Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.

Streszczenie

Angiogeneza to złożony, wieloetapowy proces, w którym w odpowiedzi na bodźce angiogenne z istniejącego układu naczyniowego powstają nowe naczynia. Etapy te obejmują: degradację błony podstawnej, proliferację i migrację (kiełkowanie) komórek śródbłonka (EC) do macierzy zewnątrzkomórkowej, ustawianie się EC w sznury, formowanie światła naczynia, anastomozę oraz tworzenie nowej błony podstawnej. Opracowano wiele testów in vitro do badania tego procesu, jednak większość z nich naśladuje jedynie określone stadia angiogenezy, a naczynia pod względem morfologicznym często nie przypominają naczyń in vivo. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany test angiogenezy in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej oraz fibroblastów. Model ten odwzorowuje wszystkie kluczowe wczesne etapy angiogenezy, a co istotne, naczynia wykazują drożne światła wewnątrzkomórkowe otoczone spolaryzowanymi komórkami EC. Naczynia można łatwo obserwować za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej i time-lapse oraz odzyskiwać w czystej formie do dalszych zastosowań.

Protokół

Procedura

1. Położyć pępowinę na czystej podkładce i odsączyć nadmiar krwi. Wykonać świeże cięcia na obu końcach pępowiny.
2. Wprowadzić igłę 21 1/2 G z założoną plastikową osłonką do żyły. (Żyła to największy otwór; dwa mniejsze to tętnice)
3. Zacisnąć igłę w miejscu za pomocą kleszczyków hemostatycznych i podłączyć do igły strzykawkę 20cc z roztworem Hanksa.
4. Przepchnąć roztwór Hanksa przez żyłę z umiarkowanym naciskiem. Zebrać odpady do zlewki z wybielaczem. (Przytrzymywanie igły i pępowiny jedną ręką podczas pchania zapobiegnie wysunięciu się igły z żyły). Jeśli w żyle znajduje się dużo krwi, wypłukać ją drugi raz.
5. Położyć pępowinę na podkładce i zacisnąć drugi koniec żyły. Wypełnić kilkoma mL roztworu Hanksa, aby sprawdzić szczelność wzdłuż pępowiny. Odciągnąć 5 mL i odłączyć dolny zacisk.
6. Odłączyć strzykawkę 20cc. Wyjąć tłok ze strzykawki 10cc. Podłączyć strzykawkę 10cc do igły, wlać 10ml kolagenazy i założyć tłok. Wprowadzić kolagenazę do żyły, aż pierwsza porcja wypłynie z otwartego końca. Ponownie zacisnąć otwarty koniec i wypełniać kolagenazą do momentu umiarkowanego rozszerzenia żyły. Zbyt duże rozszerzenie prowadzi do zanieczyszczenia komórkami mięśni gładkich.
7. Delikatnie masować pępowinę.
8. Inkubować pępowinę (z założonymi kleszczykami, igłą i strzykawką) w DPBS w temperaturze 37°C przez 15 min.
9. Podczas inkubacji kontynuować kroki 1-8 z 2^nd pępowiną.
10. Po inkubacji wyjąć pępowinę ze zlewki i, trzymając ją nad probówką 50mL, odciąć koniec powyżej dolnego zacisku. Należy upewnić się, że wszystko zostało zebrane do probówki. Przepchnąć pozostałą kolagenazę przez pępowinę, następnie podłączyć strzykawkę 20cc i przepchnąć roztwór Hanksa z umiarkowanym naciskiem.
11. Jeśli komórki mięśni gładkich nie są potrzebne, utylizować pępowinę na tym etapie. W przeciwnym razie umieścić tę samą pępowinę w drugiej probówce 50mL z ~5ml kolagenazy i inkubować w 37°C przez 30-60 min.
12. Przechowywać probówki do czasu obróbki wszystkich pępowin.
13. Wirować probówki przy ~1200 rpm przez 5 min.
14. Odssać nadsącz (z wyjątkiem ~1-2 mL). Resuspendować osad w 5mls PHEC+ i wysiać do naczynia T25.
15. Inkubować w 37°C przy 5% CO₂ przez noc.
16. Następnego dnia usunąć nadsącz i zastąpić go świeżą pożywką. Jeśli występuje dużo RBC, przemyć raz medium M199, a następnie dodać PHEC+. Kontynuować inkubację w zwykły sposób, aż warstwa komórek w naczyniu stanie się konfluentna (1-4 dni). Przesiać do żelatynizowanego naczynia T75.
17. Gdy T75 stanie się konfluentne, przenieść komórki do trzech naczyń T75. Zamrozić dwie fiolki z każdego naczynia.

Uwaga: Komórki śródbłonka (nieaktywne) mają wygląd brukowany. Komórki śródbłonka bywają czasami aktywowane (wydłużone i zaostrzone) bezpośrednio po izolacji; po kilku pasażach zazwyczaj powracają do stanu nieaktywnego.

Sprzątanie

1. Bardzo ostrożnie wyrzuć igły do pojemnika na odpady ostre.
2. Wyrzuć strzykawki do dużego pojemnika na odpady biologiczne.
3. Umieść wszystkie tkanki w małej torebce na odpady biologiczne. Zamknij torebkę i zamroź w temperaturze -20° do czasu spalenia.
4. Namocz wszystkie instrumenty w środku wirubójczym przez co najmniej 10 min.
5. Dodaj podłoża inkubacyjne do zlewki z odpadami/wybielaczem. Pozostaw na co najmniej 10 min.
6. Wyrzuć podkładki laboratoryjne do odpadów biologicznych.
7. Spryskaj wnętrze i zewnętrzną stronę zlewek, blat laboratoryjny oraz pokrywę łaźni wodnej środkiem wirubójczym. Pozostaw na 10 min, a następnie wytrzyj.
8. Opłucz zlewki i instrumenty ciepłą wodą i powieś na stojaku do wyschnięcia (osusz instrumenty, aby nie zardzewiały).
9. Wylej zdekontaminowane odpady do zlewu.
10. Włóż niewykorzystane podłoża z powrotem do lodówki.
11. Wyrzuć rękawiczki do odpadów biologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1% kolagenaza			10 mL na pępowinę, ogrzane do 37 °C
Flaski do hodowli tkankowych			T75, jedna na pępowinę.
Pożywka Hanksa
nożyczki			sterylne
zlewka			sterylna
probówki 50 mL