Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

Podsumowanie

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Streszczenie

Zrozumienie obwodów neuronalnych wymaga metod umożliwiających jednoczesną rejestrację aktywności wielu neuronów. Dlain vitrobadania, jedną z obecnie dostępnych technologii jest rejestracja za pomocą płaskich macierzy wieloelektrodowych (MEA). W niniejszym materiale dokumentujemy zastosowanie MEA do badania narządu Jacobsona (VNO) myszy, który odgrywa kluczową rolę w wykrywaniu feromonów i sygnałów społecznych za pomocą zróżnicowanej populacji neuronów sensorycznych wykazujących ekspresję setek typów receptorów. Dzięki połączeniu rejestracji MEA z robotycznym systemem dozowania cieczy do podawania bodźców chemicznych możliwe jest zapisanie odpowiedzi sensorycznych dużej i zróżnicowanej populacji neuronów. Przygotowanie to pozwala na usunięcie nienaruszonego neuroepithelium VNO z myszy i stymulację zestawem substancji chemicznych lub potencjalnych ligandów przy jednoczesnym monitorowaniu aktywności elektrycznej neuronów przez kilka godzin. W związku z tym technika ta stanowi przydatną metodę oceny aktywności ligandów, a także badania właściwości neuronów receptorowych. Przedstawiamy techniki niezbędne do przygotowania nabłonka vomeronasalnego, rejestracji MEA oraz stymulacji chemicznej.

Protokół

Część 1. Aparatura do rejestracji elektrycznej

1. Używamy płaskiej macierzy wieloelektrodowej (ALA Scientific Instruments) z płaskimi elektrodami z azotku tytanu o rozmiarze 10 μm, izolowanymi azotkiem krzemu. 60 elektrod rozmieszczono w dwóch polach, z których każde stanowi siatkę 5x6 z odstępem od środka do środka wynoszącym 30 μm. (Możliwe są również inne konfiguracje; elektrody o powierzchni rejestrującej o średnicy 10 μm są lepsze od większych elektrod pod kątem izolowania aktywności pojedynczych neuronów).
2. Sygnały elektryczne są wzmacniane (wzmocnienie 1000x) za pomocą wzmacniacza MEA 1060 (ALA Scientific Instruments). Sygnały są rejestrowane z częstotliwością 10 kHz przy użyciu karty akwizycji danych (National Instruments) oraz dedykowanego oprogramowania do akwizycji danych (można również zakupić oprogramowanie komercyjne).
3. Tkanka jest dociskana do MEA za pomocą nylonowej siatki (53 μm), która jest przymocowana do specjalnej wkładki ściśle dopasowanej do pierścienia rurki hodowlanej MEA.

Część 2. Instrumentacja do dozowania cieczy

1. Tkanka wymaga ciągłej superfuzji, którą zapewniamy poprzez podawanie roztworu Ringera (115 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM NaHCO₃, 10 mM HEPES oraz 10 mM D-(+)-glukozy) za pomocą pompy HPLC. Bodźce są podawane poprzez wtryskiwanie do zaworu HPLC i przełączanie między przepływem bezpośrednim a pętlą. Zarówno pompa HPLC, jak i pompa strzykawkowa robota do iniekcji są zasilane roztworem Ringera.
2. Roztwór Ringera jest przechowywany w podgrzewanej kąpieli wodnej (ISOTEMP 105) w temperaturze 42° C przez cały czas trwania eksperymentu i jest stale napowietrzany mieszanką 95% O₂ / 5% CO₂. Osobna kolba z roztworem Ringera bez glukozy jest przygotowywana do zasilania pompy strzykawkowej. Roztwór Ringera jest dostarczany do tkanki za pomocą pompy 307 HPLC (Gilson) z prędkością 3 mL/min. W typowym eksperymencie trwającym 5-6 godzin wystarcza 1 L każdego z roztworów Ringera.
3. Przez cały czas trwania eksperymentu tkanka jest poddawana ciągłej superfuzji roztworem Ringera o temperaturze 37°C. Sonda grzewcza jest umieszczona bezpośrednio nad tkanką.
4. Bodźce są podawane za pomocą ramienia robotycznego Gilson 215 Liquid Handler. Bodźce są przechowywane w szklanych fiolkach z gumowymi korkami, a ramię robotyczne, sterowane oprogramowaniem Gilson, podaje bodźce do linii perfuzyjnej przy zachowaniu stałego przepływu i ciśnienia.
5. Stan zaworu HPLC (pętla załączona/odłączona) jest reprezentowany przez napięcie elektryczne, które jest rejestrowane przez komputer akwizycyjny jako dodatkowy kanał w celu zapewnienia synchronizacji z aktywnością neuronalną.

Część 3. Przygotowanie MEA i urządzenia do podawania bodźców

1. Przed przystąpieniem do sekcji napełnić dołek MEA roztworem BSA w dH2O na co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przepłukać MEA napowietrzonym, ciepłym roztworem Ringera, a następnie umieścić MEA na lodzie.
3. Przygotować system dozowania cieczy oraz pompę HPLC zgodnie z instrukcjami producenta.

Część 4. Disekcja VNO

1. Przed przystąpieniem do sekcji napełnić 2 szalki Petriego o wymiarach 60x15 mm napowietrzonym roztworem Ringera i umieścić je na lodzie. Napełnić również 2 szalki Petriego o tym samym rozmiarze, powlekane Sylgardem, roztworem Ringera i umieścić je na lodzie. Schłodzić dodatkowe 50mL uprzednio podgrzanego i napowietrzonego roztworu Ringera do wykorzystania podczas sekcji.
2. Myszy uśmierca się poprzez uduszenie CO₂, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych.
3. Wykonać obustronne nacięcia od kącików pyska, prowadząc je równolegle do linii żuchwy, w kierunku tyłu głowy. Połączyć oba nacięcia z tyłu szyi i usunąć grzbietową część głowy, pozostawiając żuchwę przytwierdzoną do ciała myszy.
4. Za pomocą precyzyjnych nożyczek przeciąć tkankę po obu stronach kości szczęki górnej, aby oddzielić tkankę od kości.
5. Używając pęsety nr 3, oddzielić tkankę podniebienia, aby odsłonić jamę nosową.
6. Używając małych nożyczek lub skalpela, przeciąć tkankę między dwoma górnymi siekaczami oraz po ich obu stronach, aby uwolnić torebkę narządu jamisto-nosowego od kości.
7. Używając pęsety nr 3, chwycić torebkę narządu jamisto-nosowego za płaską kość i umieścić ją w szalce Petriego na lodzie. Wszystkie etapy aż do zanurzenia powinny zostać wykonane w czasie krótszym niż 3 minuty.
8. Umieścić szalkę pod stereomikroskopem z oświetleniem odbitym. Usuwać torebkę kostną z każdego narządu jamisto-nosowego osobno, używając pęsety nr 3. Jedną ręką stabilizować torebkę kostną, chwytając ją za koniec ogonowy, a drugą ręką oddzielać kość od narządu jamisto-nosowego, dbając o to, aby go nie uszkodzić.
9. Po usunięciu kości przenieść narząd jamisto-nosowy do szalki Petriego powlekanej Sylgardem. Pozostałą szalkę wykorzystać dla drugiego narządu jamisto-nosowego. Zmienić oświetlenie na prześwietlające.
10. Używając mikronożyczek lub pęsety nr 5, oddzielić narząd jamisto-nosowy od naczynia krwionośnego, przecinając wzdłuż jego krawędzi. W tym momencie warstwa neuronów zostanie całkowicie oddzielona od naczynia krwionośnego.
11. Ułożyć narząd jamisto-nosowy stroną wewnętrzną (dendrytyczną) do góry. Używając pęsety nr 3, przymocować narząd jamisto-nosowy do Sylgardu w narożniku tkanki. Oddzielić nabłonek neuronowy od błony podstawnej, używając małego fragmentu żyletki powlekanej teflonem zamocowanej w zacisku. Najlepiej trzymać ostrze pod małym kątem (< 30° względem powierzchni szalki).
12. Używając szklanej pipety, przenieść fragment nabłonka neuronowego z szalki na MEA. Ułożyć narząd jamisto-nosowy na polu elektrod stroną dendrytyczną do góry. Usunąć nadmiar roztworu Ringera za pomocą pipety. Umieścić siatkowy uchwyt do tkanek w otworze matrycy, aby ustabilizować narząd jamisto-nosowy, a następnie wypełnić schłodzonym roztworem Ringera.

Część 5. Rejestracja

1. Umieść MEA w wzmacniaczu MEA 1060 i ustaw sondę grzejną bezpośrednio nad tkanką.
2. Aby potwierdzić prawidłowe rozmieszczenie sondy grzejnej, przeprowadź stymulację roztworem Ringera zawierającym 50 mM potasu (zastępującym ekimolarny sód) przez 2 sekundy. Skoryguj położenie sondy tak, aby zminimalizować opóźnienie odpowiedzi neuronalnej na roztwór potasu.
3. Przed rozpoczęciem rejestracji przepłukuj tkankę podgrzanym roztworem Ringera przez 45 minut do 1 godziny, aby umożliwić jej aklimatyzację.
4. Sygnały elektryczne są zapisywane na dysku przy użyciu specjalistycznego oprogramowania do rejestracji.

Część 6. Analiza danych

1. Analizę danych w trybie offline można przeprowadzić, korzystając z surowych zapisów elektrodowych. Przykładowo, mierzymy zmiany częstotliwości wyładowań zarejestrowanych komórek w odpowiedzi na konkretne ligandy. Powstałe zestawy danych są obszerne i mogą służyć do odpowiedzi na wiele różnych pytań; wymagana jest znajomość języka programowania lub analizy danych (C, Matlab, R, Python lub podobnego).

Część 7. Reprezentatywne wyniki

Przygotowany preparat jest zazwyczaj wystarczająco stabilny, aby prowadzić pomiary przez 6 godzin, co pozwala na uzyskanie znacznej ilości danych (6 godzin rejestracji z 60 elektrod).

Rysunek 1. Przedstawiono migawkę jednoczesnej aktywności w obrębie jednej połowy macierzy. Okno czasowe obejmuje 400 ms. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Rycina 2. W typowym eksperymencie stymulujemy wybranymi związkami przez 10 sekund. Ten zapis jest przykładem odpowiedzi na 100-krotnie rozcieńczony mocz samicy myszy. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Dyskusja

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) umożliwiają monitorowanie jednoczesnej aktywności dużej populacji neuronów. Jest to przydatne narzędzie do badania właściwości systemu sensorycznego, a konkretnie organu vomeronasalnego (VNO). W przeciwieństwie do głównego systemu węchowego, VNO wykrywa bodźce w fazie ciekłej. Ponadto VNO jest tkanką heterogenną. U myszy występuje około 300 różnych typów receptorów¹, prawdopodobnie o różnych profilach odpowiedzi. Rejestracje MEA w połączeniu z ramieniem roboty...