W niniejszej pracy opisujemy szczegółową metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów tkanki dróg oddechowych człowieka, w tym ich różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Metoda ta zapewnia obfite źródło pierwotnych komórek do badania roli nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobach ludzkich płuc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie komórki nabłonka oskrzelowego są niezbędne do tworzenia modeli komórkowych chorób oraz do badania wpływu substancji pomocniczych i środków farmakologicznych na funkcję i strukturę ludzkich komórek nabłonkowych. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy metodę hodowli komórek nabłonka oskrzelowego z tkanki dróg oddechowych oskrzeli, pobranej przez chirurga podczas operacji płuc (np. w przypadku raka płuca lub operacji redukcji objętości płuc). Po uzyskaniu zgody komisji etycznej oraz świadomej zgody pacjenta, chirurg pobiera materiał niezbędny do badań patomorfologicznych i przekazuje nam fragment oskrzela oddalony od obszarów objętych chorobą. Tkanka ta służy następnie jako źródło eksplantów, które można wykorzystać do hodowli pierwotnych komórek nabłonka oskrzelowego. Segmenty oskrzeli o długości około 0,5-1 cm i średnicy ≤1 cm płucze się zimnym EBSS, a następnie usuwa nadmiar tkanki miąższowej. Segmenty są rozcinane i siekane na kawałki o wielkości 2-3 mm3fragmenty tkanki. Fragmenty te służą jako źródło pierwotnych komórek. Po pokryciu płytek hodowlanych 100 mm przez 1-2 h kombinacją kolagenu (30 μg/ml), fibronektyny (10 μg/ml) i BSA (10 μg/ml), na płytkach wykonuje się zadrapania w 4-5 obszarach, w których umieszcza się fragmenty tkanki, a następnie dodaje pożywkę hodowlaną (DMEM/Ham F-12 z dodatkami) odpowiednią do wzrostu komórek nabłonkowych i umieszcza płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% CO22nawilżone powietrze. Pożywkę hodowlaną wymienia się co 3-4 dni. Komórki nabłonkowe wyrastają z fragmentów tkanek, tworząc pierścienie o średnicy około 1,5 cm w ciągu 3-4 tygodni. Eksplanty można wykorzystać do 6 razy, przenosząc je do nowych, uprzednio powlekanych płytek. Komórki są odrywane za pomocą trypsyny/EDTA, łączone, liczone i ponownie wysiewane do kolb T75 Cell Bind w celu zwiększenia ich liczebności. Kolby T75 zasiane 2-3 milionami komórek osiągają 80% konfluencji w ciągu 4 tygodni. Namnożone pierwotne ludzkie komórki nabłonkowe mogą być hodowane i poddawane różnicowaniu na granicy faz powietrze-ciecz. Opisane tutaj metody zapewniają obfite źródło ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego z tkanek świeżo wyizolowanych i umożliwiają badanie tych komórek jako modeli chorób oraz w badaniach farmakologicznych i toksykologicznych.
Protokół
Ludzkie segmenty oskrzeli stanowią obfite źródło pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli. W niniejszym artykule opisujemy protokół hodowli i ekspansji ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE) pochodzących ze świeżo wyizolowanych ludzkich segmentów oskrzeli. Protokół ten składa się z pięciu sekcji:
- Powlekanie i drapanie płytek hodowlanych 100 mm
- Przygotowywanie eksplantów tkanki oskrzelowej
- Przeszczepy tkanki oskrzelowej
- Pasażowanie komórek HBE
- Hodowla rzęskowych komórek HBE na wkładkach Transwell
Przed rozpoczęciem Należy pamiętać, że WSZYSTKIE ETAPY WYKONUJE SIĘ W KOMORZE BEZPIECZEŃSTWA BIOLOGICZNEGO (BSC), CHYBA ŻE PODANO INACZEJ. Prosimy upewnić się, że dysponują Państwo wszystkimi materiałami niezbędnymi do przeprowadzenia tej procedury. Prosimy przeczytać sekcję Materiały, Odczynniki i Przygotowanie i upewnić się, że w warunkach aseptycznych (tj. w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub BSC) przygotowano następujące elementy:
Roztwór roboczy do powlekania: fibonektyna (10 μg/ml), BSA (10 μg/ml) i kolagen (30 μg/ml) w zrównoważonym roztworze soli Earle'a (EBSS, sterylnym).
Pożywka hodowlana: DMEM/Ham F-12 z dodatkami, antybiotyk-antymykotyk (1%) i FBS (1%)
Roztwory do dysocjacji: roztwór roboczy Trypsyny/EDTA oraz DMEM/F-12 z FBS (10%)
1. Powlekanie i drapanie płytek hodowlanych 100 mm: Eksplanty zostaną wysiane na płytkach hodowlanych 100 mm. Należy rozpocząć od powlekania płytek hodowlanych 100 mm roztworem powlekającym. Czynność tę należy przeprowadzić w BSC, zachowując pełną sterylność.
- Umieść sterylne szalki hodowlane 100 mm oraz roztwór do powlekania (kolagen/fibronektyna/BSA) w BSC.
- Pipetuj 2,0 ml roztworu do powlekania do szalki 100 mm.
- Zamieszaj kolistym ruchem, aby pokryć dno szalki. Upewnij się, że roztwór do powlekania równomiernie pokrywa dno szalki.
- Odpipetuj pozostały roztwór i wykorzystaj go do powlekania drugiej szalki 100 mm. Powtórz czynność dla tylu szalek, ile jest wymaganych. Liczba potrzebnych szalek zależy od liczby eksplantów tkankowych.
- Upewnij się, że roztwór do powlekania równomiernie pokrywa dna szalek, zgodnie z demonstracją.
- Przykryj szalki pokrywkami. Pozostaw szalki do wyschnięcia w inkubatorze przez 1-2 godziny i odessaj nadmiar roztworu przed użyciem do eksplantów tkanki oskrzelowej. Nieużywane powlekane szalki hodowlane można umieścić w sterylnym worku, zamknąć i przechowywać w temperaturze 4°C do późniejszego użycia (mogą być przechowywane w lodówce do miesiąca). Przed użyciem doprowadź do temperatury pokojowej.
- Spryskaj czyste małe ostre nożyczki, skalpel i pęsetę 70% etanolem i wprowadź do BSC. Zadrap powlekane szalki, mocno naciskając skalpelem, aby utworzyć głębokie małe znaki X (co najmniej 4). Jeśli zadrapania nie będą wystarczająco głębokie, fragmenty tkanki nie osiądą w zagłębieniach i będą pływać.
2. Przygotowanie eksplantatów tkanki oskrzelowej
Należy użyć tkanki oskrzelowej pobranej w ciągu 24–36 godzin po operacji. Tkankę należy przechowywać w lodzie w roztworze EBSS do momentu użycia.
- Poza komorą BSC: Umieścić tkankę w szalce Petriego. Dokładnie wypłukać wyizolowane próbki ludzkiej tkanki oskrzelowej w EBSS.
- Wyciąć nadmiar otaczającej tkanki.
- Rozciąć fragmenty oskrzeli.
- Przenieść tkankę do komory BSC i umieścić w sterylnej 100mm płytce hodowlanej z zimnym DMEM/HamF12 + 1% antybiotyk/antymykotyk.
- Za pomocą ostrych, małych nożyczek pociąć tkankę na fragmenty o wielkości 2-3 mm3.
- Za pomocą pęsety umieścić jeden fragment pociętej tkanki w centrum każdego X i delikatnie docisnąć.
- Pozostawić fragmenty tkanki (eksplanty) do przywierania do płytki przez kilka sekund, a następnie delikatnie dodać 10ml pełnej pożywki (DMEM/HamF12 + dodatki + 1% antybiotyk/antymykotyk + 1%FBS). Jeśli po dodaniu pożywki tkanka pływa, należy użyć pęsety, aby docisnąć ją do krawędzi X lub wykonać nowe X. Może być konieczne wykonanie nowych X, jeśli nacięcia nie są wystarczająco głębokie.
- Umieścić płytki w inkubatorze i wymieniać pożywkę co 3-4 dni.
- Tkanki są gotowe do transplantacji, gdy wokół eksplantów wyrośnie wystarczająca liczba komórek nabłonkowych, aby pokryć obszary o wielkości 1-2cm. Trwa to około 4 tygodni.
3. Przeszczepy tkanki oskrzelowej
- Należy użyć powlekanych i porysowanych płytek 100mm. Ponieważ niektóre eksplanty tkankowe mogą nie przetrwać, liczba płytek zależy od liczby przenoszonych fragmentów tkanki. W przypadku korzystania z płytek, które zostały uprzednio powleczone i przechowywane w temperaturze 4°C, należy doprowadzić je do temperatury pokojowej przed użyciem.
- Za pomocą pęsety ostrożnie pobierz tkankę z płytki wyjściowej, umieść ją w centrum X s na nowej płytce i delikatnie dociśnij. Tkanki bez przerostu należy odrzucić.
- Pozostaw tkankę na płytce na kilka sekund, aby przylgnęła, dodaj pożywkę i inkubuj zgodnie z opisem dla eksplantów podanym wcześniej (2.7-2.9).
4. Pasażowanie ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE)
- Odmrozić 2 ml roztworu zapasowego Trypsyny/EDTA na każdą płytkę hodowlaną 100 mm. Rozcieńczyć roztwór zapasowy w 6 ml sterylnego 0,01 M PBS (tj. dodać 2 ml roztworu zapasowego do 6 ml PBS; końcowe stężenie trypsyny wynosi 250 μg/ml, a EDTA 100 μg/ml).
- Po przeniesieniu eksplantów na nową płytkę, odessać medium z płytek z pierścieniami komórek o szerokości 1-2 cm.
- Dodać 8 ml ogrzanego, rozcieńczonego roztworu Trypsyny/EDTA do każdej płytki 100 mm i umieścić w inkubatorze (37°C) na 3-15 minut. Kontrolować proces często, ponieważ zbyt długie działanie trypsyny uszkodzi komórki.
- Sprawdzić płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek została oderwana. Komórki powinny ulec zaokrągleniu i odkleić się, jak pokazano na obrazach.
- Dodać 8 ml ogrzanego 10% FBS w medium na każdą płytkę, aby inaktywować roztwór trypsyny/EDTA.
- Połączyć objętości ze wszystkich płytek w jednej probówce (lub w osobnych probówkach w przypadku różnych tkanek). Policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
- Wirować przy 100g przez 5 minut. Na dnie probówki utworzy się pellet komórkowy.
- Resuspendować pellet komórkowy w pełnym medium (DMEM/Ham F12 + wszystkie dodatki + 1% antybiotyk-antymykotyk + 1% FBS) do pożądanej koncentracji komórek.
- Przenieść po 2-3 miliony komórek do każdej flaski T75 i dodać pełne medium zgodnie z potrzebami. Inkubować i wymieniać medium co 3-4 tygodnie. Komórki w flaskach T75 osiągają stan subkonfluencji (80-90%) w około 4 tygodnie. Komórki należy odkleić i namnożyć lub wykorzystać w fazie subkonfluencji, aby zapobiec starzeniu się (senescencji).
5. Hodowla rzęskowatych ludzkich komórek nabłonka oskrzela (HBE) na wkładkach Transwell.
Pierwotne komórki nabłonkowe hodowane z eksplantów/przeszczepów tkankowych mogą być pasażowane do trzech razy, a następnie wykorzystane. Zaleca się gęstość wysiewu od 50 000 do 100 000 komórek na cm2 1,2. Wyższa gęstość sprzyja szybszej dyferencjacji.
Uwaga: Przygotować zawiesinę komórek i zmierzyć ich liczbę. Ponownie zawiesić w medium hodowlanym w stężeniu 1 milion komórek na 2ml.
- Rozpocznij od przygotowania przepuszczalnych membran transwelli poprzez wstępną inkubację wkładów do hodowli komórkowej w pożywce (DMEM/Ham F12) przed użyciem. Krok ten jest niezbędny w przypadku tych wrażliwych komórek i pomoże w ich adhezji.
- Użyj wkładów o średnicy 6,5 mm, które pasują do płytek wielodołkowych 24-dołkowych.
- Dodaj pożywkę po obu stronach membrany (dla wkładów 6,5 mm użyj 0,6 ml na dole i 0,1 ml na górze). Inkubuj przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowej.
- Ostrożnie usuń (odessij) pożywkę z obu stron membrany, zaczynając od objętości bazalnej.
Ostrożnie oznacza: membrana może zostać łatwo uszkodzona, dlatego pipetuj pożywkę po ściance wkładu hodowlanego, stosując zalecaną objętość. Niedostosowanie się do tej zasady spowoduje wyciek pożywki do innych dołków.
- Wysiew komórek po wstępnej inkubacji podłoża przepuszczalnego
- Ostrożnie pipetuj zawiesinę komórkową na stronę apikalną membrany: dla dołków 6,5 mm dodaj 0,1 ml zawiesiny komórkowej (tj. 50 000 komórek) na stronę apikalną membrany.
- Pipetuj 0,6 ml pożywki na stronę bazalną membrany.
- Dokarmiaj komórki od strony apikalnej i bazalnej przez 10 dni, aby uzyskać dobrze zróżnicowaną kulturę: wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, stosując zaprezentowaną metodę:
- Najpierw usuń objętość bazalną
- Wymień objętość apikalną (0,1 ml pożywki)
- Dodaj 0,6 ml pożywki na stronę bazalną membrany.
Metoda ta sprzyja adhezji komórek do membrany i zapobiega ich długotrwałej ekspozycji na powietrze (wymieniaj pożywki szybko i bezzwłocznie umieszczaj wkład w inkubatorze). - W 10. dniu stwórz interfejs powietrze-ciecz (ALI) poprzez usunięcie pożywki apikalnej, a następnie wymianę 0,6 ml pożywki po stronie bazalnej membrany.
- Utrzymuj komórki w warunkach ALI przez 6 tygodni, zmieniając pożywki dwa razy w tygodniu. Komórki rzęsione zaczną pojawiać się 4 tygodnie po utworzeniu ALI. Jednorodne zróżnicowanie w komórki rzęsione zostanie osiągnięte 6 tygodni po utworzeniu ALI.
Przygotowanie materiałów:
1. Przygotowanie roztworu do powlekania (wykonać w BSC):
Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli dobrze rosną na powierzchniach pokrytych fibonektyną/BSA/kolagenem 3. Roztwór zapasowy do pokrywania jest stosowany do płytek hodowlanych 100 mm w przypadku hodowli eksplantów i transplantów, zgodnie z powyższym opisem. Roztwór do pokrywania można również wykorzystać do pokrywania szkiełek podstawkowych w celu przyspieszenia adhezji komórek, które następnie mogą zostać wykorzystane w eksperymentach z immunobarwienia.
- Fibronektyna (roztwór stokowy 1mg/ml): użyć F2006-2mg od Sigma. Rozpuścić 2mg w 2mls sterylnego zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS, Sigma 28888), przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Przechowywać 1ml w zamrażarce w temperaturze -20°C do późniejszego użycia, a 1ml wykorzystać do przygotowania 100 mls roztworu do powlekania.
- BSA (roztwór stokowy 1mg/ml): użyć Sigma A4919-1g. Odważyć 20 mg BSA i rozpuścić w 20 mls sterylnego EBSS, przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm w BSC. Rozdzielić do fiolek 1ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do czasu użycia. Użyć 1ml roztworu stokowego do przygotowania 100mls roztworu do powlekania.
- Roztwór stokowy kolagenu (dostarczany jako 0,1% lub 1mg/ml od Sigma C8919). Uwaga: otwierać wyłącznie w BSC i szczelnie zamknąć przed odstawieniem do lodówki. Użyć 3 ml roztworu stokowego do przygotowania 100 ml roztworu do powlekania.
- Roztwór stokowy do powlekania: W BSC: dodać 3mls kolagenu (1mg/ml) do 1ml fibronektyny (1mg/ml) i 1ml BSA (1mg/ml), a następnie dodać 95 mls EBSS (sterylnego). Dobrze wymieszać, rozdzielić do fiolek 2 ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do czasu użycia. Końcowe stężenia w roztworze stokowym do powlekania: fibronektyna (10 μg/ml), BSA (10 μg/ml) i kolagen (30 μg/ml) w EBSS.
2. Przygotowanie pożywki hodowlanej (przygotować w BSC): Pożywka składa się z DMEM/Ham F-12 firmy Sigma z ekstraktem z przysadki bydlęcej (15 μg/ml) i epidermalnym czynnikiem wzrostu (10 ng/ml) oraz innymi dodatkami wskazanymi poniżej. Antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy (1%) oraz FBS (1%) dodaje się na świeżo przy każdej wymianie pożywki hodowlanej. Skład tej pożywki został opracowany na podstawie przeglądu wielu metod opisujących hodowle komórek nabłonka dróg oddechowych 3-9. Nasza pożywka jest przeznaczona do optymalnego wzrostu ludzkich komórek nabłonka oskrzeli.
- Ekstrakt z przysadki bydlęcej (roztwór zapasowy BPE 1mg/ml): Sigma P1476 (2,5 ml sterylnego i filtrowanego roztworu BPE o stężeniu 14mg/ml): Rozcieńczyć 2,5 ml roztworu zapasowego (14mg/ml) do stężenia końcowego 1mg/ml, tj. dodać 2,5 ml roztworu zapasowego BPE do 32,5 ml sterylnego EBSS, aby uzyskać roztwór zapasowy 1mg/ml. Podzielić na aliquoty po 7,5 ml (4 probówki po 7,5 ml oraz jedna probówka 5 ml). Po rozcieńczeniu przechowywać aliquoty w temperaturze -20°C do momentu użycia. Nie zaleca się długotrwałego przechowywania zrekonstytuowanego produktu ani wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
- Epidermalny czynnik wzrostu (roztwór zapasowy EGF 10 μg/ml): Sigma E9644-0.2mg. Zrekonstytuować zawartość (0,2mg) w 20 ml filtrowanego przez filtr 0,2 μm 10 mM kwasu octowego zawierającego 0,1% BSA (tj. rozpuścić 20 mg BSA w 20 ml 10 mM kwasu octowego, przefiltrować, a następnie użyć do rekonstytucji EGF). Podzielić na aliquoty po 0,5 ml i przechowywać w zamrażarce -20°C. Używać 100μl na 100 ml medium.
- Epinefryna (roztwór zapasowy 5mg/ml): Sigma E1635. Rozpuścić 10mg w 2ml filtrowanego 1M kwasu solnego (HCl), podzielić na fiolki po 50 μl i zamrozić (-20°C).
- Insulina (roztwór zapasowy 2mg/ml): Sigma I6634 50mg. Rozpuścić 50mg w 25ml filtrowanego (filtr 0,2μm) rozcieńczonego HCl (1mM). Podzielić na fiolki po 1,25ml.
- Transferyna ludzka (roztwór zapasowy 50 mg/ml): Sigma T8158 100mg. Rozpuścić 100mg w 2ml DH20 (filtrowanego przez filtr 0,2 μm). Podzielić na aliquoty po 100μl każda (w fiolkach 0,5ml).
- Trijodotyronina L (roztwór zapasowy 1mg/ml): Sigma T6397 100mg. Rozpuścić 100mg w 100ml filtrowanego 1M HCl. Podzielić na aliquoty po 1ml. Następnie podzielić 0,5ml na aliquoty po 10μl.
- Hydrokortyzon (roztwór zapasowy 5mg/ml): Sigma H0888. Odważyć 100mg i rozpuścić w 20ml filtrowanego etanolu, aby uzyskać roztwór zapasowy 5mg/ml. Podzielić na fiolki po 1ml. Podzielić 1ml (5mg/ml) na aliquoty po 50μl (fiolki 0,5ml).
- Kwas retinowy (roztwór zapasowy 1mg/ml, rozcieńczany do 0,01mg/ml podczas użycia): Sigma R2625 100mg). Rozpuścić 100mg w 10ml etanolu. Podzielić na aliquoty po 1,0ml. Podzielić fiolkę (1ml) na 50 probówek po 20μl każda. Zamrozić w -20°C. W razie potrzeby pobrać jedną fiolkę 20μl i rozcieńczyć do 2000μl medium, aby uzyskać stężenie 0,01mg/ml.
- Roztwór albuminy z surowicy bydlęcej, filtrowany sterylnie, przetestowany w hodowlach komórkowych: Sigma A8412. Przechowywać roztwór w chłodni (4°C) do momentu użycia. Otwierać wyłącznie w BSC.
- Antybiotyk-Antymykotyk, Sigma A5955: podzielić na objętości 1ml i zamrozić w -20°C do momentu użycia. Stosować w końcowym stężeniu 1% w medium.
- FBS, Sigma F1015: Inaktywować FBS w temperaturze 50°C przez 30 minut. Pozostawić do ostygnięcia w BSC. Podzielić na sterylne fiolki 1ml i 10ml. Stosować w końcowym stężeniu 1% w medium hodowlanym oraz w końcowym stężeniu 10% w medium do neutralizacji roztworu Trypsyny/EDTA.
- Przygotowanie medium hodowlanego:
Do 500 ml medium DMEM/HamF12 użyć:- 1 probówki BPE (każda 7,5ml o stężeniu 1mg/ml), aby uzyskać stężenie końcowe 15μg/ml.
- 1 probówki EGF (0,5ml o stężeniu 10μg/ml), aby uzyskać stężenie końcowe 10ng/ml.
- 1 probówki epinefryny (50μl o stężeniu 5mg/ml), aby uzyskać stężenie końcowe 0,5μg/ml.
- 1 fiolki insuliny (1,25ml o stężeniu 2mg/ml), aby uzyskać stężenie końcowe 5μg/ml.
- 1 fiolki transferyny (100μl o stężeniu 50mg/ml), aby uzyskać stężenie końcowe 10μg/ml.
- 5 μl trijodotyroniny L (w stężeniu 1mg/ml), aby uzyskać stężenie końcowe 10ng/ml.
- 1 fiolki hydrokortyzonu (50μl o stężeniu 5mg/ml), aby uzyskać stężenie końcowe 0,5μg/ml.
- 5 μl kwasu retinowego rozcieńczonego do 0,01mg/ml, aby uzyskać stężenie końcowe 0,1ng/ml.
- 10 μl roztworu albuminy z surowicy bydlęcej, aby uzyskać stężenie końcowe 1,5μg/ml
3. Przygotowanie roztworów do dysocjacji:
- Przygotowanie roztworu zapasowego trypsyny/EDTA: rozpuścić 100 mg trypsyny (Sigma T9935-100mg) i 40 mg EDTA (Sigma E6758) w 500 ml 0,01M PBS (Sigma E6758). Rozdzielić do fiolek o pojemności 2 ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C. Rozcieńczanie roztworu zapasowego: dodać 2 ml roztworu zapasowego do 6 ml PBS (końcowe stężenie trypsyny wynosi 250 μg/ml, a EDTA 100 μg/ml).
- Roztwór do zatrzymania reakcji enzymatycznych: przygotować w BSC świeży 10% FBS w pożywce: dodać 1 ml FBS do 9 ml pożywki (DMEM/Ham F-12). Dla każdej płytki 100mm użyć 8 ml ogrzanego 10% FBS w celu zneutralizowania 8 ml roztworu dysocjującego.
4. Wymagania szczególne:
- Podczas hodowli komórek nabłonkowych należy dbać o czystość i dezynfekcję wszystkich elementów. Wszystkie odczynniki stosowane do hodowli komórkowych powinny być sterylne lub przefiltrowane przez filtr 0,2μm. Przygotowanie materiałów i dodatków powinno odbywać się w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC). Dodawanie lub wymiana pożywek powinny być wykonywane w BSC.
- Należy związać włosy, założyć jednorazową czepek (jeśli jest dostępny), fartuch laboratoryjny oraz rękawiczki.
- Należy dbać o porządek na wszystkich powierzchniach roboczych. Powierzchnie robocze należy przecierać 70% etanolem pomiędzy poszczególnymi operacjami i zachować co najmniej 15 minut przerwy pomiędzy pracą z różnymi kulturami.
- Należy opisać wszystkie odczynniki i butelki z pożywkami, podając datę otrzymania oraz datę przygotowania.
- Kultury i pożywki należy regularnie sprawdzać pod kątem widocznego zanieczyszczenia bakteryjnego lub grzybowego.
- Należy regularnie przeprowadzać testy na obecność mycoplasma (w razie potrzeby).
- Przed wymianą pożywki w hodowli komórkowej należy ogrzać ją do 37°C.
- Antybiotyki/leki przeciwgrzybicze oraz FBS powinny być świeżo dodawane do pożywki.
- Pożywkę należy wymieniać co najmniej co 3-4 dni. Nie należy pozostawiać komórek w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas. Po wymianie pożywki komórki należy bezzwłocznie przenieść do inkubatora.
Reprezentatywne wyniki:
Charakterystyka hodowli i morfologia ludzkich komórek nabłonka oskrzeli
Mikroskopia ludzkich komórek nabłonka oskrzeli pobranych metodą szczoteczkowania z segmentów oskrzeli wykorzystanych do hodowli, przeprowadzona przed rozpoczęciem hodowli, wykazała obecność pasm zarówno rzęskowych, jak i nierzęskowych komórek nabłonka, co wskazuje na prawidłowy nabłonek (Rycina 1, Suplement 1). Immunobarwienie preparatów cytospinowych komórek z eksplantów oraz komórek wysianych na szkiełka podstawowe ujawniło, że wszystkie komórki były pozytywne w kierunku specyficznych dla nabłonka cytokeratyn (Rycina 3). Pomyślne hodowle z eksplantów tkanki oskrzelowej uzyskano w 8 z 9 tkanek, ponieważ jedna z hodowli eksplantów uległa zakażeniu. Pierścienie komórek nabłonka osiągnęły promień 1-2 cm w ciągu 3-4 tygodni (Rycina 2a). Pomyślne eksplanty poddawano ponownej hodowli do 6 razy. We wszystkich udanych hodowlach zaobserwowano migrację komórek w ciągu 48 godzin od rozpoczęcia transplantacji (Rycina 2b). Komórki miały wygląd brukowany, charakterystyczny dla tych komórek nabłonka, co przedstawiono na Rycina 2, 4, 5 i 6. Komórki oskrzelowe po pasażowaniu wykazały jednolite pozytywne immunobarwienie na cytokeratynę i E-kadherynę. Immunobarwienie ze swoistymi przeciwciałami przeciwko innym typom komórek nie wykazało oznak zanieczyszczenia hodowli fibroblastami, komórkami mezenchymalnymi ani śródbłonkowymi (odpowiednio barwienia na α-SMA, wimentynę i CD31: PECAM-1) (Rycina 5). Komórki hodowane na przepuszczalnych membranach poliestrowych (transwell) z interfejsem powietrze-ciecz (Air-Liquid Interface) zróżnicowały się w nabłonek rzęskowy, co zaprezentowano na Rycina 6. Reprezentatywne nagrania wideo komórek nabłonka oskrzeli hodowanych w systemie transwell pokazują zróżnicowany nabłonek z ruchomymi rzęskami (Suplement 2).
Charakterystyka przetestowanych kultur ludzkich komórek nabłonka oskrzeli przedstawiona jest w Tabeli 1. Mediana czasu do pierwszego pasażu (P1) wynosiła 4 tygodnie, a średnia wydajność wyniosła 15,1±2,75 miliona komórek (n=9 tkanek). Żywotność komórek z eksplantatów oraz w fazie P1 oceniano metodą wykluczania błękitu trypanu; w tych kulturach oskrzelowych była ona konsekwentnie wysoka (99%). Komórki poddane subkultywacji z kultur eksplantatów z każdej tkanki zostały połączone po pierwszym pasażu do późniejszego wykorzystania. Średnia liczba komórek odzyskanych z eksplantatów była znacząco wyższa niż w kolejnej kulturze pasażowej (każde 2 miliony komórek z P1 dały P2: 6,75±2,4 miliona komórek, n=5 tkanek). Jedna kultura P2 została odrzucona, ponieważ morfologia nie była typowa dla komórek nabłonkowych (Rycina 7a). Podobnie odrzucono dwa inne pasażu (P2 i P3) z różnych tkanek (Rycina 7b).
Rysunek 1 Segmenty ludzkiej tkanki oskrzelowej oraz świeżo wyizolowany pasek nabłonka składający się z komórek rzęskowych i nierzęskowych. (a) Reprezentatywne zdjęcie segmentów ludzkiej tkanki oskrzelowej – o długości ~1-2cm i średnicy <1cm – wykorzystywanych do pierwotnych kultur ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego. (b) Pasek ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego pobrany metodą szczotkowania z segmentu oskrzela wykazuje obecność zarówno rzęskowych, jak i nierzęskowych komórek nabłonkowych, powiększenie 320X. Nagranie wideo komórek z bijącymi rzęskami znajduje się w Suplemencie 1.
Rycina 2 Ludzkie komórki nabłonkowe oskrzeli wyhodowane z eksplantatów na 100 mm płytkach do hodowli tkanek. a) Płytka 100 mm z 2-3 mm³ tkanki. Zwróć uwagę na pierścień komórek o szerokości około 1-2 cm, który staje się widoczny gołym okiem po 3-4 tygodniach. b) Obraz krawędzi tkanki eksplantatu i komórek nabłonkowych migrujących z eksplantatu, pasek skali = 100 μm. Eksplantaty przeniesione na nową płytkę stają się przeszczepami. Eksplantaty mogą być przeszczepiane do 6 razy.
Rycina 3 Komórki wyhodowane z eksplantów barwione na cytokeratyny specyficzne dla nabłonka. Cytospiny komórek z eksplantów zostały zabarwione na cytokeratyny (zielony) przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-Pan Cytokeratin-FITC (mieszanina), które rozpoznaje ludzkie cytokeratyny 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18 i 19. Jądra komórkowe zabarwiono barwnikiem Hoechst (niebieski). Obraz złożony pokazuje, że komórki oskrzeli wyhodowane z eksplantów były głównie komórkami nabłonkowymi, skala=20μm.
Rycina 4 Subkultura ludzkich nabłonkowych komórek oskrzeli. a) Przy użyciu trypsyny/EDTA komórki z eksplantów i transplantów są odrywane z płytek 100mm, liczone i wysiewane w ilości 2-3 milionów komórek na kolbę T75. Komórki osiągają stan subkonfluencji (80-90%) w kolbach T75 w ciągu 28-30 dni (b, c). Zwróć uwagę na typową morfologię brukową komórek nabłonkowych, skala=100μm.
Rycina 5 Weryfikacja fenotypu nabłonkowego podkulturujących komórek oskrzeli za pomocą immunobarwienia. Komórki te wykazano jako dodatnie (zielone) w kierunku Cytokeratyny-FITC (a,b); kontrolę dodatnią dla cytokeratyny-FITC przedstawiono na komórkach nabłonkowych A549 (c), a kontrolę ujemną na fibroblastach (d). Hodowane komórki oskrzeli wykazano jako dodatnie (ciemnoczerwone) w kierunku E-Kadheryny/Alexa Fluor 594 (i,j), natomiast nie wykazano barwienia dla α-SMA-cy3 (e,f), Wimentyny/TRITC (m) ani CD31 (PECAM-1/FITC) (o), co wskazuje na brak zanieczyszczenia pierwotnych hodowli komórek nabłonkowych oskrzeli odpowiednio komórkami mięśni gładkich, mezenchymalnymi lub śródbłonka. Kontrolę dodatnią (ciemnoczerwoną) dla E-Kadheryny/Alexa Fluor 594 przedstawiono na komórkach nabłonkowych A549 (k). Kontrolę dodatnią dla α-SMA-cy3 (czerwoną) przedstawiono na fibroblastach (g,h). Kontrole przeciwciał wtórnych przedstawiono na komórkach nabłonkowych oskrzeli dla Alexa Fluor 594 (l), króliczego przeciwciała anty-mysiego TRITC (n) oraz osiołkowego przeciwciała anty-koziego FITC (p). Pasek skali=20μm.
Rycina 6 Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane na transwellach. Komórki rzęskowe hodowane są na przepuszczalnych membranach poliestrowych (średnica 6,5mm) przy gęstości zasiewu 50 000 komórek na dołek (a) Pasek=100μm. Immunobarwienie komórek hodowanych na transwellach z użyciem cytocheratyny-FITC (zielony) i DAPI (niebieski) wykazuje, że są to głównie komórki nabłonkowe, Pasek=20μm. Komórki są hodowane w zanurzeniu w pożywce przez 10 dni, a następnie zasilane pożywką wyłącznie od dołu przez kolejne 4-6 tygodni w celu stworzenia warunków ALI aż do wykształcenia rzęsek, jak pokazano w (b), powiększenie 160x. Filmy przedstawiające ruch rzęsek znajdują się w Suplemencie 2. (c) Obrazy TEM wykazują wzrost rzęsek w hodowlach ALI po 6 tygodniach, powiększenie=150000x.
Rycina 7 Przykład komórek, które należy odrzucić na podstawie morfologii. Komórki te pojawiają się zazwyczaj, gdy tkanka była wielokrotnie przeszczepiana. Należy pamiętać, że należy odrzucić zarówno komórki, jak i przeszczep. a) Komórki zostały pobrane z jednej płytki z przeszczepami, które były hodowane 6 razy i wysiane do kolby T75. W ciągu 1 tygodnia komórki wykazały wyraźną morfologię, która nie odpowiadała brukowanemu wyglądowi komórek nabłonkowych. Zamiast tego gęsto rosły cienkie, wydłużone komórki. b) Więcej przykładów komórek, których nie należy łączyć z typowymi komórkami nabłonkowymi, lecz należy odrzucić. Pasek skali=100μm.
Tabela 1: Charakterystyka hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli
| Wskaźnik sukcesu (liczba tkanek) | 8/9 (88.8%) |
| Mediana czasu (zakres) do P1 (tygodnie) | 4 (3-5) |
| Średnia (SEM) liczba komórek w P1 | 15.1 (2.75) x 106 |
| Średnia (SEM) żywotność w P1 | 99% (2%) |
| (P1 = pierwsze pasażowanie) | |
Suplement 1 przedstawia pasmo rzęskowych i nierzęskowych komórek nabłonka oskrzeli pobranych metodą szczotkowania z ludzkiego segmentu oskrzela przeznaczonego do transplantacji, powiększenie 320X. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film do Suplementu 1.
Suplement 2 Zróżnicowane komórki nabłonka oskrzeli hodowane na granicy ciało-powietrze. Filmy (2a i 2b) przedstawiają ruch rzęsek przy powiększeniu odpowiednio 160X i 320X. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film do Suplementu 2A. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film do Suplementu 2B.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym badaniu przedstawiliśmy szczegółowe metody hodowli i namnażania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. Wykazaliśmy, że eksplantaty i przeszczepy tkanki oskrzelowej, hodowane w pożywkach sprzyjających wzrostowi komórek nabłonka, mogą zapewnić ciągłe źródło ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych do badań nad modelami komórkowymi niedróżnicowanymi (zanurzonymi) i zróżnicowanymi (hodowanymi na granicy powietrze-ciecz). Komórki te mogą być wykorzystywane w systemach testowania leków, które w większym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy są bardzo wdzięczni dr. Richardowi Inculetowi za udostępnienie tkanek oskrzeli. Zgody Komisji Etyki Badań uzyskano z St. Joseph's Healthcare Hamilton oraz University of Western Ontario/London Health Sciences Centre (dr David McCormack), Tissue and Archives Committee, Department of Pathology. Dziękujemy również Ernie'mu Spitzerowi (Electron Microscopy, McMaster University) za wykonanie zdjęć TEM naszych kultur ALI oraz Danieli Farkas za dostarczenie niektórych materiałów niezbędnych do immunobarwienia. Praca ta była finansowana z grantu blokowego Ontario Thoracic Society; dr Asma Yaghi otrzymała wsparcie z programu stypendialnego FSORC, St. Joseph's Healthcare, Hamilton, Ontario, Kanada.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Albumina z surowicy bydlęcej, proszek | Sigma-Aldrich | A4919 | Do użycia jako roztwór do powlekania |
| Roztwór kolagenu typu I 0,1%, filtrowany sterylnie | Sigma-Aldrich | C8919 | Stosować jako roztwór do powlekania |
| Fibonektyna z ludzkiej osocza | Sigma-Aldrich | F2006 | Do użycia jako roztwór do powlekania |
| Earle’zrównoważony roztwór soli (EBSS, sterylny) | Sigma-Aldrich | 28888 | Stosować do płukania tkanki oraz do roztworu powlekającego |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| płytki plodowa cielęca (FBS) | Sigma-Aldrich | F1015 | Unieczynnić, następnie podzielić na alykwoty i zamrozić (-20°C)°C); w razie potrzeby użyć świeżych |
| Stabilizowana mieszanina antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych | Sigma-Aldrich | A5955 | Przenieś do probówek o objętości 2 ml i zamroź (-20°C)°C); w razie potrzeby użyć świeżego |
| Roztwór albuminy z surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A8412 | BSA |
| Ekstrakt z przysadki bydlęcej | Sigma-Aldrich | P1476 | BPE (Byte Pair Encoding) |
| Epidermalny czynnik wzrostu | Sigma-Aldrich | E9644 | EGF |
| (±)-Epinefryna | Sigma-Aldrich | E1635 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Transferryna ludzka | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Trijodotyronina (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Kwas retinowy | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| Bufor fosforanowy (PBS) | Sigma-Aldrich | P5368 | PBS |
| 70% etanol | Stosować do dezynfekcji i czyszczenia | ||
| wpływy Transwell 24-dołkowe | Corning | 3470 | |
| Kolby do hodowli komórkowej (T75) CLLBND od firmy Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | Kolby te posiadają powłokę Cell Bind, która wspomaga adhezję i wzrost komórek. |
| Przeciwciało monoklonalne anty-cytokeratyna, pan-FITC | Sigma-Aldrich | F3418 | Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100/PBS; stosować w rozcieńczeniu 1:250 |
| Przeciwciało: E-kadheryna (H108) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7870 | Nie permeabilizować; Należy zastosować rozcieńczenie 1:250 oraz przeciwciało wtórne A21207 (Invitrogen) |
| przeciwciało osiołkowe anty-królicze IgG znakowane Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Stosować w rozcieńczeniu 1:400 |
| Przeciwciało: mysie monoklonalne anty- α-aktyna mięśni gładkich-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100/PBS; zastosować rozcieńczenie 1:100 |
| Przeciwciało: Vimentyna (RV202) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-32322 | Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100/PBS; zastosować rozcieńczenie 1:100 oraz T2402 (Sigma-Aldrich) jako przeciwciało wtórne |
| przeciwciało królicze anty-mysie TRITC | Sigma-Aldrich | T2402 | Stosować rozcieńczenie 1:400 |
| Przeciwciało: CD31 lub PECAM-1 (M-20) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-1506 | Nie permeabilizować; Należy zastosować rozcieńczenie 1:200 oraz przeciwciało wtórne: Donkey anti-goat IgG-FITC |
| przeciwciało osiołkowe przeciwko IgG kozie znakowane FITC | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Stosować rozcieńczenie 1:100 | |
| Medium montażowe Vectashield z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Przechowywać w lodówce w ciemności; barwi jądra komórkowe i zachowuje fluorescencję podczas długotrwałego przechowywania |
| Medium montażowe Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Przechowywać w lodówce, w ciemności; zapobiega to utracie fluorescencji podczas długotrwałego przechowywania |
| H–roztwór barwiący CST | Sigma-Aldrich | H6024 | Barwi jądra komórkowe; należy zastosować rozcieńczenie 1:10 oraz Vectashield H-1000 |
Inne wymagania: inkubator, komora z laminarnym przepływem powietrza (BSC), wirówka, płytki hodowlane 100 mm, probówki sterylne (15 ml, 50 ml i 2 ml), sterylne końcówki do pipet, uchwyt i ostrza skalpela, małe ostre nożyczki, fartuchy laboratoryjne i rękawiczki. Przedmioty te można nabyć u preferowanych dostawców. |
Bibliografia
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
- Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
