Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Podsumowanie

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Streszczenie

Wykorzystanie elementów wzmacniających do sterowania ekspresją genów reporterowych w neuronach jest powszechnie stosowanym paradygmatem śledzenia projekcji aksonalnych. W przypadku śledzenia projekcji aksonalnych interneuronów rdzeniowych u kręgowców, geny reporterowe celowane w linię zarodkową dają obustronnie symetryczne znakowanie. W związku z tym trudno jest odróżnić aksony projektujące się ipsilateralnie i kontralateralnie. Jednostronna elektroporacja do rurki neuralnej kurczaka stanowi przydatny sposób ograniczenia ekspresji genu reporterowego do jednej strony ośrodkowego układu nerwowego, co pozwala na śledzenie projekcji aksonalnych po obu stronach.^{1 ,2-5}W tym filmie zaprezentowano najpierw sposób przygotowania jaj przed iniekcją. W stadium HH 18-20 DNA jest wstrzykiwane na poziomie sakralnym rurki neuralnej, następnie równolegle do zarodka umieszcza się elektrody wolframowe i za pomocą generatora impulsów podaje krótkie impulsy elektryczne. Jajo zostaje zabezpieczone taśmą i umieszczone z powrotem w inkubatorze w celu dalszego rozwoju. Trzy dni później (E6) rdzeń kręgowy zostaje pobrany z zarodka w formie preparatu typu open book, utrwalony i poddany procedurze barwienia przeciwciałami całego preparatu (whole mount). Zabarwiony rdzeń kręgowy zostaje umieszczony na szkiełku i zobrazowany przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Protokół

I. Elektroporacja

Obsługa jaj

1. Umieść jaja w nawilżanym inkubatorze ustawionym na 37-38°C, najlepiej w inkubatorze z tacek kołyszących.
2. Elektroporację zarodków przeprowadza się po około 66 godzinach inkubacji, gdy osiągną one stadium 18-20 według Hamburgera i Hamiltona (HH). Na tym etapie głowa znajduje się pod kątem prostym względem tułowia (stan ten nazywa się zgięciem szyjnym), a widoczny powinien być rozległy układ pozazarodkowych naczyń krwionośnych, takich jak przednie, tylne, prawe i lewe żyły witelinowe. Jest to optymalne stadium dla specyficznej ekspresji zależnej od enhansera ^1,3,4. Ważne jest monitorowanie temperatury i wilgotności inkubatora, aby uzyskać żywotne i zsynchronizowane zarodki.
3. Po 66 godzinach inkubacji wyjmij jaja z inkubatora. Ułóż jaja poziomo. Odczekaj 5-10 minut. Zarodek znajduje się teraz w górnym biegunie jaja.

Przygotowania

1. Przygotować roztwór Hanksa z penicyliną/streptomycyną (P/S) (rozcieńczenie 1:100).
2. Wytciągnąć kapilary szklane (średnica 0,5 mm) do formy mikrokapilar.
3. Umieścić elektrody (wolframowe) w mikromanipulatorze i podłączyć elektrody do generatora impulsów (ECM 830).
4. Ustawić generator impulsów zgodnie z następującymi parametrami: napięcie 30v, liczba impulsów - 3, czas trwania impulsu 50 ms.
5. Przygotować pipetę ustną, igłę strzykawki oraz taśmę.
6. Przygotować odpowiednią mieszaninę DNA (2-5μg/μl) i dodać barwnik Fast Green.

Wycinanie okienka i elektroporacja

1. Za pomocą strzykawki usunąć 5-6 ml albuminy z każdego jaja.
2. Małymi nożyczkami wyciąć owalne okienko w górnej części jaja.
3. Nawilżyć embrion 0,5-1 ml roztworu Hank's + P/S.
4. Za pomocą pipety ustnej napełnić szklaną mikrokapilarę mieszaniną DNA.
5. Ułożyć embrion tak, aby jego ogon był skierowany w stronę operatora. Na tym etapie rdzeń kręgowy embrionu jest wyraźnie widoczny, w związku z czym techniki kontrastowe nie są wymagane. Rdzeń kręgowy jest zamknięty na obu końcach (głowie i ogonie), jednak przy zastosowaniu wystarczająco cienkiej mikrokapilary możliwe jest wykonanie małego otworu i wprowadzenie się do rurki neuralnej pod niewielkim kątem. Mikrokapilara o odpowiedniej średnicy powinna dać się łatwo napełnić DNA, przeniknąć przez rurkę bez jej uszkodzenia i uwolnić DNA podczas regularnego wydechu.
6. Wstrzyknąć DNA za pomocą pipety ustnej. Zielony barwnik powinien rozprzestrzenić się od koniuszka ogona aż po pęcherzyki rozwijającego się mózgu.
7. Umieścić elektrody równolegle do rurki neuralnej, jak najbliżej, unikając jednak dotykania samej rurki, a następnie podać impuls. W momencie podania impulsu elektrody muszą być przykryte cieczą, aby zapewnić przewodnictwo elektryczne. Zazwyczaj ilość roztworu Hank's dodana na początku jest wystarczająca. Jeśli nie, należy dodać jedną kroplę roztworu Hank's bezpośrednio przed impulsem.
8. Ostrożnie usunąć elektrody i zakleić okienko taśmą. Ważne jest całkowite uszczelnienie jaja, aby zapobiec wysychaniu embrionu podczas następnego okresu inkubacji.
9. Umieścić jajo z powrotem w inkubatorze.

II. Przygotowanie rdzenia kręgowego metodą open-book

Oddzielenie rdzenia kręgowego od zarodka

1. Wyjąć elektroporowany embrion w stadium E6 z jaja i umieścić go w pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS.
2. Odciąć błony i rozprostować embrion na stronie brzusznej, używając szpilek do jego unieruchomienia.
3. Za pomocą ostrej mikrokapilary wolframowej wykonać nacięcie wzdłużne wzdłuż płytki dachowej, od rąbka mózgu w stronę ogona.
4. Wykonać dwa dodatkowe nacięcia wzdłużne po obu stronach rdzenia kręgowego, oddzielając zwoje rdzeniowe tylnych korzeni (DRGs) od rdzenia kręgowego.
5. Oddzielić płytkę podłogową od tkanki, zaczynając od ogona w kierunku rąbka mózgu, pozostawiając rdzeń kręgowy nienaruszony.
6. Przeciąć rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym na wysokości rąbka mózgu za pomocą precyzyjnych nożyczek i oddzielić go od ciała.

Fiksacja

1. Rozłożyć wyizolowany rdzeń kręgowy w nowej szalce Petriego powleczonej silikonem i zawierającej PBS, używając pinezek do unieruchomienia go od rombencephalonu do ogona, aby przygotować preparat w układzie płaskim.
2. Odlać PBS z szalki i zastąpić go 4% paraformaldehydem w buforze fosforanowym (PBS).
3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

Immunohistochemia

1. Przenieść utrwalony rdzeń kręgowy do fiolki zawierającej przeciwciało pierwszorzędowe w PBS.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu.
3. Przemyć przeciwciało 5 razy w PBS, każde płukanie przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu.
4. Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu.
5. Przemyć przeciwciało 5 razy w PBS, każde płukanie przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu.

Montaż otwartej książki do obrazowania

1. Nanieść smar lub silikon w kształcie prostokąta na szkiełko przedmiotowe, a następnie wkroplić do środka PBS.
2. Za pomocą pęsety umieścić rozciągnięty rdzeń kręgowy w centrum prostokąta i odessać nadmiar cieczy z jego otoczenia pipetą Pasteura.
3. Nanieść 1-2 krople medium montażowego na rdzeń kręgowy i przykryć szkiełkiem nakrywką. Docisnąć, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
4. Przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4°C.
5. Poddać rdzeń kręgowy analizie z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Dyskusja

Elektroporacja plazmidowego DNA do zarodka kurczaka rozwija się jako potężna technika do ektopowej ekspresji in vivo. Połączenie specyficznych enhancerów i elektroporacji u kurczęt stanowi szybkie i wydajne narzędzie do rozszyfrowania szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanej grupy neuronów^1,3,5. Wykorzystanie systemów amplifikacji Cre/LoxP oraz Gal4/UAS może zwiększyć poziom i czas trwania ekspresji. Wyłaniający się obraz wskazuje na złożoną dywergencję sygnałów aksonalnych pochodzących z subpopulacji int...