Ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Podsumowanie

Niniejszy test ocenia zdolność cząsteczki sygnałowej, w tym przypadku białka morfogenetycznego kostnego 7 (BMP7), do zmiany kierunku wzrostu aksonów komisuralnych. Eksplant embrionalnego grzbietowego rdzenia kręgowego jest hodowany obok agregatu komórek COS wydzielających badane czynniki wzrostu. Zmiana kierunku wzrostu aksonów komisuralnych w obrębie eksplantu jest wizualizowana za pomocą immunohistochemii.

Streszczenie

Aksony komisuralne grzbietowe w rdzeniu kręgowym kręgowców¹ stanowiły nieoceniony system modelowy do identyfikacji sygnałów prowadzących aksony. W niniejszym opracowaniu opisujemy in vitro test, „test reorientacji”, który był szeroko stosowany do badania wpływu sygnałów zewnętrznych i wewnętrznych na orientację aksonów komisuralnych²Test ten został opracowany przez wiele osób w laboratoriach Jane Dodd, Thomasa Jessella i Andrew Lumsdena (szczegóły znajdują się w podziękowaniach), a jego wersje wykorzystano do wykazania aktywności reorientacyjnej kluczowych cząsteczek kierujących wzrostem aksonów, w tym chemorepellentu BMP w płycie dachowej.^3,4 or aktywność chemoattrakcyjna Netrin1⁵ oraz Sonic Hedgehog (Shh)⁶ w płytce dna rdzenia kręgowego.

Eksplanty obejmujące 2-3 segmenty tylnych dwóch trzecich rdzenia kręgowego są wycinane od szczurów w 11. dniu embrionalnym (E11) i hodowane w trójwymiarowych żelach kolagenowych⁷. Eksplanty tylnej części rdzenia z E11 zawierają nowo powstałe neurony komisuralne, które można zidentyfikować po ekspresji glikoproteiny Tag1 w ich aksonach⁸. W ciągu 30-40 godzin hodowli w tych eksplantach tylnych odtwarzana jest trajektoria aksonów komisuralnych w czasie zbliżonym do tego, który obserwuje się in vivo. Trajektoria ta może zostać poddana badaniu poprzez umieszczenie tkanek testowych lub agregatu komórek COS wykazujących ekspresję kandydowanej cząsteczki sygnałowej w kontakcie z jedną z bocznych krawędzi eksplantu tylnego. Aksony komisuralne rozrastające się w sąsiedztwie dołączonej tkanki będą rosnąć pod wpływem zarówno endogennej płyty dachowej, jak i sygnałów z ektopowej tkanki bocznej. Stopień, w jakim aksony komisuralne zmieniają orientację w tych okolicznościach, można poddać kwantyfikacji. Dzięki zastosowaniu tego testu możliwe jest zbadanie zarówno wystarczalności konkretnego sygnału do zmiany orientacji aksonów komisuralnych^3,4, jak i konieczności wystąpienia tego sygnału dla kierowania trajektorią komisuralną⁹.

Protokół

Część 1: Przygotowanie agregatów transfektowanych komórek COS przy użyciu metody wiszących kropli

1. Wysiać komórki COS-7 (COS) w szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm. Po osiągnięciu 80% konfluencji przeprowadzić transfekcję komórek 1 μg plazmidu ekspresyjnego przy użyciu Lipofectamine2000 zgodnie z protokołem producenta.
2. Aby przygotować krople wiszące, odessać medium do transfekcji i opłukać przetransfekowane komórki COS 1 ml 1x roztworu buforu fosforanowego (PBS). Traktować komórki 0,5 ml medium do dysocjacji komórek bez enzymów przez 15 minut. Dodać 1 ml roztworu Opti-MEM + 1x Penicylina/Streptomycyna/Glutamina (P/S/G) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zatrzymać reakcję.
3. Poddać komórki tryturacji w celu usunięcia ich z powierzchni szalki hodowlanej i przenieść do stożkowej probówki o objętości 15 ml. Wirować przez 2 minuty przy 2000 g, aby uzyskać osad komórkowy. Usunąć nadosad i resuspendować osad w 100 μl Opti-MEM + 1x P/S/G + 10% FBS.
4. Nanieść kilka kropel o objętości 20 μl na wewnętrzną stronę pokrywki szalki hodowlanej 35 mm, odwrócić pokrywkę, położyć ją na dnie szalki i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37°C przez kilka godzin aż do zagregowania komórek.

Część 2: Przygotowanie eksplantów grzbietowej części rdzenia kręgowego

1. Wypreparuj embriony szczura w stadium E11 z macicy matki i przechowuj na lodzie w medium L15 do momentu użycia.
2. Za pomocą zaostrzonej igły wolframowej usuń odcinek obejmujący 4–6 segmentów z tułowia każdego embrionu, z obszaru bezpośrednio poniżej pączka kończyny przedniej. Używając plastikowej pipety, zbierz fragmenty tkanki do jednej studni 4-studziennej płytki Nunc i przechowuj na lodzie.
3. Po wypreparowaniu wszystkich segmentów embrionów, za pomocą plastikowej pipety przenieś fragmenty do roztworu 1 ml L15 + 1 mg dyspazy w drugiej studni płytki Nunc. Inkubuj w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 5 minut. Nie inkubuj fragmentów tkanki z dyspazą zbyt długo.
4. W czasie inkubacji dodaj 0,5 ml uprzednio inaktywowanego termicznie normalnego surowicy koziej (HIGS) do około 10 ml L15 w czalce Petriego i wymieszaj przez delikatne potrząsanie. Przenieś 1 ml tego roztworu do trzeciej studni płytki Nunc i po zakończeniu inkubacji przenieś do niej fragmenty tkanki. Przechowuj na lodzie. Uwaga: późniejsza dyssekcja będzie łatwiejsza, jeśli fragmenty tkanki „odpoczywają” na lodzie przez godzinę.

Część 3: Przygotowanie kolagenu

1. Do 360μl kolagenu dodać 40μl 10x Minimal Essential Medium, wymieszać szybko i dokładnie poprzez potrząsanie probówką lub krótkie wirowanie w wiertaku. Szybko odwirować w picofuge. Roztwór będzie miał żółty kolor. Przechowywać na lodzie tak długo, jak to możliwe.
2. Dodać odpowiednią ilość 0,8M wodorowęglanu sodu (NaHCO₃), aby roztwór kolagenu stał się lekko pomarańczowy (patrz uwaga poniżej). Ponownie wymieszać szybko i dokładnie przez potrząsanie, a następnie krótko odwirować w picofuge. Jeśli po wymieszaniu roztwór pozostaje różowy, oznacza to, że dodano zbyt dużo NaHCO₃ i należy powtórzyć procedurę z nową probówką kolagenu.
3. W tym momencie roztwór kolagenu jest przygotowany. Pozostanie on w stanie ciekłym na lodzie, ale zestali się w ciągu około 5 minut (przybierając różowy kolor) po doprowadzeniu do temperatury pokojowej.
4. Nanieść 20μl kolagenu do każdej studzienki 4-dołkowej płytki Nunc. Za pomocą końcówki pipety rozprowadzić kolagen, aby utworzyć małą „podkładkę”. Pozostawić kolagen do zastygnięcia w temperaturze pokojowej.

Uwaga: Dokładna ilość NaHCO₃ musi zostać wymCtitrowana dla każdej partii kolagenu. Należy zacząć od małej ilości (11μl), a następnie dodawać po 0,5-1μl stopniowo, aż roztwór uzyska lekko pomarańczowy odcień. „Właściwa” ilość to zazwyczaj 1ul mniej niż najmniejsza ilość NaHCO₃, która sprawiłaby, że kolagen stałby się różowy. Ilość NaHCO₃ nie skaluje się liniowo w górę ani w dół.

Część 4: Disekcja eksplantów grzbietowej części rdzenia kręgowego i ich rozmieszczenie z agregatami komórek COS w macierzy kolagenowej

1. Używając nowo zaostrzonej igły wolframowej i precyzyjnej pęsety (#5 lub #55), usunąć mezodermę otaczającą rdzeń kręgowy.
2. Przecinając równolegle do płytki podłoża za pomocą igły wolframowej, ostrożnie usunąć brzuszną piątą część rdzenia kręgowego.
3. Przeciąć grzbietowy eksplant rdzenia na pół, dbając o to, aby krawędzie były odcięte jak najdokładniej. W razie potrzeby ponownie przyciąć krawędzie. Przenieść każdy grzbietowy eksplant rdzenia na oddzielne podkładki kolagenowe, używając pipety ustnej z dopasowaną szklaną kapilarą o średnicy ok. 0,5mm.
4. Wyciąć agregat transfekowanych komórek COS w kwadraty o szerokości zbliżonej do szerokości bocznej krawędzi grzbietowego eksplantu rdzenia.
5. Przenieść jeden z tych kwadratów na podkładkę kolagenową z grzbietowym eksplantem rdzenia, używając pipety ustnej.
6. Za pomocą pipety ustnej odessać nadmiar cieczy. Nie odsysać zbyt dużego wolumenu.
7. Nanieść 4μl przygotowanego kolagenu na podkładkę, a następnie za pomocą igły wolframowej rozprowadzić kolagen nad eksplantami, nie dotykając bezpośrednio tkanki. Przesuwając igłę wolframową w kolagenie wokół eksplantów, ustawić je tak, aby agregat komórek COS znajdował się przylegać do bocznej krawędzi grzbietowego eksplantu rdzenia.
8. Po zastygnięciu kolagenu powtórzyć aplikację 4μl kolagenu, aby upewnić się, że eksplanty są całkowicie zatopione w kolagenie.
9. W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 0,5ml Opti-MEM + 1xP/S/G i inkubować przez 30-40 godzin.
10. Utrwalić eksplanty przez 45 minut w 0,5ml 4% paraformaldehydu w 1xPBS, trzymając płytkę na lodzie.
11. Przemyć dwukrotnie 0,5ml roztworu blokującego składającego się z 1xPBS + 0,1% Triton-X100 + 1% HIGS (PBTN). Blokować w temperaturze 4°C przez co najmniej kilka godzin (preferowana inkubacja nocna), a następnie poddać analizie immunohistochemicznej.

Część 5: Wizualizacja aksonów komisuralnych za pomocą immunohistochemii

1. Po blokowaniu w PBTN, wyciąć eksplanty z płytki 4-dołkowej za pomocą pęsety i umieścić je w płytce 48-dołkowej.
2. Do każdej dołki dodać 200μl przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze 4°C. W celu wizualizacji aksonów komisuralnych należy użyć roztworu przeciwciał mysich anty-Tag1 w rozcieńczeniu 1:6. Aby sprawdzić, czy transfekcja przebiegła pomyślnie, należy również zastosować przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko testowanej cząsteczce sygnałowej lub odpowiedniemu epitopowi, jeśli cząsteczka sygnałowa została znakowana epitopem.
3. Każdą próbkę płukać 5 razy przez 1 godzinę w PBTN w temperaturze 4°C.
4. Do każdej dołki dodać 200μl przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Jeśli jako przeciwciało pierwszorzędowe zastosowano przeciwciała anty-Tag1, należy użyć kozich przeciwciał drugorzędowych anty-mysich IgM sprzężonych z FITC lub Cy3. W przypadku użycia światłoczułych przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z FITC lub Cy3, od tego momentu płytkę 48-dołkową należy trzymać przykrytą folią aluminiową.
5. Każdą próbkę płukać 5 razy przez 1 godzinę w PBTN w temperaturze 4°C.
6. Przenieść eksplant na szkiełko z 3 wgłębieniami, usunąć nadmiar cieczy, zamontować w medium Vectashield i przykryć szkiełkiem cover-slip. Przechowywać w ciemnym pudełku w temperaturze 4°C lub -20°C.

Część 6: Reprezentatywne obrazy eksplantów

W udanym eksperymencie eksplant i agregat COS pozostaną przylegać do siebie i nie rozdzielą się podczas zestalania kolagenu. Przerost aksonów będzie minimalny; znaczny przerost aksonalny wskazuje na zbyt długą hodowlę eksplantu grzbietowej części rdzenia kręgowego. Z eksplantu nie będą wyrastać pęcherzyki; pęcherzykowanie występuje, gdy tkanka wejdzie w bezpośredni kontakt z pożywką hodowlaną.

Zdolność cząsteczki sygnałowej do reorientacji aksonów ocenia się za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stopień reorientacji aksonów można określić ilościowo, mierząc średni kąt reorientacji aksonów znajdujących się najbliżej agregatu komórek COS³. Jak pokazano na Ryc. 1, komórki COS wykazujące ekspresję BMP7 z tagiem myc (niebieskie) reorientują aksony komisuralne Tag1⁺ (zielone) w kierunku przeciwnym do źródła BMP7 (Ryc. 1B), podobnie jak dzieje się w przypadku eksplantu płyty dachowej, który odpycha aksony komisuralne (Ryc. 1A). Komórki COS wykazujące ekspresję wektora kontrolnego nie mają wpływu na orientację aksonów komisuralnych^3,4. Eksplanty te zostały również znakowane przeciwciałami przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu Isl1/2 (czerwone), który barwi neurony ruchowe i interneurony grzbietowe. Wynik ten był pierwszą wskazówką, że jeden z członków rodziny BMP pośredniczy w aktywności chemorepellentu płyty dachowej³.

Rysunek 1: Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Dyskusja

Kluczowymi czynnikami warunkującymi powodzenie tego testu są po pierwsze: tkanka nie powinna być traktowana dyspazą przez zbyt długi czas, ponieważ takie działanie spowoduje, że tkanka stanie się bardzo lepka, a jej żywotność spadnie. Po drugie: kolagen musi być idealnie przygotowany i w miarę możliwości przechowywany w lodzie. W przypadku rozpoczęcia procesu żelowania (zmiany barwy na różową) jego manipulacja stanie się coraz trudniejsza. Po trzecie: igła wolframowa musi być zawsze bardzo ostra.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagen z ogona szczura typu 1	BD Biosciences	354236
Komórki COS-7	ATCC	CRL-1651
10x Minimal Essential Medium	Invitrogen	11430-030
Opti-MEM	Invitrogen	51985-034
L15	Invitrogen	11415-064
Lipofectamine 2000	Invitrogen	1166-8019
Płodowa surowica bydlęca	Mediatech, Inc.	35-016-CV
Roztwór do dysocjacji komórek	EMD Millipore	S-004-C
Trypsyna 0.25% EDTA	Invitrogen	2520-0056
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S6297
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Pen/Strep/Glutamate	Invitrogen	10378-016
Paraformaldehyd	Baker/VWR	JTS898-7
Dyspaza	Roche Group	10241750001
mysi przeciwciało anty-Tag1 IgM (4D7)	Developmental Studies Hybridoma Bank
mysi przeciwciało anty-Myc IgG (9E10)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-40
kozie przeciwciało anty-mysie IgM FITC	Jackson	115-095-075
kozie przeciwciało anty-mysie Fcy Cy3	Jackson	115-165-071
Surowica kozia	Invitrogen	16210064
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Szybka Nunclon 4-dołkowa	Nalge Nunc international	62407-068
Szkiełko z 3 wgłębieniami	VWR international	48339-009
Płytka 48-dołkowa	Falcon BD	62406-195
Zestaw rurki aspiracyjnej	FHC, Inc.	30-32-0
Pinceta Dumont nr 55	Fine Science Tools	11252-20
Pinceta Dumont nr 5	Fine Science Tools	11255-20
Igłotrzymacz	Fine Science Tools	26016-12