające do wykorzystania jako inokulum do obrazowania (patrz krok 4).
UWAGA: W przypadku B. subtilis hodowle nocne w medium płynnym nie są odpowiednie ze względu na połączenie procesów sporulacji i odpowiedzi quorum sensing, co spowoduje wydłużenie fazy lag wzrostu 1.
2. W dniu obrazowania, rano, należy wlać 10 mL pożywki S750 1-3 do sterylnej kolby Erlenmeyera o pojemności 125 mL.
3. Resuspenduj komórki w ilości do 2 mL pożywki S750, pobierając je z płytki z agarem LB z pojedynczymi koloniami lub lekko zlewającymi się komórkami, aby otrzymać szczepionkę.
4. Do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 mL pożywki S750 dodaj odpowiednią ilość inokulum komórkowego w pożywce S750, aby uzyskać kulturę o początkowej gęstości optycznej mierzonej przy 600 nm (OD600) wynoszącej ~0,08 do 0,1. Na tym etapie ważne jest zachowanie co najmniej 10-krotnego stosunku powietrza do pożywki. W związku z tym stosujemy od 10 do 12,5 mL zaszczepionej pożywki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 mL.
5. Inkubować każdą kulturę w temperaturze 30°C do momentu, aż gęstość optyczna OD600 osiągnie wartość ~0,5-0,8. Zaleca się stosowanie wytrząsanych łaźni wodnych z prędkością obrotową od 150 do 200 obr./min. Kultury poddawane działaniu czynników uszkadzających DNA lub indukujących niedopasowania powinny znajdować się we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego o wartości OD600 takiej, aby komórki osiągnęły docelową wartość OD600 po dodatkowym okresie wzrostu wymaganym do przeprowadzenia zabiegu (patrz Tabela 1)
Na przykład 2-aminopuryna wymaga jednej godziny traktowania, zatem kultura traktowana 2-aminopuryną powinna mieć OD600~0,3-0,4, tak aby jedna godzina traktowania/wzrostu doprowadziła do uzyskania OD600~0,5-0,8, kiedy to komórki będą gotowe do obrazowania.
Przygotowanie próbek
1. Pipetuj 300 μl hodowli komórek do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
2. Jeśli planowane jest obrazowanie błon komórkowych, do każdej próbki należy dodać barwnik błonowy FM4-64 (Invitrogen) w rozcieńczeniu 1:1000 z roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/mL. Aby uzyskać pożądany sygnał fluorescencyjny, konieczne może być przeprowadzenie miareczkowania FM4-64. Typowy zakres miareczkowania obejmuje rozcieńczenia 1:100, 1:1000 oraz 1:10 000.
3. Próbki należy pozostawić w temperaturze pokojowej do dziesięciu minut lub do czasu przygotowania preparatu z 1% agarozą w medium Spizizens 1X, zgodnie z opisem poniżej (patrz krok 1 sekcji „przygotowanie preparatu”).
4. Jeśli wymagane jest zagęszczenie komórek, zalecamy ich filtrowanie za pomocą filtra 0,2 μm z wykorzystaniem aparatu próżniowego. Przed wizualizacją komórki można delikatnie wypłukać z powierzchni filtra za pomocą PBS, innego odpowiedniego buforu lub pożywki.
Przygotowanie preparatu
1. Przygotuj 1% agarozę w 1X buforze Spizizens.
Do 45 ml ddH2O dodaj 5 mL 10X roztworu stokowego buforu Spizizens oraz 0,5 g agarozy, a następnie rozpuść w mikrofalówce. Gorąca, stopiona agaroza jest trudna do pipetowania, natomiast agaroza zestalona nie wejdzie do końcówki pipety. Agarozę należy inkubować w łaźni wodnej do osiągnięcia temperatury ~55-65°C, aby można było ją pobrać pipetą bez ryzyka zestalenia się wewnątrz końcówki.
2. Pobierz 20 μl Spizizens z 1% roztopionej agarozy do końcówki pipety. Nanieś pojedynczą kroplę (około 1-2 μL) roztworu agarozy do każdej studzienki szkiełka (używamy szkiełek z 15 studzienkami, patrz Tabela 2), aby utworzyć płytkie podkładki agarowe. Agaroza stężeje natychmiast. Szkiełka muszą być przygotowane bezpośrednio przed naniesieniem komórek. Jeśli podkładki agarowe zostaną pozostawione w temperaturze pokojowej, mogą odwodnić się w ciągu kilku minut i stać się niezdatne do użytku.
Podkładki agarowe powinny być wycentrowane i wypełniać każdą studzienkę, ale mieć minimalną wysokość, aby uniknąć przesunięcia szkiełka coverslip; jeśli krople są zbyt wysokie (przypominają pęcherzyki) lub jeśli próbka rozleje się poza granicę studzienki, należy po prostu oczyścić studzienkę za pomocą chusteczki Kimwipe i nanieść nową podkładkę agarową.
3. Nanieś całą 300 μl próbkę (patrz krok 6) na slajd, rozprowadzając ją na powierzchni każdego podkładu agarozowego. Taka ilość komórek powinna być wystarczająca, aby pokryć każde okienko na slajdzie.
4. Pozostawić preparat z załadowanymi komórkami w temperaturze pokojowej (23°C) przez około dziesięć minut. Krok ten pozwoli komórkom osiąść na podkładce agarozowej, unieruchomić się i przygotować do obrazowania. W zależności od specyficznych potrzeb temperaturę tę może być konieczne zmienić, na przykład podczas przeprowadzania eksperymentów wymagających zmiany temperatury4.
5. Odessaj nadmiar pożywki z każdego dołka, nie usuwając samych wkładów.
6. Nałóż szkiełko zakrywające na preparat, dociskając je mocno i równomiernie, lecz delikatnie, na całej powierzchni szkiełka. Upewnij się, że szkiełko zakrywające przylega do preparatu i nie jest od niego uniesione.
Wizualizacja komórek
1. Odpowiednie będą wiele różnych mikroskopów fluorescencyjnych. Kluczowe jest posiadanie obiektywu imersyjnego 100X. Laboratorium Simmonsa używa:
- Mikroskop Olympus BX61 wyposażony w obiektyw imersyjny 100X do TIRFM o aperturze numerycznej (NA) 1,45
- Chłodzona kamera CCD Hamamatsu ORCAR2
- Źródło światła łukowe metaliczne Lumen 200 (Prior)
- Do detekcji GFP (FITC) zastosowano filtr wzbudzenia 460-500 i emisji 510-560
- Do detekcji FM4-64 (TRITC) zastosowano filtr wzbudzenia 510-560 i emisji 572-648
- Obrazy zarejestrowano przy użyciu programu SlideBook 4.2 (Rysunek 1)
2. Ustaw ostrość na komórki, korzystając ze światła białego.
3. Wykonać obrazowanie, stosując odpowiednie filtry dla każdego fluoroforu.
Reprezentatywne wyniki
Przedstawiono reprezentatywne obrazy (Rysunek 1). Ogniska GFP powinny być wyraźnie zdefiniowane, natomiast barwienie FM4-64 powinno być jasne i klarowne 4-7. Obrazy GFP lub błon mogą zostać poddane pseudokolorowaniu dowolnym kolorem, aby umożliwić prezentację obrazu najwyższej jakości bez utraty jakichkolwiek danych.
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy GFP białek fuzyjnych translacyjnych B. subtilis. Białka GFP przedstawiono na zielono, natomiast barwienie błony FM4-64 na czerwono. Biały pasek skali wskazuje 3 μm. (A) MutS-GFP [odpowiedni genotyp: mutS-gfp (spc), amyE::PspacmutL (cat)] w obecności 600 μg/mL 2-aminopuryny i 1 mM IPTG. Sygnał FM4-64 nie został przedstawiony, aby wyraźniej ukazać ogniska MutS-GFP. (B) MutL-GFP [odpowiedni genotyp: mutL::mutL-GFP (spc)] w obecności 2-aminopuryny. (C) DnaX-GFP [odpowiedni genotyp: dnaX::dnaX-GFP (spc)]. (D) RecA-GFP [odpowiedni genotyp: recA::recA-GFP (spc)] w obecności 20 ng/mL mitomycyny C. (E) TagC-GFP [odpowiedni genotyp: tagC::tagC-GFP (spc)] w obecności 1 μg/mL mitomycyny C.
| Metoda traktowania / stężenie lub ilość | Funkcja | Czas inkubacji |
| Mitomycyna C (MMC) [20–150 ng/ml] | Agent alkilujący DNA | 1 godzina |
| 2-aminopuryna (2-AP) [600 μg/mL] | indukujący niedopasowania | 1 godzina |
| Hydroksymocznik (HU) | wyczerpuje dNTP | 3 godziny |
| światło ultrafioletowe (UV) 20 J/m2 | Dimery tymina-tymina i fotoprodukty 6-4 | zależne od źródła, zazwyczaj 20 sekund |
| greje (promieniowanie jonizujące) od 5 do 100 Gy | Pęknięcia dwuniciowe, pęknięcia jednoniciowe i miejsca uszkodzeń zasad | zależy od źródła |
Tabela 1. Podsumowanie zabiegów uszkadzających DNA i indukujących niedopasowania
| Nazwa odczynnika | Firma | Numer katalogowy | Uwagi (opcjonalnie) |
| Slajd wielotestowy, 15-dołkowy | MP Biomedicals | 6041505E | |
| Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu | Fisher | 12-544-B | |
| Agaroza | Fisher | BP160-500 | |
| Mitomycyna C | Sigma | M0503-2MG | mutagen, używać rękawiczek |
| 2-aminopuryna | Sigma | A3509-250MG | rękawiczki |
| Hydroksymocznik | Sigma | H8627-25G | rękawiczki |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | wrażliwy na światło |
Tabela 2. Lista specyficznych odczynników i sprzętu:
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby uzyskać obrazy najwyższej jakości dla każdego szczepu, konieczne jest przeprowadzenie prób i błędów w celu znalezienia odpowiednich warunków ekspozycji; ustaliliśmy, że czas 1 milisekundy jest odpowiedni dla obrazów w świetle białym, natomiast czasy ekspozycji od 100 do 2000 ms są odpowiednie dla obrazów GFP (FITC) i FM4-64 (TRITC). Czas ekspozycji będzie się różnić w zależności od użytego sprzętu obrazującego. Dla najprostszej analizy zalecamy stosowanie jednego szczepu na szkiełko mikroskopowe z 15 dołkami, poniewa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować dr Philinie S. Lee oraz dr Alanowi D. Grossmanowi za wstępne przeszkolenie L.A.S. w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej. Autorzy dziękują również dr Melanie Berkmen oraz dr Hajime Kobayashi za pomoc i wskazówki dotyczące obrazowania. Praca ta była finansowana ze środków startowych College of Literature, Science & Arts oraz Departamentu Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej na Uniwersytecie Michigan.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Specyficzne receptury roztworów1: | |||
| 10x S750 sole 0,5 M MOPS 100 mM siarczan amonu 50 mM fosforan potasu jednodobazowy Przefiltrować przez sterylizator i zawinąć S750 pożywki owinięte folią przed przechowywaniem | |||
| 100x Metale 0,2 M MgCl22 70 mM CaCl22 5 mM MnCl22 0,1 mM ZnCl22 100 μg/ml NaCl tiaminy 2 mM HCl 0,5 mM FeCl33* dH2O2O to objętość końcowa FeCl₃3 należy dodać na samym końcu, aby zapobiec wytrąceniu. Po sterylizacji przez filtr owinąć roztwór Metal 100x folią. | |||
| S750 pożywki 1x S750 sole 1x Metal 1% glukozy 0,1% glutaminianu 40 μg/ml tryptofanu 40 μg/ml fenyloalaniny destylowana H2O2O to objętość końcowa | |||
| 10x Spizizens (g/L) 151,4 mM siarczanu amonu (20 g/L) 803,8 mM fosforan potasu jednododatkowy (140 g/L) 440,9 mM fosforan potasu dwuzasadowy (60 g/L) 34,0 mM cytrynian sodu (10 g/L) 16,6 mM MgSO44 (2 g/L) dH2O2O to objętość końcowa Sterylizować przez filtrowanie |
Bibliografia
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
