Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Podsumowanie

W tym filmie opisujemy procedurę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach oraz identyfikację fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory. Takie fenotypy mogą być następnie wykorzystane do wyjaśnienia funkcji i celów działania efektorów.

Streszczenie

Wiele gramujemnych bakterii patogennych wykorzystuje system sekrecji typu III do translokacji zestawu białek efektorowych do cytozolu komórek gospodarza. Wewnątrz komórki efektory typu III zakłócają procesy komórkowe gospodarza, aby tłumić odpowiedzi immunologiczne i promować wzrost patogenu. Do tej pory zidentyfikowano liczne efektory typu III u bakteryjnych patogenów roślin i zwierząt, jednak tylko kilka z nich zostało dobrze scharakteryzowanych. Zrozumienie funkcji tych efektorów jest utrudnione przez kombinację redundancji funkcjonalnej w repertuarze efektorów danego szczepu bakteryjnego, subtelne efekty, jakie mogą wywierać w celu zwiększenia wirulencji, role być może specyficzne dla określonych etapów infekcji oraz trudności w manipulacjach genetycznych niektórymi patogenami. Ekspresja efektorów typu III w drożdżach pączkującychSaccharomyces cerevisiaemoże pozwolić na obejście tych ograniczeń i pomóc w charakterystyce funkcjonalnej białek efektorowych. Ponieważ efektory typu III często celują w procesy komórkowe konserwatywne u drożdży i innych eukariotów, ich ekspresja w drożdżach może prowadzić do fenotypów hamowania wzrostu, które można wykorzystać do wyjaśnienia funkcji i celów efektorów. Dodatkowe zalety wykorzystania drożdży w badaniach funkcjonalnych bakteryjnych efektorów obejmują ich podatność na manipulacje genetyczne, dostępność informacji o przewidywanych funkcjach ogromnej większości ich ORF oraz dostępność licznych narzędzi i zasobów do eksperymentów zarówno w skali całego genomu, jak i w małej skali. W niniejszym opracowaniu omawiamy krytyczne czynniki przy projektowaniu systemu drożdżowego do ekspresji bakteryjnych białek efektorowych typu III. Obejmują one odpowiedni promotor sterujący ekspresją interesujących genów efektorowych, liczbę kopii genu efektora, znacznik epitopowy użyty do weryfikacji ekspresji białka oraz szczep drożdży. Przedstawiamy procedury indukcji ekspresji efektorów w drożdżach oraz weryfikacji ich ekspresji za pomocą immunoblottingu. Dodatkowo opisujemy test kropelkowy (spotting assay) na płytkach agarowych służący do identyfikacji fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez efektory. Zastosowanie tego protokołu można rozszerzyć na badanie czynników patogenności dostarczanych do komórki gospodarza przez dowolny patogen i mechanizm translokacji.

Protokół

I. Projektowanie systemu ekspresji drożdżowej dla efektorów typu III

Kalibracja systemu drożdżowego odpowiedniego do ekspresji interesujących efektorów typu III jest istotnym zadaniem i może wymagać pewnych prób i błędów. Czynniki o kluczowym znaczeniu, które należy rozważyć i zoptymalizować podczas projektowania takiego systemu, to: 1) promotor sterujący ekspresją efektora(ów), 2) liczba kopii genu efektora, 3) znacznik epitopowy użyty do weryfikacji ekspresji białka oraz 4) szczep drożdży.

1) Promotor

Ponieważ bakteryjne efektory typu III mogą być toksyczne dla komórek drożdży, do kontrolowania ich ekspresji należy użyć promotora indukowalnego. W tym celu powszechnie stosuje się promotor GAL1, którego aktywność jest regulowana przez źródło węgla obecne w pożywce: jest on represowany przez glukozę i indukowany przez galaktozę. Zgłaszano jednak, że promotor ten wykazuje niewielką nieszczelność w warunkach represji, co prowadzi do niepożądanej toksyczności. W przypadku wystąpienia podobnego problemu zaleca się zminimalizowanie liczby kopii genu efektora, zgodnie z opisem poniżej, lub zastosowanie alternatywnych promotorów indukowalnych, takich jak promotory MET3 lub CUP1¹. W niniejszej pracy opisujemy procedury ekspresji białek efektorowych z promotora indukowalnego galaktozą.

2) Liczba kopii genu

Dodatkowym parametrem wpływającym na poziom ekspresji białka jest liczba kopii genu efektora obecnych w komórce. Wysokie poziomy ekspresji osiąga się, gdy gen efektora jest przenoszony przez plazmid 2-mikronowy (40-60 kopii na komórkę). Pośrednią ekspresję uzyskuje się poprzez zastosowanie plazmidu zawierającego centromer (1-3 kopie na komórkę), natomiast niską ekspresję osiąga się, gdy gen efektora zostanie zintegrowany z genomem drożdży poprzez rekombinację homologiczną. Łącząc wektor zawierający centromer z promotorem GAL1, pomyślnie wyekspresowaliśmy około 50 efektorów patogenów roślin Xanthomonas campestris pv. vesicatoria oraz Pseudomonas syringae pv. tomato na poziomach wykrywalnych w analizie immunoblottingowej i z pomijalnym przeciekiem w warunkach represyjnych (Salomon i Sessa, niepublikowane).

3) Znacznik epitopowy

Jeśli przeciwciała przeciwko badanemu efektorowi nie są dostępne, do białka efektorowego przyłącza się znacznik epitopowy, aby monitorować jego ekspresję za pomocą immunoblottingu. Powszechnie stosowane znaczniki to Myc, hemaglutynina (HA) lub Flag, do których dostępne są niezawodne przeciwciała komercyjne. Sugerujemy stosowanie tylko jednej kopii znacznika, aby zminimalizować niepożądane, szkodliwe efekty wpływające na strukturę i aktywność białka efektorowego.

4) Szczep drożdży

Podstawowym wymaganiem dla szczepu drożdży wykorzystywanego do ekspresji jest auksotrofia w odniesieniu do markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego. Należy zauważyć, że różne szczepy drożdży mogą wykazywać różną wrażliwość na ekspresję określonych efektorów. Na przykład zaobserwowano, że szczepy BY4741 i W303 wykazują różną wrażliwość na kilka efektorów Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Salomon i Sessa, nieopublikowane). Dlatego też zaleca się testowanie interesujących efektorów w różnych szczepach drożdży.

II. Przygotowanie pożywek dla drożdży

Do hodowli szczepów drożdży niezawierających wektora należy używać pożywki YPD (10 g/L ekstraktu drożdżowego, 20 g/L peptonu i 2% [w/v] glukozy). W przypadku pożywek stałych do roztworu należy dodać 2% [w/v] agaru (jeśli pożywka stała jest zbyt miękka, przed autoklawowaniem do pożywki należy dodać 0,05% [v/v] z roztworu stokowego 5 N NaOH). Zaleca się przygotowanie pożywki bez glukozy w 90% objętości końcowej i jej autoklawowanie. Tuż przed użyciem objętość należy uzupełnić do 100% za pomocą filtrowanego sterylnie 20% [w/v] roztworu glukozy (roztwór 20% glukozy należy przechowywać w temperaturze 4°C, aby zapobiec kontaminacji).

Do hodowli szczepów drożdży zawierających wektor zapewniający prototrofię dla markera selekcyjnego (leucyny, uracylu, histydyny lub tryptofanu), należy użyć syntetycznej pożywki drop-out bez leucyny, uracylu, histydyny i tryptofanu (6,7 g/L yeast nitrogen base bez aminokwasów, 1,4 g/L yeast synthetic drop-out medium supplement) zawierającej 2% [w/v] glukozy lub 2% [w/v] galaktozy i 1% [w/v] rafinozy. W celu przygotowania pożywek stałych do roztworu należy dodać 2% [w/v] agaru. Zaleca się przygotowanie pożywki w 90% objętości końcowej i jej autoklawowanie. Krótko przed użyciem objętość należy uzupełnić do 100% za pomocą filtrowanego sterylnie 20% roztworu glukozy lub filtrowanego sterylnie roztworu 20% galaktozy + 10% rafinozy, w zależności od pożądanego źródła węgla (roztwory 20% glukozy oraz 20% galaktozy + 10% rafinozy należy przechowywać w 4°C, aby zapobiec kontaminacji). W zależności od markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego, przed użyciem należy dodać pozostałe aminokwasy lub uracyl (10 ml/L z roztworu zapasowego leucyny 1 g/100 ml, 10 ml/L z roztworu zapasowego uracylu 200 mg/100 ml, 2 ml/L z roztworu zapasowego histydyny 1 g/100 ml lub 2 ml/L z roztworu zapasowego tryptofanu 1 g/100 ml). Roztwory zapasowe leucyny i uracylu należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwory zapasowe histydyny i tryptofanu należy sterylizować przez filtrowanie, owinąć butelkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowywać w 4°C. W procedurach opisanych poniżej syntetyczna pożywka drop-out uzupełniona o leucynę, uracyl, histydynę i tryptofan jest określana jako syntetyczna pożywka kompletna (synthetic complete medium).

Płytki z podłożem stałym można przechowywać do dwóch miesięcy w temperaturze 4°C. Przed użyciem należy osuszyć płytki przez 20 min w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej.

III. Transformacja drożdży

1. Przed rozpoczęciem procedury transformacji drożdży należy przygotować trzy następujące roztwory: 50% [w/v] roztwór glikolu polietylenowego (PEG) 3350, 1 M roztwór LiAc o pH=8,0 oraz roztwór TE (100 mM Tris pH=6,85 i 10 mM EDTA pH=8,0). Roztwory należy wysterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Używając długiego drewnianego patyczka lub sterylnej pętli do szczepień, należy pobrać kolonię drożdży (o średnicy 1-2 mm) ze świeżonej płytki i zaszczepić do 3 ml pożywki YPD w 15 ml probówce polipropylenowej. Próbkę należy krótko wymieszać na wortexie. Probówkę z kulturą należy umieścić w rotatorze i inkubować przez noc w temperaturze 30°C przy ciągłej rotacji.
3. Rano należy wyjąć kulturę z rotatora i odwirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy całkowicie usunąć supernatat.
4. Komórki należy zawiesić w 1 ml buforu do resuspensji (10% [v/v] roztwór TE, 10% [v/v] roztwór 1 M LiAc) i wymieszać za pomocą wortexa.
5. Dla każdego plazmidu przeznaczonego do transformacji oraz dla dodatkowej transformacji kontrolnej należy przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki.
6. Do każdej probówki należy dodać 5 μl jednoniciowego DNA z plemników łososia (10 mg/ml) oraz 250-500 ng plazmidowego DNA do transformacji (z wyjątkiem probówki kontrolnej).
7. Do każdej probówki należy ostrożnie dodać 650 μl roztworu do transformacji (10% [v/v] roztwór TE, 10% [v/v] roztwór 1 M LiAc, 80% [v/v] roztworu 50% [w/v] PEG) i wymieszać na wortexie.
8. Inkubować w temperaturze 30°C przez 30 min na rotatorze.
9. Wyjąć probówki z rotatora, dodać 70 μl DMSO i wymieszać poprzez odwrócenie probówek 10-15 razy (nie używać wortexa, aby uniknąć rozbicia komórek).
10. Umieścić probówki w kąpieli wodnej uprzednio ogrzanej do 42°C i inkubować przez 15 min.
11. Wyjąć probówki z kąpieli wodnej i natychmiast umieścić je na lodzie na 2 min.
12. Po ochłodzeniu probówek należy je odwirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
13. Wyjąć probówki z mikrowirówki i ostrożnie usunąć lepki supernatat za pomocą pipety.
14. Osad komórkowy z każdej probówki należy resuspenderować w 150 μl sterylnej podwójnie destylowanej wody (DDW), a następnie wysiać zawiesinę komórkową na płytkę z syntetycznym medium kompletnym zawierającym 2% glukozy jako źródła węgla, pozbawioną aminokwasu lub nukleotydu, dla którego plazmid zapewnia prototrofię.
15. Pozostawić płytki otwarte przez 2 min i pozwolić im wyschnąć w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Płytki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 30°C na dwa lub trzy dni.
16. Po pojawieniu się kolonii (o średnicy 1-2 mm) na płytkach należy pobrać około 10 pojedynczych kolonii z każdej transformacji i przenieść je na świeżą płytkę. Podczas przenoszenia kolonii należy tworzyć plamy o wymiarach 2 cm x 2 cm, aby umożliwić wzrost dużej ilości komórek drożdży. Płytki należy inkubować w inkubatorze w temperaturze 30°C przez dwa dni.
17. Po wyrośnięciu plam drożdży należy wyjąć płytki z inkubatora i uszczelnić je parafilmem. Płytki można przechowywać w temperaturze 4°C. Kolonie należy przenosić na świeżą płytkę co 10-14 dni.

IV. Przygotowanie ekstraktu białkowego z drożdży w celu weryfikacji ekspresji efektora za pomocą immunoblottingu

1. Pobrać kolonię drożdży (o średnicy 1-2 mm) ze świeżej płytki do probówki z polipropylenu o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml odpowiedniej syntetycznej pożywki kompletnej uzupełnionej o 2% glukozy jako źródła węgla i pozbawionej aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Umieścić probówkę z kulturą w walcarku i inkubować przez noc w temperaturze 30°C.
2. Następnego dnia wyjąć kulturę z walcarka i odwirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wyjąć probówki z wirówki i odrzucić nadsącz.
3. Resuspendować osad komórkowy w 3 ml sterylnej wody DDW i wymieszać za pomocą wortexa.
4. Ponownie odwirować, odrzucić nadsącz i resuspendować komórki w 3 ml sterylnej wody DDW.
5. Przenieść 200 μl zawiesiny komórkowej do nowej probówki 15 ml zawierającej 3 ml syntetycznej pożywki kompletnej uzupełnionej o 2% galaktozy i 1% rafinozy jako źródła węgla, oraz pozbawionej aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Wymieszać za pomocą wortexa, umieścić w walcarku i inkubować przez noc w temperaturze 30°C.
6. Następnego ranka przenieść 1 ml kultury (lub więcej w przypadku kultur o niskiej gęstości) do mikroprobówki. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
7. Od tego momentu pracować pod wyciągiem, aby uniknąć wdychania toksycznych oparów β-merkaptoetanolu. Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety i resuspendować osad komórkowy w 100 μl lodowatego roztworu lizującego (4% [v/v] 5 N NaOH, 0,5% [v/v] β-merkaptoetanol). Intensywnie wymieszać za pomocą wortexa i inkubować na lodzie przez 30 min.
8. Podczas inkubacji określić objętość HCl (6 N) wymaganą do miareczkowania 100 μl buforu lizującego do pH 9-10. W tym celu umieścić 10 mikroprobówek w statywie i przenieść do każdej z nich 100 μl buforu lizującego. Do każdej probówki dodać różne objętości (1-10 μl) HCl (6 N) i wymieszać za pomocą wortexa. Pobrać próbkę i sprawdzić pH roztworu za pomocą papierka wskaźnikowego pH.
9. Po zakończeniu inkubacji dodać do lizatu objętość HCl wyznaczoną w poprzednim kroku i wymieszać za pomocą wortexa (dla lepszej dokładności nalać roztwór HCl po ściance probówki, nie wprowadzając końcówki pipety bezpośrednio do lizatu).
10. Do lizatu dodać 50 μl 3x buforu do próbek (30% [v/v] glicerol, 15% [v/v] β-merkaptoetanol, 37,5% [v/v] 500 mM Tris-HCl pH=6,8, 0,15% [w/v] dodecylosiarczan sodu [SDS] i kilka ziarenek błękitu bromofenolowego) i wymieszać za pomocą wortexa (jeśli roztwór stanie się żółty, oznacza to, że pH jest zbyt niskie i należy dodać kilka mikrolitrów roztworu lizującego, aż roztwór stanie się niebieski).
11. Gotować roztwór lizatu przez 5 min na bloku grzejnym po uprzednim przebiciu igłą nakrętki mikroprobówki.
12. Wyjąć mikroprobówkę z bloku grzejnego i pozwolić roztworowi ostygnąć przez 2 min w temperaturze pokojowej.
13. Wymieszać roztwór lizatu na wortexie, a następnie odwirować przez 10 s. Nanieść 30 μl na żel SDS-PAGE do analizy immunoblot.

V. Test kropelkowy do wykrywania fenotypów hamowania wzrostu indukowanego przez efektory

1. Z nowej płytki wybierz kolonię drożdży (średnica 1-2 mm) zawierającą interesujący plazmid ekspresyjny i zaszczep ją do 3 ml syntetycznego podłoża kompletnego w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, uzupełnionego o 2% glukozy jako źródła węgla i pozbawionego aminokwasu lub nukleotydu, dla którego plazmid ekspresyjny zapewnia prototrofię. Powtórz tę samą procedurę dla kontrolnego szczepu drożdży zawierającego pusty plazmid. Umieść probówki z kulturami w walcaku i inkubuj przez noc w temperaturze 30°C przy stałym obrotowaniu.
2. Następnego dnia wyjmij kultury z walcaka i odwiruj przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wyjmij probówki z wirówki i odlej supernatant.
3. Resuspenduj osad komórkowy w 3 ml sterylnej wody destylowanej (DDW) i wymieszaj za pomocą wortexa.
4. Powtórz etap wirowania i ponownie resuspenduj komórki w 3 ml sterylnej DDW.
5. Aby oznaczyć gęstość optyczną (OD), przenieś 100 μl każdej kultury do mikroprobówki zawierającej 900 μl DDW i wymieszaj wortexem. Przelej zawartość probówek do plastikowej kuwety i zmierz absorbancję przy długości fali 600 nm (jako referencję wykorzystaj kuwetę wypełnioną 1 ml DDW). Oblicz OD₆₀₀ kultur wyjściowych, mnożąc OD₆₀₀ kultur w kuwecie przez czynnik rozcieńczenia wynoszący 10.
6. Następnie, w oparciu o OD₆₀₀ kultur wyjściowych, przygotuj w sterylnych mikroprobówkach zawiesiny komórkowe (1 ml) o OD₆₀₀=1.0.
7. Używając 3 sterylnych mikroprobówek wypełnionych 900 μl sterylnej DDW, przygotuj trzy 10-krotne rozcieńczenia seryjne (OD₆₀₀=0.1, 0.01 i 0.001) z każdej zawiesiny komórkowej (OD₆₀₀=1.0) przygotowanej w poprzednim kroku.
8. Przygotuj dwie płytki zawierające syntetyczne podłoże kompletne bez aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Podłoże na jednej płytce powinno być uzupełnione o 2% glukozy, a na drugiej o 2% galaktozy i 1% rafinozy. Osusz płytki w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej przez 20 min i umieść je na kratce.
9. Dla każdej kultury nanieś kropką (spotting) po 10 μl z czterech rozcieńczeń w rzędzie, zarówno na podłoże represyjne, jak i indukcyjne.
10. Po naniesieniu próbek pozostaw płytki otwarte w komorze przez kilka minut. Gdy plamki wyschną, przykryj płytki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 30°C na 2-3 dni.
11. Po inkubacji wyjmij płytki i przeanalizuj wzrost drożdży. Najpierw potwierdź, że gęstość komórek jest podobna na płytce z podłożem represyjnym. Następnie porównaj wzrost kultury ekspresyjącej interesujące białko efektorowe z kulturą zawierającą pusty wektor na płytce z podłożem indukcyjnym.
    
    Uwaga: efektory mogą oddziaływać na procesy komórkowe, które nie ograniczają szybkości wzrostu drożdży w standardowych laboratoryjnych warunkach hodowli. Aby umożliwić identyfikację fenotypów hamowania wzrostu dla takich efektorów, podłoża indukcyjne można uzupełnić związkami zmieniającymi funkcje komórkowe drożdży, zwiększając tym samym ich wrażliwość na efektory. Listę substancji chemicznych, które można włączyć do tej procedury, znajdziesz w pracy Parsons et al. (2004)².

VI. Reprezentatywne wyniki

Przedstawicielowy test plamkowy na drożdżach oraz detekcja fenotypów hamowania wzrostu wywołanych ekspresją efektorów typu III przedstawiono na Ryc. 1. W tym eksperymencie efektory typu III AvrPto, HopAA1-1 i AvrE1 Gram-ujemnej bakterii fitopatogennej Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) wyekspresowano z plazmidu pGML10 zawierającego centromer w szczepie drożdży BY4741, a następnie przetestowano ich zdolność do hamowania wzrostu drożdży. Poszczególne kultury drożdży wykazujące ekspresję efektorów typu III Pst pod kontrolą indukowalnego galaktozą promotora GAL1 lub zawierające pusty wektor poddano rozcieńczeniom seryjnym i wysiano na podłoża represyjne (glukoza) lub indukcyjne (galaktoza) (Ryc. 1). Na podłożu represyjnym szczepy drożdży niosące plazmidy do ekspresji AvrPto i HopAA1-1 wykazały wzrost podobny do szczepu kontrolnego zawierającego pusty wektor. Jednak na tym samym podłożu drożdże niosące AvrE1 wykazały nieco ograniczony wzrost, co prawdopodobnie wynika z pewnego stopnia nieszczelności promotora GAL1 oraz wysokiego efektu cytotoksycznego AvrE1. W warunkach indukcyjnych ekspresja efektora AvrE1 spowodowała drastyczny fenotyp hamowania wzrostu, objawiający się brakiem kolonii w każdym rozcieńczeniu. Jak wcześniej zaobserwowano przez Munkvolda i współpracowników³, ekspresja HopAA1-1 również doprowadziła do silnego hamowania wzrostu, podczas gdy AvrPto nie wywołało żadnego efektu.

Rysunek 1. Hamowanie wzrostu drożdży spowodowane ekspresją efektorów typu III AvrE1 i HopAA1-1 z Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst). Szczepy drożdży (BY4741) zawierające plazmid pGML10, pusty lub niosący kasety pod promotorem GAL1 dla indukowanej galaktozą ekspresji AvrPto, HopAA1-1 lub AvrE1, hodowano przez noc w syntetycznym medium kompletnym uzupełnionym o glukozę (2%) jako źródło węgla i pozbawionym leucyny. Kultury przemyto, znormalizowano do OD₆₀₀=1,0, a następnie naniesiono seryjne 10-krotne rozcieńczenia na syntetyczne kompletne podłoża stałe pozbawione leucyny i zawierające glukozę (2%) lub galaktozę (2%) i rafinozę (1%). Zdjęcia wykonano po 2 i 3 dniach wzrostu w temperaturze 30°C odpowiednio dla drożdży rosnących na podłożach z glukozą i galaktozą.

Dyskusja

W niniejszej prezentacji zilustrowaliśmy, jak wykorzystać drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae jako system heterologiczny do ekspresji bakteryjnych białek efektorowych typu III oraz jak identyfikować fenotypy zahamowania wzrostu indukowane przez efektory. Co ważne, fenotypy te mogą być wykorzystane w przesiewach genetycznych do identyfikacji supresorów negatywnego wpływu efektorów na wzrost drożdży. Supresory mogą reprezentować albo bezpośrednie cele badanego efektora, albo białka uczestniczące w procesac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekstrakt drożdżowy	Difco Laboratories	212750
Pepton	Difco Laboratories	211677
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G5767
Agar	Difco Laboratories	214010
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Azotowa baza drożdżowa bez aminokwasów	Difco Laboratories	291940
Suplement syntetycznej pożywki drożdżowej z pominięciem składników (drop-out)	Sigma-Aldrich	Y2001
D-galaktoza	Sigma-Aldrich	G0750	>99%; <0,1% glukozy
D-rafinoza	Sigma-Aldrich	R0250	>98%
L-leucyna	Sigma-Aldrich	L8000
Uracyl	Sigma-Aldrich	U0750
L-tryptofan	Sigma-Aldrich	T0254
L-histydyna	Sigma-Aldrich	H6034
DNA jednoniciowy z jąder łososi	Sigma-Aldrich	D7656
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879	Przesuszony
Kwas solny (HCl)	Sigma-Aldrich	H1758
Glikol polietylenowy (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	P4338
Octan litu (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4958
Tris (zasada)	JT Baker	4109-02
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
β-merkapto–etanol	Sigma-Aldrich	M6250
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	B6131
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Merck & Co., Inc.	8.22050.1000
Probówki do wirowania (15 ml)	Corning	430052	Sterylne
Kuweta spektrofotometryczna (10x4x45 mm)	Sarstedt Ltd	67.742
Pętla do szczepienia	Sigma-Aldrich	Z643009	Sterylna
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7543
Paski wskaźnikowe pH, pH 6,5-10,0	Merck & Co., Inc.	1.09543.0001