Rozszyfrowywanie ścieżek aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej pisklącia z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Summary

Ten film pokazuje, jak wizualizować ścieżki aksonalne genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym pisklęcia, wykorzystując in ovo elektroporację genów reporterowych pod kontrolą określonych elementów wzmacniających.

Abstract

Zastosowanie elementów wzmacniających do napędzania ekspresji genów reporterowych w neuronach jest szeroko stosowanym paradygmatem śledzenia projekcji aksonalnej. W celu śledzenia projekcji aksonalnej interneuronów rdzeniowych u kręgowców, geny reporterowe ukierunkowane na linię zarodkową zapewniają obustronnie symetryczne znakowanie. Dlatego trudno jest rozróżnić aksony wystające ipsi i przeciwnie na boki. Jednostronna elektroporacja do cewy nerwowej pisklęcia stanowi użyteczny sposób na ograniczenie ekspresji genu reporterowego do jednej strony ośrodkowego układu nerwowego i śledzenie projekcji aksonalnej po obu stronach ^1,2-5. Ten film pokazuje najpierw, jak obchodzić się z jajami przed wstrzyknięciem. W stadium HH 18-20 DNA jest wstrzykiwane do poziomu krzyżowego cewy nerwowej, następnie elektrody wolframowe są umieszczane równolegle do zarodka i podawane są krótkie impulsy elektryczne za pomocą generatora impulsów. Jajo jest zamykane taśmą i umieszczane z powrotem w inkubatorze w celu dalszego rozwoju. Trzy dni później (E6) rdzeń kręgowy jest usuwany z zarodka jako preparat z otwartej książki, utrwalany i przetwarzany w celu barwienia całych przeciwciał mount. Zabarwiony rdzeń kręgowy jest montowany na szkiełku i wizualizowany za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Protocol

I. Elektroporacja

Obchodzenie się z jajkami

1. Umieść jaja w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37-38°C, najlepiej w inkubatorze z tacami bujanymi.
2. Zarodki są elektroporowane po około 66 godzinach od inkubacji, kiedy osiągną stadium Hamburger & Hamilton (HH) 18-20. Na tym etapie głowa leży pod kątem prostym do tułowia (stan zwany zgięciem szyjki macicy) i powinien być widoczny rozległy zestaw pozazarodkowych naczyń krwionośnych, takich jak żyły przednie, tylne, prawe i lewe. Jest to optymalny etap dla zależnej od wzmacniacza ekspresji specyficznej ^1,3,4. Ważne jest, aby monitorować temperaturę i wilgotność w inkubatorze, aby uzyskać żywotne i zsynchronizowane zarodki.
3. Po 66 godzinach inkubacji wyjmij jaja z inkubatora. Ułóż jajka poziomo. Poczekaj 5-10 minut. Zarodek znajduje się teraz na górnym biegunie komórki jajowej.

Przygotowania

1. Przygotować roztwór Hanka z penicyliną/streptomycyną (P/S) (rozcieńczenie 1:100).
2. Pociągnij szklane kapilary (o średnicy 0,5 mm) do mikrokapilary.
3. Umieść elektrody (wolfram) w mikromanipulatorze i podłącz elektrody do generatora impulsów (ECM 830).
4. Dostosuj generator impulsów o następujących parametrach: napięcie 30v, liczba impulsów - 3, długość impulsu 50 ms.
5. Przygotuj pipetę do jamy ustnej, igłę do strzykawki i taśmę.
6. Przygotuj żądaną mieszaninę DNA (2-5 μg/μl) i dodaj barwnik Fast Green.

Okienkowanie i elektroporacja

1. Za pomocą strzykawki usuń 5-6 ml albuminy z każdego jajka.
2. Małymi nożyczkami otwórz owalne okienko w górnej części jajka.
3. Zwilż zarodek 0,5-1 ml roztworu Hank's + P/S.
4. Użyj pipety doustnej, aby napełnić szklaną mikrokapilarnę mieszaniną DNA.
5. Umieść zarodek ogonem do siebie. Na tym etapie rdzeń kręgowy zarodka jest wyraźnie widoczny. W związku z tym nie są wymagane żadne techniki kontrastowe. Rdzeń kręgowy jest uszczelniony na obu końcach, głowie i ogonie, ale jeśli twoja mikrokapila jest wystarczająco cienka, będziesz w stanie przebić mały otwór i przeniknąć do cewy nerwowej pod płytkim kątem. Mikrokapilara o odpowiedniej średnicy powinna być łatwo załadowana DNA, przenikać do rurki bez jej uszkadzania i uwalniać DNA regularnym wydechem.
6. Wstrzyknąć DNA za pomocą pipety doustnej. Zielony barwnik powinien rozprzestrzeniać się od czubka ogona do pęcherzyków rozwijającego się mózgu.
7. Umieść elektrody równolegle do cewy neuronowej, jak najbliżej, nie dotykając samej rurki i pulsu. W momencie impulsu elektrody muszą być pokryte cieczą, aby umożliwić przewodność elektryczną. Zazwyczaj ilość Hank's dodana na początku jest wystarczająca. Jeśli nie, dodaj jedną kroplę Hank's tuż przed pulsem.
8. Ostrożnie wyjmij elektrody i uszczelnij okno taśmą. Ważne jest, aby całkowicie zapieczętować jajo, aby zapobiec wysuszeniu zarodka podczas następnego okresu inkubacji.
9. Umieść jajo z powrotem w inkubatorze.

II. Przygotowanie otwartej książki rdzenia kręgowego

Odłączenie rdzenia kręgowego od zarodka

1. Usunąć zarodek elektryczny w punkcie E6 z komórki jajowej i umieścić go na szalce Petriego pokrytej silikonem zawierającym PBS.
2. Odetnij błony i rozciągnij zarodek po jego brzusznej stronie, używając szpilek, aby go przytrzymać.
3. Za pomocą ostrej mikrokapilary wolframowej wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż płyty dachowej, od tyłomózgowia w dół do ogona.
4. Wykonaj dodatkowe dwa podłużne nacięcia po obu stronach rdzenia kręgowego, odłączając zwoje korzenia grzbietowego (DRG) od rdzenia kręgowego.
5. Odłącz płytkę podłogową od tkanki, zaczynając od ogona do tyłomózgowia, pozostawiając rdzeń kręgowy nienaruszony.
6. Przetnij rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym w tyłomózgowiu za pomocą cienkich nożyczek i oddziel go od ciała.

Fiksacja

1. Rozłóż izolowany rdzeń kręgowy na nowej szalce Petriego pokrytej silikonem zawierającym PBS, używając szpilek do jej przytrzymania, od tyłomózgowia do ogona, tworząc preparat do płaskiego mocowania.
2. Wlej PBS z naczynia i zastąp go 4% paraformaldehydem w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

Immunohistochemia

1. Przenieść stały rdzeń kręgowy do fiolki zawierającej pierwszorzędowe przeciwciało w PBS.
2. Inkubować z delikatnym mieszaniem przez noc w temperaturze 4°C.
3. Przemyć przeciwciało X5 razy PBS, każde płukanie przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.
4. Dodać przeciwciało drugorzędowe i inkubować z delikatnym mieszaniem przez noc w temperaturze 4°C.
5. Przemyć przeciwciało X5 razy PBS, każde płukanie przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.

Montaż otwartej książki do obrazowania

1. Rozsmaruj smar lub silikon w kształcie prostokąta na szkiełku i wlej do środka PBS.
2. Umieść rdzeń kręgowy rozciągnięty na środku prostokąta za pomocą pęsety i wyciągnij płyn wokół niego za pomocą pipety Pasteura.
3. Umieść 1-2 krople podłoża montażowego na rdzeniu kręgowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Zgnieć go, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
4. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C.
5. Sprawdź rdzeń kręgowy za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Discussion

Elektroporacja plazmidowego DNA do zarodka pisklęcia ewoluuje jako potężna technika ekspresji ektopowej in vivo. Połączenie specyficznych wzmacniaczy i elektroporacji piskląt zapewnia szybkie i skuteczne narzędzie do rozszyfrowywania ścieżek aksonalnych genetycznie zdefiniowanej grupy neuronów^1,3,5. Wykorzystanie systemów amplifikacji Cre/LoxP i Gal4/UAS może zwiększyć poziomy i czas trwania ekspresji. Wyłaniający się obraz to złożona rozbieżność sygnałów aksonalnych, która wynika z subpopulacji międzyneuronow...