Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli wyhodowane z eksplantatów

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szczegółową metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantatów ludzkiej tkanki oskrzelowych dróg oddechowych, w tym zróżnicowanego wzrostu na granicy powietrze-ciecz. Metoda ta stanowi obfite źródło komórek pierwotnych do badania roli nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobach płuc człowieka.

Streszczenie

Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli są potrzebne do modelowania komórkowego choroby oraz do badania wpływu substancji pomocniczych i środków farmakologicznych na funkcję i strukturę ludzkich komórek nabłonkowych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę hodowli komórek nabłonka oskrzeli z tkanki oskrzelowych dróg oddechowych, która jest pobierana przez chirurga w czasie operacji płuc (np. raka płuc lub operacji zmniejszenia objętości płuc). Za zgodą etyki i świadomą zgodą chirurg pobiera to, co jest potrzebne do patologii i dostarcza nam część oskrzeli, która jest oddalona od chorych obszarów. Tkanka jest następnie wykorzystywana jako źródło eksplantatów, które można wykorzystać do hodowli pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli w hodowli. Segmenty oskrzeli o długości około 0,5-1 cm i średnicy ≤1 cm przepłukuje się zimnym EBSS i usuwa nadmiar tkanki miąższowej. Segmenty są rozcinane i mielone na 2-3 mm³ kawałki tkanki. Kawałki są wykorzystywane jako źródło komórek pierwotnych. Po pokryciu 100 mm płytek hodowlanych przez 1-2 godziny kombinacją kolagenu (30 μg/ml), fibronektyny (10 μg/ml) i BSA (10 μg/ml), płytki są drapane w 4-5 obszarach, a w porysowanych obszarach umieszcza się kawałki tkanki, następnie dodaje się pożywkę hodowlaną (DMEM/Ham F-12 z dodatkami) odpowiednią do wzrostu komórek nabłonkowych i płytki umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% CO₂ nawilżone powietrze. Pożywkę hodowlaną zmienia się co 3-4 dni. Komórki nabłonkowe wyrastają z kawałków, tworząc pierścienie o średnicy około 1,5 cm w ciągu 3-4 tygodni. Eksplantaty można ponownie wykorzystać do 6 razy, przenosząc je na nowe, wstępnie powlekane płyty. Komórki są podnoszone za pomocą trypsyny/EDTA, łączone, liczone i ponownie platerowane w kolbach T75 Cell Bind w celu zwiększenia ich liczby. Kolby T75 wysiane 2-3 milionami komórek osiągają 80% konfluencji w ciągu 4 tygodni. Rozszerzone pierwotne ludzkie komórki nabłonkowe mogą być hodowane i pozwalać im różnicować się na granicy faz powietrze-ciecz. Opisane tu metody stanowią obfite źródło ludzkich komórek nabłonka oskrzeli ze świeżo wyizolowanych tkanek i pozwalają na badanie tych komórek jako modeli choroby oraz na badania farmakologiczne i toksykologiczne.

Protokół

Ludzkie segmenty oskrzelowe stanowią obfite źródło pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli. W tym artykule opisano protokół wzrostu i ekspansji ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE) ze świeżo wyizolowanych ludzkich segmentów oskrzeli. Protokół ten składa się z pięciu sekcji:

1. Powlekanie i drapanie płytek hodowlanych 100 mm
2. Przygotowanie eksplantatów tkanki oskrzelowej
3. Przeszczepy tkanek oskrzelowych
4. Pasaż komórek HBE
5. Hodowla rzęskowych komórek HBE na Transwellach

Zanim zaczniesz Zauważ, że WSZYSTKIE KROKI SĄ WYKONYWANE W KOMORZE BEZPIECZEŃSTWA BIOLOGICZNEGO (BSC), CHYBA ŻE ZAZNACZONO INACZEJ. Upewnij się, że masz wszystkie materiały potrzebne do tej procedury. Prosimy o zapoznanie się z sekcją Materiały, odczynniki i przygotowanie i upewnienie się, że przygotowałeś aseptycznie (tj. w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego lub BSC) następujące materiały:
Roztwór podstawowy do powlekania: fibronektyna (10 μg/ml), BSA (10 μg/ml) i kolagen (30 μg/ml) w zrównoważonym roztworze soli Earle'a (EBSS, sterylny).
Pożywka hodowlana: DMEM/Szynka F-12 z dodatkami, antybiotyk-antybiotyk (1%) i FBS (1%)
Rozwiązania w zakresie dysocjacji: Roztwór podstawowy trypsyna/EDTA i DMEM/F-12 z FBS (10%)

1. Powlekanie i drapanie płytek hodowlanych 100mm: Eksplantaty będą platerowane na płytkach hodowlanych 100mm. Zacznij od pokrycia 100-milimetrowych płytek hodowlanych roztworem do powlekania. Należy to zrobić w BSC, utrzymuj wszystko w sterylności.

1. Umieść sterylne płytki hodowlane o średnicy 100 mm i roztwór powlekający (kolagen/fibronektyna/BSA) w BSC.
2. Odpipetować pipetą 2,0 ml roztworu powlekającego na płytce o średnicy 100 mm.
3. Zakręć dookoła, aby pokryć podstawę talerza. Upewnij się, że roztwór powłokowy równomiernie pokrywa podstawę płytki.
4. Odpipetować pozostały roztwór i użyć go do pokrycia drugiej płytki o średnicy 100 mm. Powtórz tę czynność dla tylu talerzy, ile potrzeba. Liczba potrzebnych płytek różni się w zależności od liczby eksplantatów tkanek.
5. Upewnij się, że roztwór powłokowy pokrywa podstawy płyt równomiernie, jak pokazano.
6. Przykryj talerze ich osłonami. Pozostaw płytki do wyschnięcia w inkubatorze na 1-2 godziny i odessaj nadmiar roztworu przed użyciem do eksplantatów tkanek oskrzeli. Nieużywane powlekane płytki hodowlane można umieścić w sterylnej torbie; szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze 4°C do późniejszego wykorzystania (można przechowywać w lodówce do miesiąca). Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej.
7. Spryskaj małe ostre nożyczki, skalpel i kleszcze 70% etanolem i wprowadź do BSC. Zdrap płytki powlekane, mocno dociskając skalpelem, aby utworzyć głębokie małe X s (co najmniej 4). Jeśli rysa nie jest wystarczająco głęboka, kawałki tkanki nie osiądą w grzbiety i będą unosić się na wodzie.

2. Przygotowanie eksplantatów tkanki oskrzelowej

Użyj tkanki oskrzelowej uzyskanej w ciągu 24-36 godzin po zabiegu. Chusteczkę należy przechowywać na lodzie w EBSS, aż będzie gotowa do użycia.

1. Na zewnątrz BSC: Umieść tkankę na szalce Petriego. Dokładnie wypłukać izolowane próbki ludzkiej tkanki oskrzelowej w EBSS.
2. Wypreparuj nadmiar otaczającej tkanki.
3. Rozetnij kawałki oskrzeli.
4. Wprowadzić tkankę do BSC i przenieść do sterylnej płytki do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm z zimnym DMEM/HamF12 + 1% antybiotyku/antybiotyku.
5. Użyj ostrych małych nożyczek, aby pokroić tkankę na 2-3 mm³ kawałki.
6. Umieść jeden kawałek przeciętej tkanki na środku każdego X za pomocą kleszczy i delikatnie dociśnij.
7. Pozwól kawałkom tkanek (eksplantatom) przylegać do płytki przez kilka sekund, a następnie delikatnie dodaj 10 ml kompletnej pożywki (DMEM/HamF12 + dodatki +1% antybiotyku/antybiotyku + 1% FBS). Jeśli tkanka unosi się na wodzie po dodaniu pożywki, użyj kleszczy, aby wepchnąć tkankę w grzbiety X lub utwórz nowy X. Może być konieczne wykonanie nowych X s, jeśli grzbiety nie są wystarczająco głębokie.
8. Umieść płytki w inkubatorze i zmieniaj pożywkę co 3-4 dni.
9. Tkanki są gotowe do przeszczepu, gdy wokół eksplantatów tkanek wyrośnie wystarczająca ilość komórek nabłonkowych, aby pokryć obszary 1-2 cm. Trwa to około 4 tygodni.

3. Przeszczepy tkanek oskrzelowych

1. Używaj pokrytych i porysowanych płytek o średnicy 100 mm. Ponieważ niektóre eksplantaty tkanek mogą się nie powieść, liczba płytek zależy od liczby przesadzanych kawałków tkanki. Jeśli używasz talerzy, które zostały wcześniej pokryte i przechowywane w temperaturze 4°C, przed użyciem doprowadź je do temperatury pokojowej.
2. Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś tkankę z oryginalnej płytki i umieść ją na środku X s w nowej płytce, a następnie delikatnie dociśnij. Tkanki bez wyrostka należy wyrzucić.
3. Pozostawić tkankę przylegającą do płytki przez kilka sekund, dodać pożywkę i inkubować, jak opisano wcześniej dla eksplantatów (2.7-2.9).

4. Przejście ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE)

1. Rozmrozić 2 ml roztworu podstawowego trypsyny/EDTA na każdą 100 mm płytkę do hodowli tkankowej. Rozcieńczyć bulion 6 ml sterylnego 0,01 M PBS (tj. dodać 2 ml roztworu podstawowego do 6 ml PBS (końcowe stężenie trypsyny wynosi 250 μg/ml, a dla EDTA 100 μg/ml).
2. Po przeniesieniu eksplantatów na nową płytkę, odessać pożywkę z płytek z 1-2 cm pierścieniami komórek.
3. Dodaj 8 ml podgrzanego, rozcieńczonego roztworu trypsyny/EDTA do każdej płytki o średnicy 100 mm i umieść w inkubatorze (37°C) na 3-15 minut. Sprawdzaj często, pozostawienie trypsyny zbyt długo na skórze uszkodzi komórki.
4. Sprawdź płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek została podniesiona. Komórki zostaną zaokrąglone w górę i odłączone, jak pokazano.
5. Dodaj 8 ml podgrzanego 10% FBS do podłoża na płytkę, aby dezaktywować roztwór trypsyny/EDTA.
6. Połączyć objętości wszystkich płytek w jedną probówkę (lub oddzielne probówki, jeśli są to różne tkanki). Policz komórki za pomocą hemekytometru.
7. Wirować przy 100 g przez 5 minut. U podstawy rurki utworzy się osad komórkowy.
8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce (DMEM/Ham F12 + wszystkie dodatki + 1% antybiotyk-antybiotyk + 1% FBS) do pożądanego stężenia komórek.
9. Umieść każde 2-3 miliony komórek w kolbie T75 i dodaj całe podłoże zgodnie z wymaganiami. Inkubuj i zmieniaj pożywkę co 3-4 tygodnie. Komórki rosną do subkonfluencji (80-90%) w kolbach T75 w ciągu około 4 tygodni. Komórki powinny być podnoszone i rozszerzane lub używane podczas subkonfluencji, aby zapobiec starzeniu się.

5. Hodowla orzęsionych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE) na Transwellach.

Pierwotne komórki nabłonkowe wyhodowane z eksplantatów/przeszczepów tkanek, mogą być rozbudowane do trzech razy, a następnie wykorzystane. Zalecana gęstość wysiewu wynosi od 50 000 do 100 000 komórek na^{cm2 1,2}. Większa gęstość sprzyja szybszemu różnicowaniu.
Uwaga: Przygotuj zawiesinę komórek i zmierz ich liczbę. Ponownie zawiesić w pożywce hodowlanej w ilości 1 miliona komórek na 2 ml.

1. Rozpocząć od przygotowania przepuszczalnych membran transwelli poprzez wstępną inkubację wkładek do kultur komórkowych z pożywką (DMEM/Ham F12) przed użyciem. Ten krok jest konieczny w przypadku tych wrażliwych komórek i pomoże w przyczepieniu komórek.
   1. Użyj wkładek 6.5 mm, które pasują do 24-dołkowych płytek wielodołkowych.
   2. Dodaj pożywkę po obu stronach membrany (w przypadku wkładek 6,5 mm użyj 0,6 ml na dole, 0,1 ml na górze). Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych.
   3. Ostrożnie usunąć (przypiąć) pożywkę z obu stron membrany, zaczynając od objętości podstawowej.
      Ostrożnie oznacza: membranę można łatwo uszkodzić, dlatego odpipetować pożywkę z boku wkładki hodowlanej, użyć zalecanej objętości. Niezastosowanie się do tego spowoduje wyciek mediów do innych odwiertów.
2. Komórki nasienne po wstępnej inkubacji przepuszczalnego podłoża
   1. Ostrożnie odpipetuj zawiesinę komórek do wierzchołkowej strony błony: w przypadku studzienek 6,5 mm dodaj 0,1 ml zawiesiny komórek (tj. 50 000 komórek) do wierzchołkowej strony błony.
   2. Odpipetować 0,6 ml pożywki po podstawowej stronie membrany.
3. Karmić komórki od strony wierzchołkowej i podstawowej przez 10 dni, aby uzyskać dobrze zróżnicowaną kulturę: wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, stosując zademonstrowaną metodę:
   1. Najpierw usuń objętość podstawową
   2. Wymień objętość wierzchołkową (0,1 ml podłoża)
   3. Dodać 0,6 ml pożywki po podstawowej stronie membrany.
   
   Ta metoda sprzyja przyczepianiu się komórek do błony i zapobiega wystawieniu komórek na działanie powietrza przez długi czas (szybka wymiana pożywki i ponowne umieszczenie w inkubatorze).
4. Utworzyć granicę faz powietrze-ciecz (ALI) w 10 dniu, usuwając podłoże wierzchołkowe, a następnie zastępując 0,6 ml pożywki po podstawowej stronie błony.
5. Utrzymuj komórki w ALI przez 6 tygodni, zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu. Komórki rzęskowe zaczną pojawiać się 4 tygodnie po utworzeniu ALI. Komórki osiągną równomierne różnicowanie w komórki rzęskowe 6 tygodni po utworzeniu ALI.

Przygotowanie materiałów:

1. Przygotowanie roztworu podstawowego do powlekania (zrób to w BSC):

Podstawowe ludzkie komórki nabłonka oskrzeli dobrze rosną na powierzchniach pokrytych fibronektyną/BSA/kolagenem ³. Roztwór podstawowy do powlekania stosuje się do 100 mm płytek do kultur tkankowych do hodowli eksplantatów i przeszczepów, jak opisano powyżej. Roztwór powlekający może być również stosowany do powlekania szkiełek nakrywkowych w celu przyspieszenia przylegania komórek, szkiełka nakrywkowe można następnie wykorzystać do eksperymentów z barwieniem immunologicznym.

1. Fibronektyna (1 mg / ml roztworu podstawowego): Użyj F2006-2mg firmy Sigma. Rozpuść 2 mg w 2 ml sterylnego Earle's Balanced Salt Solution (EBSS, Sigma 28888), przefiltruj z filtrem strzykawkowym 0,2 μm w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC). Przechowuj 1 ml w zamrażarce w temperaturze -20°C do późniejszego użycia i użyj 1 ml do przygotowania 100 ml roztworu powlekającego.
2. BSA (1mg/ml roztwór podstawowy): Użyj Sigma A4919-1g. Odważyć 20 mg masy ciała i rozpuścić w 20 ml sterylnego EBSS, przefiltrować z filtrem strzykawkowym 0,2 μm w BSC. Porcję rozlać do fiolek o pojemności 1 ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do czasu, gdy będzie potrzebna. Użyj 1 ml bulionu, aby przygotować 100 ml roztworu powlekającego.
3. Roztwór podstawowy kolagenu (dostarczany w postaci 0,1% lub 1 mg / ml z Sigma C8919). Uwaga: otwierać tylko w BSC i szczelnie zamknąć przed powrotem do lodówki. Z 3 ml bulionu przygotować 100 ml roztworu powlekającego.
4. Roztwór podstawowy do powlekania: W BSC: dodać 3 ml kolagenu (1 mg / ml) do 1 ml fibronektyny (1 mg / ml) i 1 ml BSA (1 mg / ml) plus 95 ml EBSS (sterylne). Dobrze wymieszać i podać porcję do 2 ml fiolek i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do czasu, gdy będą potrzebne. Stężenia końcowe w powlekającym roztworze podstawowym: fibronektyna (10 μg/ml), BSA (10 μg/ml) i kolagen (30 μg/ml) w EBSS.

2. Przygotowanie pożywki hodowlanej (przygotowanie w BSC): Pożywka składa się z DMEM/Ham F-12 firmy Sigma z ekstraktem z przysadki bydlęcej (15 μg/ml) i naskórkowym czynnikiem wzrostu (10 ng/ml) z innymi dodatkami, jak wskazano poniżej. Antybiotyk/antybiotyk (1%) i FBS (1%) są dodawane na świeżo za każdym razem, gdy zmienia się pożywkę hodowlaną. Pożywka ta została opracowana poprzez przegląd wielu metod, które opisywały hodowle komórek nabłonka dróg oddechowych ^3-9. Nasza pożywka przeznaczona jest do optymalnego wzrostu ludzkich komórek nabłonka oskrzeli.

1. Bydlęcy ekstrakt z przysadki mózgowej (BPE 1 mg/ml roztwór podstawowy): Sigma P1476 (2,5 ml BPE w 14 mg/ml sterylnego i przefiltrowanego roztworu): Rozcieńczyć 2,5 ml bulionu (14 mg / ml) do końcowego stężenia 1 mg / ml. tj. dodać 2,5 ml bulionu BPE do 32,5 ml sterylnego EBSS w celu uzyskania zapasu 1 mg / ml. Podzielić na 7,5 ml podwielokrotności (4 probówki po 7,5 ml podwielokrotności i jedna probówka po 5 ml podwielokrotności). Po rozcieńczeniu porcje przechowywać w temperaturze -20°C do czasu, gdy będą potrzebne. Nie zaleca się długotrwałego przechowywania przygotowanego produktu oraz wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
2. Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF 10 μg/ml roztwór podstawowy): Sigma E9644-0,2mg. Rozpuścić zawartość (0,2 mg) w ciągu 20 ms przefiltrowanego 10 mM kwasu octowego o średnicy 10 mM zawierającego 0,1% BSA (tj. rozpuścić 20 mg BSA w 20 ml 10 mM kwasu octowego i przefiltrować, a następnie użyć do rozpuszczenia EGF). Podwielokrotność rozdzielić na porcje o pojemności 0,5 ml i przechowywać w zamrażarce -20. Użyj 100 μl na 100 ml podłoża.
3. Epinefryna (5 mg/ml roztwór podstawowy): Sigma E1635. Rozpuścić 10 mg w 2 ml przefiltrowanego kwasu solnego (HCl) o pojemności 1 M, podwielokrotność w fiolkach o pojemności 50 μl i zamrozić (-20°C).
4. Insulina (roztwór podstawowy 2 mg/ml): Sigma I6634 50 mg. Rozpuścić 50 mg w 25 ml przefiltrowanego (filtr 0,2 μm) rozcieńczonego HCl (1 mM). Porcję rozlać na fiolki o pojemności 1,25 ml.
5. Tranferrin Human (50 mg/ml roztwór podstawowy): Sigma T8158 100mg. Rozpuścić 100mg w 2ml DH20 (przefiltrowanym filtrem 0,2 μm). Podwielokrotność do 100 μl każda (w fiolkach 0,5 ml).
6. Trijodo-L-tyronina (1 mg / ml roztwór podstawowy): Sigma T6397 100 mg. Rozpuścić 100 mg w 100 ml 1M przefiltrowanego HCl. Podwielokrotność w 1 ml podwielokrotności. Podwielokrotność 0,5 ml na 10 μl podwielokrotności.
7. Hydorkortyzon (5 mg/ml roztwór podstawowy): Sigma H0888. Odważyć 100 mg i rozpuścić w 20 ml przefiltrowanego etanolu na 5 mg / ml bulionu. Podwielokrotność do fiolek o pojemności 1 ml. Podzielić 1 ml (5 mg / ml) na 50 μl porcji (fiolki 0,5 ml).
8. Kwas retinowy (1 mg / ml roztwór podstawowy, rozcieńczony do 0,01 mg / ml podczas stosowania): Sigma R2625 100 mg). Rozpuść 100mg w 10ml etanolu. Podzielić na 1,0 ml porcji. Podzielić (1 ml) fiolkę na 50 probówek po 20 μl każda. Zamrażać w temperaturze -20°C. Weź jedną fiolkę 20 μl i rozcieńcz do 2000 μl z pożywką, aby uzyskać zapas 0,01 mg / ml w razie potrzeby.
9. Roztwór albuminy z surowicy bydlęcej, sterylnie przefiltrowany, badany na kulturach komórkowych: Sigma A8412. Roztwór należy przechowywać w chłodnym (4°C) do momentu, gdy będzie potrzebny. Otwórz tylko w BSC.
10. Antybiotyk-Antybiotyk, Sigma A5955: podwielokrotność do objętości 1 ml i zamrozić w temperaturze -20°C do momentu, gdy będzie potrzebna. Stosować w stężeniu końcowym 1% w pożywce.
11. FBS, Sigma F1015: Dezaktywuj FBS w temperaturze 50°C na 30 minut. Pozostawić do ostygnięcia w BSC. Podwielokrotność porcji do sterylnych fiolek o pojemności 1 ml i 10 ml. Stosować przy 1% stężeniu końcowym w pożywce hodowlanej i przy 10% stężeniu końcowym w pożywce w celu zneutralizowania roztworu trypsyny/EDTA.
12. Budowa pożywki hodowlanej:
    Na 500 ml pożywki DMEM/HamF12 należy użyć:
    • 1 tubka BPE (każda 7,5 ml 1 mg / ml) dla końcowego stężenia 15 μg / ml.
    • 1 tubka EGF (0,5 ml 10 μg / ml) dla końcowego stężenia 10 ng / ml.
    • 1 tubka epinefryny (50 μl 5 mg / ml) dla końcowego stężenia 0,5 μg / ml.
    • 1 fiolka insuliny (1,25 ml 2 mg / ml) dla końcowego stężenia 5 μg / ml.
    • 1 fiolka transferyny (100 μl 50 mg / ml) dla końcowego stężenia 10 μg / ml.
    • 5 μl Trijodo-L-tyroniny (w stężeniu 1 mg/ml) dla końcowego stężenia 10 ng/ml.
    • 1 fiolka hydrokortyzonu (50 μl 5 mg / ml) dla końcowego stężenia 0,5 μg / ml.
    • 5 μl kwasu retinowego rozcieńczonego do 0,01 mg/ml do końcowego stężenia 0,1 ng/ml.
    • 10 μl roztworu albuminy z surowicy bydlęcej dla końcowego stężenia 1,5 μg/ml
    Umieścić 7,5 ml roztworu podstawowego BPE w sterylnej butelce o pojemności 500 ml i dodać wszystkie dodatki jak powyżej.   Uzupełnić do 500 ml za pomocą DMEM/Ham F-12. Przechowywać roztwór szczelnie zamknięty w lodówce i chronić przed światłem. Gdy zajdzie potrzeba wymiany pożywki w płytkach, należy tylko podsycić potrzebną ilość i dodać świeży antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy (1%) i FBS (1%), podgrzać do 37°C, a następnie użyć.

3. Przygotowanie roztworów dysocjacyjnych:

1. Przygotowanie roztworu podstawowego trypsyny/EDTA: rozpuścić 100 mg trypsyny (Sigma T9935-100 mg) i 40 mg EDTA (Sigma E6758) w 500 ml 0,01 M PBS (Sigma E6758). Porcję rozlać do fiolek o pojemności 2 ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy: dodać 2 ml roztworu podstawowego do 6 ml PBS (końcowe stężenie trypsyny wynosi 250 μg/ml, a dla EDTA 100 μg/ml).
2. Roztwór do zatrzymania reakcji enzymatycznych: Przygotować świeży 10% FBS w pożywce w BSC: dodać 1 ml FBS do 9 ml pożywki (DMEM/Ham F-12). Na każdą płytkę o średnicy 100 mm należy użyć 8 ml podgrzanego 10% FBS, aby zneutralizować 8 ml roztworu dysocjacyjnego.

4. Specjalne wymagania:

1. Podczas hodowli komórek nabłonkowych należy utrzymywać wszystko w czystości i dezynfekcji. Wszystkie odczynniki używane do hodowli komórkowych powinny być sterylne lub przefiltrowane filtrem 0,2 μm. Przygotowanie materiałów i dodatków powinno odbywać się w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC). Dodawanie lub zmiana nośników powinna odbywać się w BSC.
2. Zwiąż włosy, załóż jednorazową czapkę, jeśli jest dostępna, oraz załóż fartuch laboratoryjny i rękawiczki.
3. Utrzymuj wszystkie powierzchnie robocze wolne od bałaganu. Czyść powierzchnie robocze 70% etanolem między operacjami i odczekaj co najmniej 15 minut między obchodzeniem się z różnymi kulturami.
4. Oznacz wszystkie odczynniki i butelki z pożywką, podaj datę otrzymania i datę przygotowania.
5. Regularnie badaj kultury i podłoża pod kątem dowodów na poważne zanieczyszczenie bakteryjne lub grzybicze.
6. Regularnie testuj na obecność mykoplazmy (w razie potrzeby)
7. Podgrzej pożywkę hodowlaną do 37°C przed zmianą pożywki na komórkach.
8. Antybiotyki/leki przeciwgrzybicze i FBS powinny być świeżo dodane do podłoża.
9. Zmieniaj podłoże co najmniej co 3-4 dni. Nie pozwól, aby ogniwa pozostawały w temperaturze pokojowej przez długi czas. Zmień podłoże i natychmiast wróć do inkubatora.

Reprezentatywne wyniki:

Charakterystyka kultury i morfologia ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Mikroskopia ludzkich komórek nabłonka oskrzeli pobranych z segmentów oskrzelowych używanych do hodowli, przed hodowlą, wykazała paski zarówno komórek nabłonka rzęskowego, jak i nierzęskowego, wskazujące na normalny nabłonek (Rysunek 1, Suplement 1). Barwienie immunologiczne preparatów cytospinowych komórek z eksplantatów i komórek wysianych na szkiełkach nakrywkowych ujawniło, że wszystkie komórki były dodatnie dla cytokeratyn specyficznych dla nabłonka (Figura 3). Udane hodowle z eksplantatów tkanki oskrzelowej wystąpiły w 8 z 9 tkanek, ponieważ jedna z kultur eksplantatów została zainfekowana. Pierścienie komórek nabłonkowych osiągnęły promień 1-2 cm w ciągu 3-4 tygodni (ryc. 2a). Udane eksplantaty ponownie wyhodowano do 6 razy. We wszystkich udanych hodowlach stwierdzono migrację komórek w ciągu 48 godzin od rozpoczęcia przeszczepów (ryc. 2b). Komórki miały wygląd kostki brukowej, który jest charakterystyczny dla tych komórek nabłonkowych, jak pokazano na rysunkach 2, 4, 5 i 6. Subhodowlane komórki oskrzeli wykazywały jednolite dodatnie barwienie immunologiczne cytokeratyny i E-kadheryny. Barwienie immunologiczne specyficznymi przeciwciałami przeciwko innym typom komórek nie wykazało żadnych oznak zanieczyszczenia kultur przez fibroblasty, mezenchymalne lub komórki śródbłonka (odpowiednio α-SMA, wimentyna i CD31: PECAM-1) (Figura 5). Komórki hodowane na przepuszczalnych membranach poliestrowych (transwellach) z interfejsem powietrze-ciecz różnicowały się w nabłonek rzęskowy, jak pokazano na rycinie 6. Reprezentatywne nagrania wideo komórek nabłonka oskrzeli hodowanych na transwellach pokazują zróżnicowany nabłonek z bijącymi rzęskami (Suplement 2).

Charakterystyka badanych kultur ludzkich komórek nabłonka oskrzeli jest pokazana w Tabeli 1. Mediana czasu do pierwszego pasażu (P1) wynosiła 4 tygodnie, a średnia wydajność 15,1±2,75 miliona komórek (n=9 tkanek). Żywotność komórek z eksplantatów i w P1 oceniano przez wykluczenie błękitu trypanowego i była konsekwentnie wysoka (99%) w tych hodowlach oskrzeli. Subhodowlane komórki z kultur eksplantatów z każdej tkanki zostały połączone po pierwszym pasażu w celu późniejszego wykorzystania. Średnia liczba komórek odzyskanych z eksplantatów była znacznie wyższa niż w późniejszej hodowli Passage (każde 2 miliony komórek z P1 dały P2: 6,75±2,4 miliona komórek, n = 5 tkanek). Jedna hodowla P2 została odrzucona, ponieważ morfologia nie była typowa dla komórek nabłonkowych (ryc. 7a). Podobnie odrzucono dwa inne pasaże (P2 i P3) różnych tkanek (ryc. 7b).

Rysunek 1 Ludzkie segmenty tkanki oskrzelowej i świeżo wyizolowany pasek nabłonka komórek rzęskowych i nierzęskowych. (a) Reprezentatywny obraz segmentów ludzkiej tkanki oskrzelowej - ~ 1-2 cm długości i <1 cm średnicy - używany do pierwotnych hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. (b) Pasek ludzkich komórek nabłonka oskrzeli wyszczotkowany z segmentu oskrzelowego pokazuje zarówno orzęskowe, jak i nierzęskowe komórki nabłonka, w powiększeniu 320X. Film przedstawiający komórki z bijącymi rzęskami znajduje się jako suplement 1.

Rysunek 2 Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli wyhodowane z eksplantatów na 100-milimetrowych płytkach do hodowli tkankowych. a) Płytka 100mm z tkanką 2-3mm3. Zwróć uwagę na pierścień komórek o długości około 1-2 cm, który staje się widoczny gołym okiem po 3-4 tygodniach. b) Obraz krawędzi tkanki eksplantacyjnej, komórek nabłonkowych podczas migracji z eksplantatu, bar = 100 μm. Eksplantaty przeniesione na nową płytkę stają się przeszczepami. Eksplantaty można przesadzać do 6 razy.

Rysunek 3 Komórki wyhodowane z eksplantatów wybarwionych na obecność cytokeratyn specyficznych dla nabłonka. Cytospiny komórek z eksplantatów wybarwiono pod kątem cytokeratyn (kolor zielony) monoklonalnym anty-Pan Cytokeratin-FITC (mieszanina), która rozpoznaje ludzkie cytokeratyny 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18 i 19. Jądra barwiono barwnikiem Hoechst (kolor niebieski). Połączony obraz pokazuje, że komórki oskrzeli wyhodowane z eksplantatów były głównie komórkami nabłonkowymi, Bar = 20 μm.

Rysunek 4 Subkultura ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. a) Za pomocą trypsyny/EDTA, komórki z eksplantatów i przeszczepów są pobierane z płytek o średnicy 100 mm, liczone i wysiewane w ilości 2-3 milionów komórek na kolbę T75. Komórki rosną do subkonfluencji (80-90%) w kolbach T75 w ciągu 28-30 dni (b, c). Zwróć uwagę na typową brukową morfologię komórek nabłonkowych, Bar = 100 μm.

Rysunek 5 Subhodowlane komórki oskrzeli zostały zweryfikowane jako nabłonkowe za pomocą barwienia immunologicznego. Komórki te są zabarwione dodatnio (na zielono) na obecność Cytokeratin-FITC (a,b), kontrola pozytywna dla cytokeratyny-FITC jest pokazana w komórkach nabłonka A549 (c), a kontrola ujemna jest wykazana w fibroblastach (d). Hodowane komórki  oskrzeli zabarwione dodatnio (ciemnoczerwono) na obecność E-Kadheryny/Alexa Fluor 594 (i,j) i nie barwione na obecność α-SMA-cy3 (e,f), wimentyny/TRITC (m) ani CD31 (PECAM-1/FITC) (o) co nie wskazuje na zanieczyszczenie pierwotnych hodowanych komórek nabłonka oskrzeli odpowiednio komórkami mięśni gładkich, mezenchymalnymi lub śródbłonka. Dodatnia (ciemnoczerwona) kontrola dla E-Kadheryny/Alexa Fluor 594 jest wykazana na komórkach nabłonka A549 (k). Dodatnia kontrola dla α-SMA-cy3 (czerwona) jest wykazana w fibroblastach (g,h). Drugorzędowe kontrole przeciwciał są pokazane w komórkach nabłonka oskrzeli dla Alexa Fluor 594 (l); królik anty-mysz TRITC (n) i anty-koza osła FITC (p). Bar = 20 μm.

Rysunek 6 Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane na transwellach. Komórki rzęskowe są hodowane na przepuszczalnych membranach poliestrowych (średnica 6,5 mm) przy gęstości wysiewu 50 000 komórek na studzienkę (a) Bar=100 μm. Barwienie immunologiczne komórek hodowanych na transwellach za pomocą cytokeratyny-FITC (kolor zielony) i DAPI (kolor niebieski) wykazuje, że komórki te są głównie komórkami nabłonkowymi, Bar=20μm. Komórki są hodowane zanurzone w pożywce przez 10 dni, a następnie karmione pożywką od dołu tylko przez kolejne 4-6 tygodni, aby utworzyć ALI, aż rzęski zostaną wyhodowane, jak pokazano w (b), powiększenie 160x. Zobacz Suplement 2, aby zapoznać się z filmami przedstawiającymi bicie rzęsek. (c) Obrazy TEM pokazują wzrost rzęsek w kulturach ALI po 6 tygodniach, powiększenie = 150000x.

Rysunek 7 Przykład komórek, które powinny zostać odrzucone na podstawie morfologii. Komórki te zwykle pojawiają się, gdy tkanka była wielokrotnie przeszczepiana. Należy pamiętać, że zarówno komórki, jak i przeszczep należy wyrzucić. a) Komórki pobrano z jednej płytki z przeszczepami, które hodowano 6 razy i posiewano w kolbie T75. W ciągu 1 tygodnia komórki wykazały wyraźną morfologię, która nie reprezentowała brukowanego wyglądu komórek nabłonkowych. Zamiast tego cienkie, wydłużone komórki rosły gęsto. b) Więcej przykładów komórek, które nie powinny być łączone z typowymi komórkami nabłonkowymi, ale powinny zostać odrzucone. Bar = 100 μm.

Tabela 1: Charakterystyka kultur ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Wskaźnik sukcesu (# tkanek)8/9 (88,8%) Mediana czasu (zakres) do P1 (tygodnie)4 (3-5) Średnia (SEM) liczba komórek w P115,1 (2,75) x 10⁶ Średnia żywotność (SEM) przy P1 99% (2%) (P1 = pierwsze przejście)

Suplement 1 pokazuje pasek komórek nabłonka oskrzeli z orzęsionych i nierzęskowych komórek oskrzeli wyszczotkowanych z ludzkiego segmentu oskrzelowego używanego do przeszczepów, powiększenie 320X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć film o suplemencie 1.

Suplement 2 Zróżnicowane komórki nabłonka oskrzeli wyhodowane na granicy powietrze-ciecz. Filmy (2a i 2b) pokazują bicie rzęsek, powiększenie odpowiednio 160X i 320X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć film z suplementem 2A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć film z suplementem 2B.

Dyskusja

W pracy przedstawiono szczegółowe metody hodowli i ekspansji pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka oskrzeli. Wykazaliśmy, w jaki sposób eksplantaty i przeszczepy tkanki oskrzelowej, hodowanej w pożywkach, które promują wzrost komórek nabłonkowych, mogą stanowić ciągłe źródło ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych do badań niezróżnicowanych (zanurzonych) i zróżnicowanych (hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz) modeli komórek. Komórki te mogą być wykorzystywane w systemach testowania leków, które bardziej przypomi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina z surowicy bydlęcej, proszek	Sigma-Aldrich	A4919	Stosować do roztworu powlekającego
KOLAGEN TYPU I 0,1% Roztwór Sterylnie filtrowany	Sigma-Aldrich	C8919	Służy do powlekania roztworu
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Sigma-Aldrich	F2006	Stosowanie do roztworu powlekającego
Earle' s Zrównoważony roztwór soli (EBSS, sterylny)	Sigma-Aldrich	28888	Służy do płukania tkanek i do powlekania roztworu
DMEM/Ham F-12	Sigma-Aldrich	D8437
FBS	Sigma-Aldrich	F1015	Dezaktywować, następnie poddzielić i zamrozić (-20° C); w razie potrzeby stosować świeży
Antybiotyk-Stabilizowany	Antybiotykiem Sigma-Aldrich	A5955	Aliquot do 2 ml fiolek i zamrozić (-20° C); w razie potrzeby używaj świeżego
roztworu albuminy z surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A8412	BSA
Ekstrakt z przysadki bydlęcej	Sigma-Aldrich	P1476	BPE
Naskórkowy czynnik wzrostu	Sigma-Aldrich	E9644	EGF
(±)-Epinefryna	Sigma-Aldrich	E1635
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634
Tranferryna Ludzka	Sigma-Aldrich	T8158
Trijodo-L-tyronina	Sigma-Aldrich	T6397
Hydorkortyzon	Sigma-Aldrich	H0888
Kwas retinowy	Sigma-Aldrich	R2625
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T9935
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma-Aldrich	P5368	PBS
70% etanolu			Służy do dezynfekcji i czyszczenia
24-dołkowych	Corning	3470
(T75) CLLBND firmy Corning	Fisher Naukowy	05-539-104	Te kolby mają powłokę Cell Bind, która wspomaga przyłączanie i wzrost komórek
Monoklonalna anty-cytokeratyna, przeciwciało pan-FITC	Sigma-Aldrich	F3418	Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100 / PBS; Użyj przeciwciała o rozcieńczeniu 1:250
: E-Kadheryna (H108)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-7870	Nie przenikać; Użyj rozcieńczenia 1:250 i A21207 (Invitrogen) jako przeciwciała drugorzędowego
Alexa Fluor 594 osła anty-królicze IgG	Invitrogen	A21207	Użyj rozcieńczenia 1:400
Przeciwciało: Mysz monoklonalna Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100 / PBS; Użyj przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100
: Vimentin (RV202)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-32322	Przepuszczalność: 0,2% TRITON X-100/PBS; Użyj rozcieńczenia 1:100 i T2402 (Sigma-Aldrich) jako przeciwciała drugorzędowego
Królik anty-mysz TRITC	Sigma-Aldrich	T2402	Użyj rozcieńczenia 1:400
Przeciwciało: CD31 lub PECAM-1 (M-20)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-1506	Nie przenikać; Użyj rozcieńczenia 1:200 i IgG-FITC przeciwko kozom jako przeciwciału drugorzędowemu
IgG-FITC przeciwko kozom Santa	Cruz Biotechnology, Inc.		Użyj rozcieńczenia 1:100
Vectashield Podłoże montażowe z DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Przechowywać w lodówce w ciemności; barwi jądra i zachowuje fluorescencję podczas długotrwałego przechowywania
Vectashield Podłoże montażowe	Vector Laboratories	H-1000	Przechowywać w lodówce w ciemności; zachowuje fluorescencję podczas długotrwałego przechowywania
H– chst Roztwór barwienia	Sigma-Aldrich	H6024	Barwie jądra; użyj rozcieńczenia 1:10 i Vectashield H-1000
Inne wymagania: inkubator, komora bezpieczeństwa biologicznego (BSC), wirówka, płytki hodowlane 100 mm, sterylne probówki (15 ml, 50 ml i 2 ml), sterylne końcówki do pipet, rękojeść i ostrza skalpela, małe ostre nożyczki, fartuchy i rękawice laboratoryjne. Można je uzyskać od preferowanych dostawców.