Izolacja labilnych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego in vivo sieciowania komórkowego i immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Summary

Przepuszczalny dla komórek środek sieciujący DSP [dithiobis-(propionian sukcynimidylu)] stabilizuje przejściowe i labilne interakcje in vivo, co pozwala na ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksu białkowego. W tym miejscu przedstawiono technikę sieciowania komórek hodowanych w hodowli, a następnie izolacji kompleksów białkowych za pomocą immunoprecypitacji.

Abstract

Dynamiczna natura maszynerii komórkowej jest często budowana na przejściowych i/lub słabych asocjacjach białek. Te oddziaływania o niskim powinowactwie wykluczają rygorystyczne metody izolacji i identyfikacji sieci białkowych wokół białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie chemicznych środków sieciujących pozwala na selektywną stabilizację labilnych oddziaływań, omijając w ten sposób biochemiczne ograniczenia oczyszczania. Tutaj przedstawiamy protokół możliwy do zaakceptowania dla komórek w hodowli, który wykorzystuje homobifunkcyjny środek sieciujący z ramieniem dystansowym 12 A, ditiobis-(sukcynimidyloproprionian) (DSP). DSP jest rozszczepiany przez redukcję wiązania dwusiarczkowego obecnego w cząsteczce. Sieciowanie w połączeniu z chromatografią powinowactwa immunologicznego badanych białek za pomocą kulek magnetycznych pozwala na izolację kompleksów białkowych, które w przeciwnym razie nie wytrzymałyby oczyszczania. Protokół ten jest kompatybilny ze zwykłymi technikami western blot i może być skalowany w celu identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas¹.

Stephanie A. Zlatic i Pearl V. Ryder w równym stopniu przyczyniły się do tej pracy.

Protocol

1. Przygotowanie do sieciowania

1. Będziesz musiał pokryć wystarczającą liczbę komórek, aby umożliwić izolację 500 μg białka na reakcję w probówce standardowej. Pojedyncza probówka może wystarczyć do identyfikacji przypuszczalnych interaktorów białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą immunoblot. W takim przypadku materiał związany z kulkami można eluować za pomocą buforu próbki SDS-PAGE (immunoprecypitacja). W przypadku analizy spektrometrii mas liczba standardowych reakcji powinna być zwiększona co najmniej dziesięciokrotnie, a kompleksy białkowe powinny być eluowane przez konkurencję z antygenem peptydowym rozpoznawanym przez zastosowane przeciwciało (chromatografia immunopowinowactwa). Strategia ta pozwoli na wyizolowanie kompleksów białkowych wolnych od immunoglobuliny.
2. Optymalna gęstość komórek do sieciowania wynosi od 75% do 90% zbiegu. W warunkach wysokiej konfluencji komórki mają tendencję do gromadzenia się na sobie, co zmniejsza dostęp do przepuszczalnego dla komórek środka sieciującego dla wszystkich komórek.
3. Typ komórki i warunki eksperymentalne powinny być oznaczone na spodzie płytki komórkowej. Rutynowo dołączamy sterowanie samym pojazdem.
4. Przygotuj wszystkie roztwory OPRÓCZ roztworu DSP przed sieciowaniem.
   1. Przed rozpoczęciem doświadczenia przygotować zapas buforowanego fosforanem buforu soli fizjologicznej z CaCl₂ 0,1 mM i CaCl₂ 1 mM (PBS/Ca/Mg). Dodanie jonów wapnia i magnezu ma kluczowe znaczenie dla przylegania komórek do płytki hodowlanej w trakcie trwania eksperymentu. Przechowywać w temperaturze 4°C.
   2. 50X Complete Protease Inhibitor Cocktail - 1 tabletka rozpuszczona w 1 ml wody Milli-Q. Przechowywać w temperaturze -20°C.
   3. 20% Triton X-100 Odważyć 10g Triton X -100 i rozcieńczyć w całkowitej objętości 50 ml wody Milli-Q. Kołysz w temperaturze 4°C przez noc i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu użycia. Nie przechowywać dłużej niż 1 miesiąc. Rozcieńczenia tego 20% zapasu należy użyć do przygotowania do lizy i IP opisanych poniżej.
   4. 50X roztwór hartowniczy DSP 1M TRIS do pH 7,4. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   5. Przygotuj 10x roztwór buforu A.
      10X Bufor A:
      • 50 ml 1 M HEPES.
      • 150 ml 5 M NaCl
      • 10 ml 0,5 M EGTA
      • 250 μL 2 M MgCl₂
      • Dostosuj pH do 7,4
      • Doprowadzić końcową objętość do 500 ml
      Roztwór 10X Bufor A rozcieńcza się do 1X Bufor A w razie potrzeby.
      1x Bufor A jest również stosowany w lizatów i immuno-magnetyczno-strącających.
      Bufor A 1X
      • 10 mM Hepes
      • 150 mM NaCl
      • 1 mM EGTA
      • 0,1 mM MgCl₂
      • Odczyn pH 7,4
   6. Bufor do lizy 1X Bufor A + 0,5% Triton X-100.
   7. Immunomagnetyczny bufor strącający (bufor IP) 1X Bufor A + 0,1% Triton X-100.

2. Przygotowanie rozwiązania sieciującego

1. Przygotuj roztwór DSP bezpośrednio przed nałożeniem na komórki. DSP jest wysoce hydrofobowy i powinien zostać rozpuszczony w DMSO przed rozcieńczeniem do buforu PBS / Ca / Mg. Rozpuścić 40 mg DSP w 1 ml DMSO. Daje to 100 mM roztwór DSP (masa cząsteczkowa DSP wynosi 404.42 g/mol).
2. Podgrzać odpowiednią objętość PBS/Ca/Mg do temperatury 37°C, aby ułatwić rozcieńczenie DSP/DMSO do PBS.
   Objętości potrzebne do różnych rozmiarów płytek:
   płytka 6-dołkowa 2 ml na dołek
   10 cm płytka 10 ml na płytkę
   15 cm płytka 20 ml na płytkę
3. Dodać 10 μl roztworu podstawowego DSP/DMSO na każdy 1 ml ciepłego PBS/Ca/Mg. Dodawaj roztwór podstawowy DSP/DMSO kropla po kropli, powtarzając mieszanie, aż cały DSP się rozpuści. Przygotować roztwór kontrolny składający się z 10 μl DMSO dodawanych do każdego 1 ml PBS/Ca/Mg.
4. Umieścić wszystkie roztwory PBS/Ca/Mg w lodowatej łaźni wodnej nie dłużej niż 10 minut.

3. Przygotuj komórki do sieciowania

1. Przygotuj kąpiel lodowo-wodną, w której zmieszczą się wszystkie płytki do sieciowania lub inkubacji kontrolnej pojazdu.
2. Wziąć płytki z inkubatora o temperaturze 37°C i natychmiast umieścić je w łaźni lodowato-wodnej.
3. Umyć komórki dwa razy lodowatym PBS/Ca/Mg. Użyć tej samej objętości, której użyjesz do inkubacji środka sieciującego (patrz sekcja 2.2).
4. Usuń drugie mycie i dodaj roztwór bufora sieciującego sterowanie pojazdem lub DSP.
5. Inkubować na lodzie przez dwie godziny. Należy sprawdzać płytki mniej więcej co dwadzieścia minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem. Możesz zauważyć, że niewielka ilość osadu DSP wytrąca się z roztworu. To normalne.

4. Dezaktywacja reakcji DSP

1. Przygotuj 1X roztwór hartujący DSP o 20 mM Tris pH 7,4 w PBS/Ca/Mg (20 μL 1 M Tris pH 7,4 na każdy 1 ml PBS/Ca/Mg).
2. Usuń rozwiązania sterujące i sieciujące pojazd.
3. Dodaj lodowaty roztwór inaktywacyjny i inkubuj na lodzie przez 15 minut.

5. Liza komórek

1. Podczas inkubacji z hartowaniem DSP należy przygotować bufor do lizy komórek 0,5% Triton X-100 w buforze A z kompletnym koktajlem inhibitorów proteazy. Dodać 20 μl 50X roztworu podstawowego Complete na każdy 1 ml buforu do lizy.
2. Po 15-minutowej inkubacji z hartowaniem DSP przemyć komórki dwa razy PBS/Ca/Mg.
3. Dodaj bufor do lizy + Complete do komórek i rozdrabniaj w temperaturze 4°C przez 30 minut. Kilka sugerowanych objętości buforu do lizy dla różnych rozmiarów płytek:
   • Płytka 6-dołkowa 0,5 ml na dołek
   • Talerz 10 cm, 1 ml na talerz
   • Talerz 15 cm, 1 ml na talerz
4. Po lizie użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki z płytki. Pamiętaj, aby trzymać lizaty na lodzie, aby zminimalizować aktywność proteazy
5. Wirowanie komórek odbywa się w lizie przez 15 minut w temperaturze 4°C w miniwirówce stołowej z maksymalną prędkością (15 000 x g).
6. Odpipetować supernatant do świeżej probówki. Wyrzuć granulkę.
7. Przeanalizuj poziomy białka i przystąp do immunoprecypitacji.

6. Przygotowanie immunomagnetycznych koralików do strącania

Uwaga: Ten etap zwykle rozpoczyna się bezpośrednio po rozpoczęciu 2-godzinnej inkubacji sieciowania.

1. Połączyć 30 μl kulek immunomagnetycznych Dynal, 500 μl buforu IP (1x bufor A + 0,1% Triton X-100) i odpowiednią ilość przeciwciała specyficznego dla antygenu z zakręcanymi probówkami wirówkowymi. Przygotować probówki z przeciwciałami bez przeciwciał i nieswoiste do kontroli ujemnych. Odpowiednią ilość przeciwciał należy określić na podstawie poszczególnych antygenów podczas oddzielnych doświadczeń. Oznacz wszystkie lampy IP.
2. Pozwól lampom IP inkubować się w kołysku typu end-over-end w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Alternatywnie, inkubować probówki IP z przeciwciałem przez noc w temperaturze 4° dzień przed sieciowaniem.
3. Po inkubacji wykonaj szybkie 10-sekundowe mini-wirowanie, aby zebrać kulki na dnie probówki.
4. Wsuń rurki do uchwytu magnetycznego, który odciągnie koraliki magnetyczne od spodu rurki. Mając kulki bezpiecznie usunięte z drogi, możesz teraz łatwo zmyć wszelkie niezwiązane przeciwciała.
5. Użyj końcówki aspiratora o małym otworze, takiej jak końcówka do ładowania żelu lub końcówka p200, aby usunąć bufor inkubacyjny i wszelkie niezwiązane przeciwciała. Jak tylko objętość inkubacji zostanie usunięta, dodać 1 ml buforu IP.
6. Zakryj probówkę, delikatnie ponownie zawieś koraliki i inkubuj wszystkie probówki IP w temperaturze pokojowej przez 5 minut z obrotem od końca do końca.
7. Powtórz 5-minutowy krok mycia (kroki od 6.3 do 6.6) jeszcze raz ze świeżym mililitrem bufora IP.
8. Probówki IP mogą pozostać w ostatniej inkubacji płukania, dopóki usieciowany lizat nie będzie gotowy do dodania do kulek.

7. Inkubuj usieciowany lizat za pomocą kulek immunomagnetycznych

1. Po ostatnim praniu odwiruj kulki immunomagnetyczne, w dół w mini-wirówce przez 10 sekund. Następnie przystąp do wsunięcia rurek do uchwytu magnetycznego.
2. Ponownie, używając końcówki aspiracyjnej o małym otworze, usuń objętość inkubacji z rurki. Natychmiast dodać 500 μl usieciowanego lizatu komórkowego (zakładając lizat na poziomie 1 μg/ml) do probówek zawierających kulki immunomagnetyczne. Jeśli będziesz używać konkurencji peptydowej jako kontroli negatywnej, w tym momencie należy uwzględnić odpowiednią ilość peptydu. Należy przeprowadzić wcześniejsze eksperymenty w celu określenia odpowiednich warunków konkurencji peptydów. Alternatywnie możesz chcieć mieć kulki immunomagnetyczne wolne od lizatu jako kontrolę negatywną. W takim przypadku do kulek immunomagnetycznych natychmiast dodać 500 μl buforu lizatu (1x bufor A + 0,5% Triton X-100) + Complete.
3. Delikatnie zawieś koraliki. Zawieszone kulki należy inkubować pod kątem 4° w obrocie od końca do końca przez 2 godziny.

8. Umyj niezwiązany lizat z koralików

1. Gdy lizat będzie miał wystarczający czas inkubacji, wykonaj szybkie, 10-sekundowe wirowanie w mini-wirówce. Następnie wsuń rurki do uchwytu magnetycznego. Uchwyt magnetyczny powinien być przechowywany w łaźni lodowej do końca eksperymentu.
2. Za pomocą końcówki aspiratora o małym otworze usuń cały niezwiązany lizat. Natychmiast po usunięciu całego niezwiązanego lizatu dodać 1 ml buforu IP.
3. Zakręć tubkę i delikatnie zawieś koraliki.
4. Po ponownym zawieszeniu kulek powtórz etap granulowania kulek (8.1).
5. Ponownie odessać całą objętość inkubacji i natychmiast dodać 1 ml buforu IP, a następnie zakryć probówkę.
6. Delikatnie zawieś koraliki w buforze IP. Inkubuj zawieszone koraliki przez 5 minut w temperaturze 4° z kołysaniem od końca do końca.
7. Powtórz kroki mycia ściegu (od 8.4 do 8.6) jeszcze 4 razy.

9. Denaturyzacja próbki i zbieranie z koralików

1. Po umyciu wszystkich immunomagnetycznych probówek do wytrącania, należy ponownie zastąpić kulki (8.1) i wsunąć probówki do uchwytu magnetycznego.
2. Białka związane z kulkami immunomagnetycznymi są usuwane w warunkach denaturacji. Odessać ostatnie płukanie bufora IP i wyjąć rurkę IP z uchwytu magnetycznego.
3. Dodaj 1x bufor próbki żelu do probówki IP tuż nad granulką kulki, aby ponownie zebrać kulki na dnie probówki. Ilość buforu próbki zależy od wielkości studzienki żelu, który ma być użyty. Może być konieczne delikatne stuknięcie w spód tuby, aby wszystkie kulki zostały ponownie zawieszone w buforze próbki żelu.
4. Powtórzyć proces denaturacji (9.2 do 9.3) dla każdej lampy IP.
5. Kulki immunomagnetyczne ponownie zawieszone w żelowym buforze próbki są następnie podgrzewane w temperaturze 75°C przez 5 minut, aby zakończyć proces denaturacji.
6. Po denaturacji próbki można ją uruchomić na żelu SDS-PAGE do western blotting. Opróżnione kulki immunomagnetyczne można ponownie granulować przez odwirowanie i usunąć z próbki za pomocą uchwytu magnetycznego.

10. Elucja usieciowanych kompleksów z peptydami antygenowymi (chromatografia immunopowinowactwa).

1. Po umyciu wszystkich probówek immunomagnetycznych do immunoprecypitacji, należy ponownie zatopić kulki (8.1) i wsunąć probówki do uchwytu magnetycznego. Odessać supernatant i dodać 10 μl buforu A uzupełnionego peptydem antygenowym rozpoznawanym przez przeciwciało stosowane do immunoizolacji kompleksów białkowych. Należy testować stężenia w zakresie od 10 do 200 μM, aby uzyskać skuteczną elucję.
2. Inkubować koraliki przez 2 godziny w temperaturze 4°C.
3. Umieść koraliki w stojaku magnetycznym i ostrożnie odzyskaj 10 ml eluowanego materiału. Zachowaj ten supernatant.
4. Szybko umyj koraliki buforem A i wyrzuć pranie. Zachowaj koraliki.
5. Dodać żelowy bufor do próbki do zapisanego supernatantu i kulek do stężenia 1X. Inkubować te probówki w temperaturze 75°C przez 5 minut.
6. Analizuj kulki i eluację peptydów za pomocą SDS-PAGE. Eluat powinien być wolny od IgG zarówno przez barwienie białkowe SDS-PAGE, jak i przez immunobloty (ryc. 1B). Ten materiał wolny od IgG nadaje się do spektrometrii mas.

Rysunek 1. Izolacja oddziałujących kompleksów białkowych AP-3 i białek błonowych. Komórki HEK293 (A) lub komórki PC12 (B) traktowano albo w obecności kontroli pojazdu (DMSO, nieparzyste pasy Rys. 1A) lub DSP (parzyste pasy Rys. 1A lub wszystkie pasy na Rys. 1B). Oczyszczone ekstrakty inkubowano albo z samymi kulkami (ryc. 1A, pasy 3-4), przeciwciałami przeciwko receptorowi transferyny (ryc. 1A, pasy 5-6) lub przeciwciałami δ AP-3 (ryc. 1A, pasy 7-10; Rys. 1B, pasy 1-10). Kompleksy immunologiczne eluowano buforem próbki SDS-PAGE (ryc. 1A), samym buforem A lub (ryc. 1B, tory 1-2) lub buforem A uzupełnionym rosnącymi stężeniami δ peptydu antygenowego odpowiadającego aminokwasom 680 710 ludzkiej δ-adaptyny (NCBI:AAD03777; gi:1923266)(ryc. 1B, tory 3-10). Peptyd ten wiąże δ przeciwciała. Po elucji peptydów supernatanty (S) i kulki (B) analizowano za pomocą immunoblot (ryc. 1B). AP-3, który jest wykrywany za pomocą przeciwciał przeciwko podjednostkom δ, β3 i σ3, współstrąca się z następującymi rozpuszczalnymi czynnikami: łańcuchem ciężkim klatryny (CHC), podjednostką BLOC-1 pallidyną i podjednostką kompleksu HOPS vps33b; a także białka błonowe: kinazę fosfatydyloinozytolo-4-typu II alfa (PI4KIIα) i transporter 3 (ZnT3). Zwróć uwagę na brak ciężkich łańcuchów myszy IgG w supernatancie eluowanym peptydem na ryc. 1B.

Discussion

DSP, przepuszczalny przez błonę, chemicznie redukowalny środek sieciujący z ramieniem dystansowym 12 A służy do stabilizacji przejściowych oddziaływań białkowych ^1,2,3,4. Tutaj zilustrowaliśmy tę strategię za pomocą kompleksu adaptorowego AP-3, rozpuszczalnego kompleksu białkowego, który rozpoznaje i sortuje białka błonowe w pęcherzyki z endosomów ⁵. AP-3 selektywnie wiąże się z transporterem ZnT3 i kinazą lipidową fosfatydyloinozytolo-4-kinazą typu II alfa, ale nie z receptorem transferyny ^1,4...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Invitrogen	P4417	Rozpuścić 1 tabletkę w 200 ml wody; dodać MgCl2 do końcowego stężenia 1 mM i CaCl2 do końcowego stężenia 0,1 mM
Dithiobis (propionian sukcynimidylu) (DSP)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22585	Wrażliwy na wilgoć, przechowywać w hermetycznym pojemniku 4° C
Sulftlenek dimetylu (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
Triton X-100, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	T9284
Dynabeads, Koraliki anty-mysie IgG	Invitrogen	110.31	są również dostępne jako magnes przeciw królikom
Dyna-Mag-2	dla owiec Invitrogen	123-21D