Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Podsumowanie

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Streszczenie

Dynamiczny charakter mechanizmów komórkowych często opiera się na przejściowych i/lub słabych asocjacjach białek. Te oddziaływania o niskim powinowactwie wykluczają stosowanie rygorystycznych metod izolacji i identyfikacji sieci białkowych wokół białka docelowego. Zastosowanie chemicznych czynników sieciujących pozwala na selektywną stabilizację nietrwałych oddziaływań, co pozwala ominąć ograniczenia biochemiczne podczas oczyszczania. Przedstawiamy tutaj protokół odpowiedni dla komórek w hodowli, który wykorzystuje homobifunkcyjny czynnik sieciujący z ramieniem dystansowym o długości 12 Å, ditiobis-(succinimidylopropionian) (DSP). DSP jest rozszczepiany poprzez redukcję wiązania disiarczkowego obecnego w cząsteczce. Sieciowanie w połączeniu z chromatografią immunoafinicyjną białek docelowych z użyciem kulek magnetycznych pozwala na izolację kompleksów białkowych, które w przeciwnym razie nie przetrwałyby procesu oczyszczania. Protokół ten jest kompatybilny ze standardowymi technikami western blot i może zostać przeskalowany w celu identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas¹.

Stephanie A. Zlatic i Pearl V. Ryder wniosły równy wkład w tę pracę.

Protokół

1. Przygotowanie do sieciowania

1. Należy wysiać odpowiednią liczbę komórek, aby umożliwić izolację 500 μg białka na jedną standardową reakcję w probówce. Pojedyncza probówka może być wystarczająca do identyfikacji domniemanych interaktorów białka docelowego za pomocą immunoblottingu. W takim przypadku materiał związany z kuleczkami można eluować buforem do próbek SDS-PAGE (immunoprecypitacja). Do analizy spektrometrią mas liczbę standardowych reakcji należy zwiększyć co najmniej dziesięciokrotnie, a kompleksy białkowe należy eluować poprzez konkurencję z antygenem peptydowym rozpoznawanym przez użyte przeciwciało (chromatografia immunoafinicyjna). Strategia ta pozwoli na izolację kompleksów białkowych wolnych od immunoglobulin.
2. Optymalna gęstość komórek do sieciowania wynosi od 75% do 90% konfluencji. W warunkach wysokiej konfluencji komórki mają tendencję do nakładania się na siebie, co zmniejsza dostępność przenikającego do komórek czynnika sieciującego dla wszystkich komórek.
3. Typ komórek oraz warunki eksperymentalne powinny zostać opisane na spodzie płytki hodowlanej. Rutynowo stosujemy kontrole z samym nośnikiem.
4. Przed sieciowaniem należy przygotować wszystkie roztwory Z WYJĄTKIEM roztworu DSP.
   1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór stokowy soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z CaCl₂ 0.1 mM i CaCl₂ 1 mM (PBS/Ca/Mg). Dodanie jonów wapnia i magnezu jest kluczowe dla adhezji komórek do płytki hodowlanej w trakcie trwania eksperymentu. Przechowywać w 4°C.
   2. 50X Kompletny Koktajl Inhibitorów Proteaz – 1 tabletka rozpuszczona w 1 mL wody Milli-Q. Przechowywać w -20°C.
   3. 20% Triton X-100 – Odważyć 10 g Triton X-100 i rozcieńczyć do całkowitej objętości 50 ml wody Milli-Q. Mieszać na wytrząsarce w 4°C przez noc i przechowywać w 4°C do momentu użycia. Nie przechowywać dłużej niż 1 miesiąc. Rozcieńczات tego 20% roztworu stokowego należy wykorzystać do przygotowania buforów do lizy i IP opisanych poniżej.
   4. 50X Roztwór do Gaszenia DSP – 1 M TRIS do pH 7.4. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
   5. Przygotować 10-krotny roztwór Buforu A.
      10X Bufor A:
      • 50 mL 1 M HEPES
      • 150 mL 5 M NaCl
      • 10 mL 0.5 M EGTA
      • 250 μL 2 M MgCl₂
      • Dostosować pH do 7.4
      • Dopełnić objętość końcową do 500 mL
      Roztwór 10X Bufor A rozcieńcza się do 1X Bufor A w zależności od potrzeb.
      1X Bufor A jest również stosowany w buforach do lizatu i immunomagnetycznej precypitacji.
      Bufor A 1X
      • 10 mM Hepes
      • 150 mM NaCl
      • 1 mM EGTA
      • 0.1 mM MgCl₂
      • pH 7.4
   6. Bufor do Lizy – 1X Bufor A + 0.5% Triton X-100.
   7. Bufor do Immunomagnetycznej Precypitacji (Bufor IP) – 1X Bufor A + 0.1% Triton X-100.

2. Przygotowanie roztworu sieciującego

1. Przygotuj roztwór DSP bezpośrednio przed zastosowaniem go do komórek. DSP jest silnie hydrofobowy i należy go rozpuścić w DMSO przed rozcieńczeniem w buforze PBS/Ca/Mg. Rozpuść 40 mg DSP w 1 mL DMSO. Pozwala to na otrzymanie 100 mM roztworu DSP (masa cząsteczkowa DSP wynosi 404,42 g/mol).
2. Podgrzej odpowiednią objętość PBS/Ca/Mg do 37°C, aby ułatwić rozcieńczenie DSP/DMSO w PBS.
   Objętości wymagane dla poszczególnych rozmiarów płytek:
   płytka 6-dołkowa 2 mL na dołek
   płytka 10 cm 10 mL na płytkę
   płytka 15 cm 20 mL na płytkę
3. Dodaj 10 μL roztworu stokowego DSP/DMSO na każdy 1 mL ciepłego PBS/Ca/Mg. Dodawaj roztwór stokowy DSP/DMSO kropla po kropli, wielokrotnie mieszając, aż cały DSP zostanie rozpuszczony. Przygotuj roztwór kontrolny, dodając 10 μL DMSO do każdego 1 mL PBS/Ca/Mg.
4. Umieść wszystkie roztwory PBS/Ca/Mg w kąpieli wodno-lodowej na maksymalnie 10 min.

3. Przygotowanie komórek do sieciowania

1. Przygotować kąpiel wodno-lodową, która pomieści wszystkie płytki do inkubacji z czynnikiem sieciującym lub kontrolą nośnika.
2. Wyjąć płytki z inkubatora 37°C i niezwłocznie umieścić je w kąpieli wodno-lodowej.
3. Przemyć komórki dwukrotnie lodowatym PBS/Ca/Mg. Należy użyć tej samej objętości, która będzie stosowana podczas inkubacji z czynnikiem sieciującym (patrz sekcja 2.2).
4. Usunąć drugi płuczyn oraz dodać kontrolę nośnika lub roztwór buforu sieciującego DSP.
5. Inkubować na lodzie przez dwie godziny. Należy sprawdzać płytki mniej więcej co dwadzieścia minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są przykryte roztworem. Można zauważyć niewielką ilość wytrąconego z roztworu DSP. Jest to zjawisko normalne.

4. Inaktywacja reakcji DSP

1. Przygotować 1X roztwór gaszący DSP zawierający 20 mM Tris pH 7.4 w buforze PBS/Ca/Mg (20 μL 1 M Tris pH 7.4 na każdy 1 mL PBS/Ca/Mg).
2. Usunąć roztwór kontrolny (vehicle control) oraz roztwory sieciujące.
3. Dodać lodowaty roztwór inaktywujący i inkubować na lodzie przez 15 minut.

5. Lizacja komórek

1. Podczas inkubacji w celu wygaszenia DSP, przygotować bufor do lizy komórek zawierający 0,5% Triton X-100 w Buforze A z dodatkiem Complete protease inhibitor cocktail. Dodać 20 μL 50X roztworu zapasowego Complete na każdy 1 mL buforu do lizy.
2. Po 15-minutowej inkubacji w celu wygaszenia DSP, przemyć komórki dwukrotnie za pomocą PBS/Ca/Mg.
3. Dodać do komórek bufor do lizy + Complete i inkubować w wytrząsarce w temperaturze 4°C przez 30 minut. Sugerowane objętości buforu do lizy dla różnych rozmiarów płytek:
   • płytka 6-dołkowa: 0,5 mL na dołek
   • płytka 10 cm: 1 mL na płytkę
   • płytka 15 cm: 1 mL na płytkę
4. Po lizie zebrać komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek. Należy pamiętać o przechowywaniu lizatów na lodzie, aby zminimalizować aktywność proteaz
5. Wirować lizaty komórkowe przez 15 minut w temperaturze 4°C w minicentry fudze stołowej przy maksymalnej prędkości (15.000 x g).
6. Przenieść nadfiltr pipetą do nowej probówki. Odrzucić osad.
7. Przeanalizować poziom białek i przystąpić do immunoprecypitacji.

6. Przygotowanie kulek do precypitacji immunomagnetycznej

Uwaga: Ten etap rozpoczyna się zazwyczaj bezpośrednio po rozpoczęciu 2-godzinnej inkubacji w celu sieciowania.

1. Do probek do mikrocentryfugi z zakrętkami należy wprowadzić 30 μL kulek immunomagnetycznych Dynal, 500 μL buforu do immunoprecypitacji (IP Buffer; 1x Buffer A + 0,1% Triton X-100) oraz odpowiednią ilość przeciwciała specyficznego dla antygenu. Przygotować probówki bez przeciwciał oraz z przeciwciałami nieswoistymi jako kontrole negatywne. Odpowiednią ilość przeciwciała należy wyznaczyć dla poszczególnych antygenów w osobnych doświadczeniach. Wszystkie probówki do immunoprecypitacji należy odpowiednio oznakować.
2. Probówki do immunoprecypitacji należy inkubować na rotatorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Alternatywnie można inkubować probówki z przeciwciałami przez noc w temperaturze 4°C w dniu poprzedzającym sieciowanie.
3. Po inkubacji należy przeprowadzić krótkie, 10-sekundowe wirowanie w mikrocentry fudze, aby osadzić kulki na dnie probówki.
4. Probówki należy wsunąć do uchwytu magnetycznego, co spowoduje przyciągnięcie kulek magnetycznych i odsunie je od dna probówki. Po zabezpieczeniu kulek można łatwo wypłukać niezwiązane przeciwciała.
5. Do usunięcia buforu inkubacyjnego i niezwiązanych przeciwciał należy użyć końcówki aspiracyjnej o małej średnicy, np. końcówki do nakładania żelu lub końcówki p200. Natychmiast po usunięciu objętości inkubacyjnej należy dodać 1 mL buforu do immunoprecypitacji (IP Buffer).
6. Probówkę należy zakręcić, delikatnie resuspender kulki i inkubować wszystkie probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut na rotatorze.
7. Krok płukania trwający 5 minut (kroki od 6.3 do 6.6) należy powtórzyć jeszcze raz, używając świeżego mililitra buforu do immunoprecypitacji (IP Buffer).
8. Probówki do immunoprecypitacji mogą pozostać w ostatniej inkubacji płuczącej do momentu, gdy sieciowany lizat będzie gotowy do dodania do kulek.

7. Inkubacja lizatu sieciowanego z kulkami immunomagnetycznymi

1. Po ostatnim płukaniu odwiruj kulki immunomagnetyczne w miniwirówce przez 10 sekund. Następnie umieść probówki w uchwycie magnetycznym.
2. Ponownie, używając końcówki aspiracyjnej o małej średnicy, usuń objętość inkubacyjną z probówki. Natychmiast dodaj do probótek zawierających kulki immunomagnetyczne 500 μL sieciowanego lizatu komórkowego (zakładając stężenie lizatu 1 μg/mL). Jeśli jako kontrolę negatywną stosowana jest konkurencja peptydowa, na tym etapie należy dodać odpowiednią ilość peptydu. W celu ustalenia odpowiednich warunków konkurencji peptydowej należy wcześniej przeprowadzić eksperymenty pilotażowe. Alternatywnie, jako kontrolę negatywną można zastosować kulki immunomagnetyczne bez lizatu. W takim przypadku natychmiast dodaj do kulek immunomagnetycznych 500 μL buforu do lizatu (1x Buffer A + 0.5% Triton X-100) + Complete.
3. Delikatnie resuspenduj kulki. Zresuspendowane kulki należy inkubować w temperaturze 4°C przy rotacji typu end-over-end przez 2 godziny.

8. Płukanie niezwiązanego lizatu z kulek

1. Po odpowiednim czasie inkubacji lizatu należy wykonać szybkie wirowanie przez 10 sekund w miniwirówce. Następnie należy wsunąć probówki do uchwytu magnetycznego. Uchwyt magnetyczny powinien pozostawać w kąpieli lodowej przez resztę eksperymentu.
2. Używając końcówki aspiracyjnej o małej średnicy, należy usunąć cały niezwiązany lizat. Natychmiast po usunięciu całego niezwiązanego lizatu należy dodać 1 mL buforu IP.
3. Należy zamknąć probówkę i delikatnie resuspender kuleczki.
4. Po resuspensji kuleczek należy powtórzyć krok osadzania kuleczek (8.1).
5. Ponownie należy odessać całą objętość inkubacyjną i natychmiast dodać 1 mL buforu IP, a następnie zamknąć probówkę.
6. Należy delikatnie resuspender kuleczki w buforze IP. Zresuspenderowane kuleczki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze 4°C przy zastosowaniu rotatora end-over-end.
7. Należy powtórzyć kroki płukania kuleczek (od 8.4 do 8.6) jeszcze 4 razy.

9. Denaturacja próbki i odzyskanie z kulek

1. Po przemyciu wszystkich probówek do immunoprecypitacji magnetycznej ponownie osadź koraliki (8.1) i wsuń probówki do uchwytu magnetycznego.
2. Białka związane z koralikami immunomagnetycznymi są usuwane w warunkach denaturujących. Odsuń pipetą ostatnią porcję buforu do IP i wyjmij probówkę z uchwytu magnetycznego.
3. Dodaj 1x Gel Sample Buffer do probówki z IP, tuż nad osadem z koralików, aby ponownie zgromadzić koraliki na dnie probówki. Ilość buforu do próbek zależy od rozmiaru dołka żelu, który będzie wykorzystywany. Może być konieczne delikatne opukanie dna probówki, aby wszystkie koraliki zostały resuspensowane w Gel Sample Buffer.
4. Powtórz proces denaturacji (od punktu 9.2 do 9.3) dla każdej probówki IP.
5. Koraliki immunomagnetyczne resuspensowane w Gel Sample Buffer są następnie podgrzewane w temperaturze 75°C przez 5 minut w celu zakończenia procesu denaturacji.
6. Po zdenaturowaniu próbki można ją poddać elektroforezie na żelu SDS-PAGE w celu wykonania western blottingu. Oczyszczone koraliki immunomagnetyczne można ponownie osadzić poprzez wirowanie i usunąć z próbki za pomocą uchwytu magnetycznego.

10. Elucja kompleksów sieciowanych peptydami antygenicznymi (chromatografia immuno powinowactwa).

1. Po przemyciu wszystkich probówek do immunomagnetycznej immunoprecypitacji, ponownie osadź kulki (8.1) i wsuń probówki do uchwytu magnetycznego. Odessać nadmiar cieczy i dodać 10 μl Buforu A uzupełnionego o peptyd antygenowy rozpoznawany przez przeciwciało użyte do immunoisolacji kompleksów białkowych. W celu uzyskania efektywnej elucji należy przetestować stężenia w zakresie 10-200 μM.
2. Inkubować kulki przez 2 h w temperaturze 4°C.
3. Umieścić kulki w statywie magnetycznym i ostrożnie zebrać 10 μL eluatowanego materiału. Zachować ten nadosad.
4. Szybko przemyć kulki Buforem A i odrzucić płuczkę. Zachować kulki.
5. Do zachowanego nadosadu oraz kulek dodać Bufor do Próbek żelowych do uzyskania stężenia 1X. Inkubować te probówki w temperaturze 75°C przez 5 minut.
6. Przeanalizować kulki oraz eluat peptydowy za pomocą SDS-PAGE. Eluat powinien być wolny od IgG, co należy potwierdzić barwieniem białek w SDS-PAGE lub za pomocą immunoblotów (Rycina 1B). Materiał ten, wolny od IgG, nadaje się do spektrometrii mas.

Rysunek 1. Izolacja kompleksów białkowych oddziałujących z AP-3 oraz białek błonowych. Komórki HEK293 (A) lub komórki PC12 (B) poddano działaniu kontroli nośnika (DMSO, nieparzyste ścieżki na Rys. 1A) lub DSP (parzyste ścieżki na Rys. 1A lub wszystkie ścieżki na Rys. 1B). Klarowne ekstrakty inkubowano z samymi kuleczkami (Rys. 1A, ścieżki 3-4), przeciwciałami przeciwko receptorowi transferyny (Rys. 1A, ścieżki 5-6) lub przeciwciałami przeciwko δ AP-3 (Rys. 1A, ścieżki 7-10; Rys. 1B, ścieżki 1-10). Kompleksy immunologiczne eluowano buforem do próbek SDS-PAGE (Rys. 1A), samym Buforem A (Rys. 1B, ścieżki 1-2) lub Buforem A z dodatkiem rosnących stężeń peptydu antygenowego δ odpowiadającego aminokwasom 680-710 ludzkiej δ-adaptyny (NCBI:AAD03777; gi:1923266) (Rys. 1B, ścieżki 3-10). Peptyd ten wiąże przeciwciało δ. Po elucji peptydu analizowano supernatanty (S) i kuleczki (B) za pomocą immunoblotu (Rys. 1B). AP-3, wykrywany przeciwciałami przeciwko podjednostkom δ, β3 i σ3, współwytrąca się z następującymi czynnikami rozpuszczalnymi: ciężkim łańcu klatryny (CHC), podjednostką pallidyną kompleksu BLOC-1 oraz podjednostką vps33b kompleksu HOPS; a także z białkami błonowymi: fosfatydyloinozyto-4-kinazą typu II alfa (PI4KIIα) i transporterem cynku 3 (ZnT3). Zauważalny jest brak ciężkich łańcuchów IgG mysich w supernatancie po elucji peptydu na Rys. 1B.

Dyskusja

DSP, przenikający przez błony, chemicznie redukowalny czynnik sieciujący z ramieniem dystansowym o długości 12 Å, jest stosowany do stabilizacji przejściowych oddziaływań białkowych ^1,2,3,4. W niniejszej pracy zilustrowaliśmy tę strategię na przykładzie kompleksu adaptorowego AP-3, który jest rozpuszczalnym kompleksem białkowym rozpoznającym białka błonowe i sortującym je do pęcherzyków z endosomów ⁵. AP-3 selektywnie wiąże transporter cynku ZnT3 oraz kinazę lipidową fosfatydyloinozyto-4-kinazę typu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fosforanowy bufor solny (PBS)	Invitrogen	P4417	Rozpuścić 1 tabletkę w 200 mL wody; dodać MgCl2 do stężenia końcowego 1 mM oraz CaCl2 do stężenia końcowego 0.1 mM
Ditionbis (propionian sukcynimidylowy) (DSP)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22585	Wrażliwy na wilgoć, przechowywać w szczelnym pojemniku w 4°C
Dimetylosulfoksyd (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
Triton X-100, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	T9284
Dynabeads, owcze przeciwko mysim IgG	Invitrogen	110.31	Kuleczki dostępne są również w wersji owcze przeciwko króliczym
Magnes Dyna-Mag-2	Invitrogen	123-21D