Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Podsumowanie

W tym filmie opisujemy procedurę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach oraz identyfikację fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory. Takie fenotypy mogą być następnie wykorzystane do wyjaśnienia funkcji i celów działania efektorów.

Streszczenie

Wiele gramujemnych bakterii patogennych wykorzystuje system sekrecji typu III do translokacji zestawu białek efektorowych do cytozolu komórek gospodarza. Wewnątrz komórki efektory typu III zakłócają procesy komórkowe gospodarza, aby tłumić odpowiedzi immunologiczne i promować wzrost patogenu. Do tej pory zidentyfikowano liczne efektory typu III u bakteryjnych patogenów roślin i zwierząt, jednak tylko kilka z nich zostało dobrze scharakteryzowanych. Zrozumienie funkcji tych efektorów jest utrudnione przez kombinację redundancji funkcjonalnej w repertuarze efektorów danego szczepu bakteryjnego, subtelne efekty, jakie mogą wywierać w celu zwiększenia wirulencji, role być może specyficzne dla określonych etapów infekcji oraz trudności w manipulacjach genetycznych niektórymi patogenami. Ekspresja efektorów typu III w drożdżach pączkującychSaccharomyces cerevisiaemoże pozwolić na obejście tych ograniczeń i pomóc w charakterystyce funkcjonalnej białek efektorowych. Ponieważ efektory typu III często celują w procesy komórkowe konserwatywne u drożdży i innych eukariotów, ich ekspresja w drożdżach może prowadzić do fenotypów hamowania wzrostu, które można wykorzystać do wyjaśnienia funkcji i celów efektorów. Dodatkowe zalety wykorzystania drożdży w badaniach funkcjonalnych bakteryjnych efektorów obejmują ich podatność na manipulacje genetyczne, dostępność informacji o przewidywanych funkcjach ogromnej większości ich ORF oraz dostępność licznych narzędzi i zasobów do eksperymentów zarówno w skali całego genomu, jak i w małej skali. W niniejszym opracowaniu omawiamy krytyczne czynniki przy projektowaniu systemu drożdżowego do ekspresji bakteryjnych białek efektorowych typu III. Obejmują one odpowiedni promotor sterujący ekspresją interesujących genów efektorowych, liczbę kopii genu efektora, znacznik epitopowy użyty do weryfikacji ekspresji białka oraz szczep drożdży. Przedstawiamy procedury indukcji ekspresji efektorów w drożdżach oraz weryfikacji ich ekspresji za pomocą immunoblottingu. Dodatkowo opisujemy test kropelkowy (spotting assay) na płytkach agarowych służący do identyfikacji fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez efektory. Zastosowanie tego protokołu można rozszerzyć na badanie czynników patogenności dostarczanych do komórki gospodarza przez dowolny patogen i mechanizm translokacji.

Protokół

I. Projektowanie systemu ekspresji drożdżowej dla efektorów typu III

Kalibracja systemu drożdżowego odpowiedniego do ekspresji interesujących efektorów typu III jest istotnym zadaniem i może wymagać pewnych prób i błędów. Czynniki o kluczowym znaczeniu, które należy rozważyć i zoptymalizować podczas projektowania takiego systemu, to: 1) promotor sterujący ekspresją efektora(ów), 2) liczba kopii genu efektora, 3) znacznik epitopowy użyty do weryfikacji ekspresji białka oraz 4) szczep drożdży.

1) Promotor

Ponieważ bakteryjne efektory typu III mogą być toksyczne dla komórek drożdży, do kontroli ich ekspresji należy zastosować promotor indukowalny. W tym celu powszechnie wykorzystuje się promotor GAL1, którego aktywność jest regulowana przez źródło węgla obecne w pożywce: jest on represowany przez glukozę i indukowany przez galaktozę. Zgłaszano jednak, że promotor ten wykazuje niewielką nieszczelność w warunkach represji, co prowadzi do niepożądanej toksyczności. W przypadku wystąpienia podobnego problemu zaleca się zminimalizowanie liczby kopii genu efektora, zgodnie z opisem poniżej, lub zastosowanie alternatywnych promotorów indukowalnych, takich jak promotory MET3 lub CUP1¹. W niniejszym opracowaniu opisujemy procedury ekspresji białek efektorowych z promotora indukowalnego galaktozą.

2) Liczba kopii genu

Dodatkowym parametrem wpływającym na poziom ekspresji białka jest liczba kopii genu efektora obecnych w komórce. Wysokie poziomy ekspresji uzyskuje się, gdy gen efektora jest przenoszony przez plazmid 2-mikronowy (40-60 kopii na komórkę). Ekspresję pośrednią uzyskuje się przy użyciu plazmidu zawierającego centromer (1-3 kopie na komórkę), natomiast niską ekspresję osiąga się, gdy gen efektora zostanie zintegrowany z genomem drożdży poprzez rekombinację homologiczną. Łącząc wektor zawierający centromer z promotorem GAL1, z powodzeniem wyeksprimowano około 50 efektorów patogenów roślin Xanthomonas campestris pv. vesicatoria oraz Pseudomonas syringae pv. tomato na poziomach wykrywalnych w analizie immunoblottingowej i z pomijalnym przeciekiem w warunkach represyjnych (Salomon i Sessa, nieopublikowano).

3) Znacznik epitopowy

Jeśli przeciwciała przeciwko badanemu efektorowi nie są dostępne, do białka efektorowego przyłącza się znacznik epitopowy, aby monitorować jego ekspresję za pomocą immunoblottingu. Powszechnie stosowanymi znacznikami są Myc, hemaglutynina (HA) lub Flag, do których dostępne są niezawodne przeciwciała komercyjne. Sugerujemy stosowanie tylko jednej kopii znacznika, aby zminimalizować niepożądane, szkodliwe efekty wpływające na strukturę i aktywność białka efektorowego.

4) Szczep drożdży

Podstawowym wymogiem dla szczepu drożdży wykorzystywanego do ekspresji jest auksotrofia względem markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego. Należy zauważyć, że różne szczepy drożdży mogą wykazywać różną wrażliwość na ekspresję określonych efektorów. Na przykład zaobserwowaliśmy, że szczepy BY4741 i W303 wykazują różną wrażliwość na kilka efektorów Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Salomon i Sessa, niepublikowane). Dlatego zaleca się testowanie interesujących efektorów w różnych szczepach drożdży.

II. Przygotowanie pożywek dla drożdży

Do hodowli szczepów drożdży niezawierających wektora należy używać pożywki YPD (10 g/L ekstraktu drożdżowego, 20 g/L peptonu i 2% [w/v] glukozy). W przypadku pożywek stałych do roztworu dodaje się 2% [w/v] agaru (jeśli pożywka stała jest zbyt miękka, przed autoklawowaniem do pożywki należy dodać 0,05% [v/v] z roztworu zapasowego 5 N NaOH). Zaleca się przygotowanie pożywki bez glukozy w 90% końcowej objętości i jej autoklawowanie. Tuż przed użyciem objętość należy uzupełnić do 100% za pomocą sterylizowanego przez filtr 20% [w/v] roztworu glukozy (roztwór 20% glukozy należy przechowywać w temperaturze 4°C, aby zapobiec kontaminacji).

Do hodowli szczepów drożdży zawierających wektor zapewniający prototrofię dla markera selekcyjnego (leucyny, uracylu, histydyny lub tryptofanu) należy użyć syntetycznej pożywki drop-out bez leucyny, uracylu, histydyny i tryptofanu (6,7 g/L yeast nitrogen base bez aminokwasów, 1,4 g/L yeast synthetic drop-out medium supplement) zawierającej 2% [w/v] glukozy lub 2% [w/v] galaktozy i 1% [w/v] rafinozy. W przypadku pożywek stałych do roztworu należy dodać 2% [w/v] agaru. Zaleca się przygotowanie pożywki w 90% objętości końcowej i jej autoklawowanie. Tuż przed użyciem objętość należy uzupełnić do 100% za pomocą sterylnego roztworu 20% glukozy (filtrowanego) lub sterylnego roztworu 20% galaktozy + 10% rafinozy (filtrowanego), w zależności od pożądanego źródła węgla (roztwory 20% glukozy oraz 20% galaktozy + 10% rafinozy należy przechowywać w 4°C, aby zapobiec kontaminacji). W zależności od markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego, przed użyciem należy dodać pozostałe aminokwasy lub uracyl (10 ml/L ze stoku leucyny 1 g/100 ml, 10 ml/L ze stoku uracylu 200 mg/100 ml, 2 ml/L ze stoku histydyny 1 g/100 ml lub 2 ml/L ze stoku tryptofanu 1 g/100 ml). Podczas przygotowywania stoków leucyny i uracylu należy je wysterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej. Podczas przygotowywania stoków histydyny i tryptofanu należy je wysterylizować poprzez filtrację, owinąć butelkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowywać w 4°C. W poniższych procedurach syntetyczna pożywka drop-out uzupełniona o leucynę, uracyl, histydynę i tryptofan jest określana jako syntetyczna pożywka kompletna (synthetic complete medium).

Płytki z pożywką stałą można przechowywać do dwóch miesięcy w temperaturze 4°C. Przed użyciem należy osuszyć płytki przez 20 min w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej.

III. Transformacja drożdży

1. Przed rozpoczęciem procedury transformacji drożdży należy przygotować trzy następujące roztwory: 50% [w/v] roztwór glikolu polietylenowego (PEG) 3350, 1 M roztwór LiAc o pH=8,0 oraz roztwór TE (100 mM Tris pH=6,85 i 10 mM EDTA pH=8,0). Roztwory należy wysterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Za pomocą długiego drewnianego pręcika lub sterylnej pętli do szczepienia należy pobrać kolonię drożdży (o średnicy 1-2 mm) ze świeżej płytki i zaszczepić 3 ml pożywki YPD w 15 ml polipropylenowej probówce. Krótko wymieszać na wortexie. Probówkę z kulturą należy umieścić w rollerze i inkubować przez noc w temperaturze 30°C przy stałym obrocie.
3. Rano kulturę należy wyjąć z rollera i wirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy całkowicie usunąć nadsącz.
4. Komórki należy resuspendować w 1 ml buforu do resuspensji (10% [v/v] roztwór TE, 10% [v/v] 1 M roztwór LiAc) i wymieszać na wortexie.
5. Dla każdego plazmidu przeznaczonego do transformacji oraz dla dodatkowej transformacji kontrolnej należy przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do mikropprobówki.
6. Do każdej probówki należy dodać 5 μl jednoniciowego DNA z nasienia łososia (10 mg/ml) oraz 250-500 ng plazmidowego DNA przeznaczonego do transformacji (z wyjątkiem probówki kontrolnej).
7. Do każdej probówki należy ostrożnie dodać 650 μl roztworu do transformacji (10% [v/v] roztwór TE, 10% [v/v] 1 M roztwór LiAc, 80% [v/v] 50% [w/v] roztworu PEG) i wymieszać na wortexie.
8. Inkubować w temperaturze 30°C przez 30 min na rollerze.
9. Probówki należy wyjąć z shakera, dodać 70 μl DMSO i wymieszać, odwracając probówki 10-15 razy (nie używać wortexa, aby uniknąć rozbicia komórek).
10. Probówki należy umieścić w podgrzanej do 42°C łaźni wodnej i inkubować przez 15 min.
11. Probówki należy wyjąć z łaźni wodnej i niezwłocznie umieścić na lodzie na 2 min.
12. Po ochłodzeniu probówek należy je wirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
13. Probówki należy wyjąć z mikrowirówki i ostrożnie usunąć lepki nadsącz za pomocą pipety.
14. Osad komórkowy z każdej probówki należy resuspendować w 150 μl sterylnej wody dwukrotnie destylowanej (DDW), a następnie wysiać zawiesinę komórkową na płytkę z syntetyczną pożywką kompletną zawierającą 2% glukozy jako źródła węgla i pozbawioną aminokwasu lub nukleotydu, dla którego plazmid zapewnia prototrofię.
15. Płytki należy pozostawić otwarte przez 2 min w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu ich osuszenia. Następnie płytki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 30°C na dwa do trzech dni.
16. Po pojawieniu się kolonii (o średnicy 1-2 mm) na płytkach, należy pobrać około 10 pojedynczych kolonii z każdej transformacji i przenieść je na świeżą płytkę. Podczas przenoszenia kolonii należy wykonać smugi o wymiarach 2 cm x 2 cm, aby umożliwić wzrost dużej ilości komórek drożdży. Płytki należy inkubować w inkubatorze w temperaturze 30°C przez dwa dni.
17. Po urośnięciu smug drożdży należy wyjąć płytki z inkubatora i uszczelnić je parafilmem. Płytki można przechowywać w temperaturze 4°C. Kolonie należy przenosić na świeże płytki co 10-14 dni.

IV. Przygotowanie ekstraktu białkowego z drożdży w celu weryfikacji ekspresji efektora za pomocą immunoblottingu

1. Przenieś kolonię drożdży (o średnicy 1-2 mm) ze świeżej płytki do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml odpowiedniego syntetycznego podłoża kompletnego, uzupełnionego o 2% glukozy jako źródła węgla i pozbawionego aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Umieść probówkę z kulturą w walcarku i inkubuj przez noc w temperaturze 30°C.
2. Następnego dnia zdejmij kulturę z walcarka i odwiruj przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wyjmij probówki z wirówki i odlej nadsącz.
3. Resuspenduj osad komórkowy w 3 ml sterylnej wody DDW i wymieszaj za pomocą wortexa.
4. Ponownie odwiruj, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 3 ml sterylnej wody DDW.
5. Przenieś 200 μl zawiesiny komórkowej do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml syntetycznego podłoża kompletnego uzupełnionego o 2% galaktozy i 1% rafinozy jako źródła węgla oraz pozbawionego aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Wymieszaj za pomocą wortexa, umieść w walcarku i inkubuj przez noc w temperaturze 30°C.
6. Następnego dnia rano przenieś 1 ml kultury (lub więcej w przypadku kultur o niskiej gęstości) do mikropprobówki. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
7. Od tego momentu pracuj w dygestorium, aby uniknąć wdychania toksycznych oparów β-merkaptoetanolu. Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety i resuspenduj osad komórkowy w 100 μl lodowatego roztworu lizującego (4% [v/v] 5 N NaOH, 0,5% [v/v] β-merkaptoetanol). Intensywnie wymieszaj za pomocą wortexa i inkubuj na lodzie przez 30 min.
8. Podczas inkubacji określ objętość HCl (6 N) wymaganą do miareczkowania 100 μl buforu lizującego do pH 9-10. W tym celu umieść 10 mikropprobówek w statywie i przenieś do każdej z nich 100 μl buforu lizującego. Do każdej probówki dodaj różne objętości (1-10 μl) HCl (6 N) i wymieszaj za pomocą wortexa. Pobierz próbkę i sprawdź pH roztworu za pomocą paska wskaźnika pH.
9. Po zakończeniu inkubacji dodaj do lizatu objętość HCl określoną w poprzednim kroku i wymieszaj za pomocą wortexa (dla lepszej dokładności nanieś roztwór HCl na ściankę probówki, nie wprowadzając końcówki pipety do wnętrza lizatu).
10. Do lizatu dodaj 50 μl 3-krotnego buforu do próbek (30% [v/v] glicerol, 15% [v/v] β-merkaptoetanol, 37,5% [v/v] 500 mM Tris-HCl pH=6,8, 0,15% [w/v] dodecylosiarczan sodu [SDS] oraz kilka ziaren błękitu bromofenolowego) i wymieszaj za pomocą wortexa (jeśli roztwór stanie się żółty, oznacza to, że pH jest zbyt niskie i należy dodać kilka mikrolitrów roztworu lizującego, aż roztwór stanie się niebieski).
11. Gotuj roztwór lizatu przez 5 min na bloku grzewczym po uprzednim przebiciu dziurki w zakrętce mikropprobówki za pomocą igły.
12. Wyjmij mikropprobówkę z bloku grzewczego i pozostaw roztwór do ochłodzenia przez 2 min w temperaturze pokojowej.
13. Wymieszaj roztwór lizatu za pomocą wortexa, a następnie krótkotrwale odwiruj przez 10 s. Nanieś 30 μl na żel SDS-PAGE do analizy immunoblottingowej.

V. Test plamek (Spotting Assay) do wykrywania fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory

1. Z nowej płytki pobrać kolonię drożdży (o średnicy 1-2 mm) zawierającą interesujący plazmid ekspresyjny i zaszczepić ją do 3 ml syntetycznego pożywki kompletnej uzupełnionej o 2% glukozy jako źródła węgla, pozbawionej aminokwasu lub nukleotydu, dla którego plazmid ekspresyjny zapewnia prototrofię, w 15 ml probówce polipropylenowej. Powtórzyć tę samą procedurę dla kontrolnego szczepu drożdży zawierającego pusty plazmid. Probówki z kulturami umieścić w rotatorze i inkubować przez noc w temperaturze 30°C przy stałej rotacji.
2. Następnego dnia wyjąć kultury z rotatora i wirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wyjąć probówki z wirówki i odlać nadsącz.
3. Resuspendować osad komórkowy w 3 ml sterylnej DDW i wymieszać za pomocą wortexa.
4. Powtórzyć etap wirowania i ponownie resuspendować komórki w 3 ml sterylnej DDW.
5. Aby określić gęstość optyczną (OD), przenieść 100 μl każdej kultury do mikroprobówki zawierającej 900 μl DDW i wymieszać wortexem. Przełożyć zawartość probówek do plastikowej kuwety i zmierzyć absorbancję przy długości fali 600 nm (jako referencję wykorzystać kuwetę wypełnioną 1 ml DDW). Obliczyć OD₆₀₀ kultur wyjściowych, mnożąc OD₆₀₀ kultur w kuwecie przez czynnik rozcieńczenia wynoszący 10.
6. Następnie, na podstawie OD₆₀₀ kultur wyjściowych, przygotować w sterylnych mikroprobówkach zawiesiny komórkowe (1 ml) o OD₆₀₀=1.0.
7. Używając 3 sterylnych mikroprobówek wypełnionych 900 μl sterylnej DDW, przygotować trzy 10-krotne rozcieńczenia seryjne (OD₆₀₀=0.1, 0.01 i 0.001) z każdej zawiesiny komórkowej (OD₆₀₀=1.0) przygotowanej w poprzednim kroku.
8. Przygotować dwie płytki zawierające syntetyczną pożywkę kompletną bez aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Pożywka na jednej płytce powinna być uzupełniona o 2% glukozy, a na drugiej o 2% galaktozy i 1% rafinozy. Osuszyć płytki w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej przez 20 min i umieścić je na kratce.
9. Dla każdej kultury nanieść w rzędzie po 10 μl z czterech rozcieńczeń zarówno na pożywkę represyjną, jak i indukcyjną.
10. Po naniesieniu próbek pozostawić płytki otwarte w komorze przez kilka minut. Po wyschnięciu plamek przykryć płytki i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 30°C na 2-3 dni.
11. Po inkubacji wyjąć płytki i przeanalizować wzrost drożdży. Najpierw potwierdzić, że gęstość komórek na płytce z pożywką represyjną jest podobna. Następnie porównać wzrost kultury ekspresjonującej interesujący białkowy efektor z kulturą zawierającą pusty wektor na płytce z pożywką indukcyjną.
    
    Uwaga: efektory mogą oddziaływać na procesy komórkowe, które nie są etapami ograniczającymi tempo wzrostu drożdży w standardowych laboratoryjnych warunkach hodowli. Aby umożliwić identyfikację fenotypów inhibicji wzrostu dla takich efektorów, pożywki indukcyjne można uzupełnić związkami, które zmieniają funkcje komórkowe drożdży, zwiększając tym samym ich wrażliwość na efektory. Listę substancji chemicznych, które można zintegrować z tą procedurą, można znaleźć w pracy Parsons et al. (2004)².

VI. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny test plamkowy drożdży oraz wykrywanie fenotypów hamowania wzrostu indukowanych ekspresją efektorów typu III przedstawiono na Rys. 1. W tym eksperymencie efektory typu III AvrPto, HopAA1-1 i AvrE1 Gram-ujemnej bakterii fitopatogennej Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) wyekspresowano z plazmidu pGML10 zawierającego centromer w szczepie drożdży BY4741, a następnie przetestowano ich zdolność do hamowania wzrostu drożdży. Poszczególne kultury drożdży eksprimujące efektory typu III Pst pod kontrolą indukowalnego galaktozą promotora GAL1 lub zawierające pusty wektor poddano rozcieńczeniom seryjnym i wysiano na podłoża represyjne (glukoza) lub indukcyjne (galaktoza) (Rys. 1). Na podłożu represyjnym szczepy drożdży niosące plazmidy do ekspresji AvrPto i HopAA1-1 wykazały wzrost podobny do szczepu kontrolnego zawierającego pusty wektor. Jednak na tym samym podłożu drożdże niosące AvrE1 wykazały nieco zredukowany wzrost, co prawdopodobnie wynika z pewnego stopnia nieszczelności promotora GAL1 oraz wysokiego efektu cytotoksycznego AvrE1. W warunkach indukcyjnych ekspresja efektora AvrE1 spowodowała drastyczny fenotyp hamowania wzrostu, objawiający się brakiem kolonii w każdym rozcieńczeniu. Jak zaobserwowano wcześniej przez Munkvolda i wsp.³, ekspresja HopAA1-1 również doprowadziła do silnego zahamowania wzrostu, podczas gdy AvrPto nie wykazało żadnego efektu.

Rycina 1. Hamowanie wzrostu drożdży spowodowane ekspresją efektorów typu III AvrE1 i HopAA1-1 z Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst). Szczepy drożdży (BY4741) zawierające plazmid pGML10, pusty lub niosący kasety pod kontrolą GAL1 do indukowalnej galaktozą ekspresji AvrPto, HopAA1-1 lub AvrE1, hodowano przez noc w syntetycznym medium kompletnym uzupełnionym o glukozę (2%) jako źródło węgla, pozbawionym leucyny. Kultury przemyto, znormalizowano do OD₆₀₀=1.0 i naniesiono seryjne rozcieńczenia 10-krotne na syntetyczne kompletne podłoża stałe pozbawione leucyny i zawierające glukozę (2%) lub galaktozę (2%) i rafinozę (1%). Zdjęcia wykonano odpowiednio po 2 i 3 dniach wzrostu w temperaturze 30°C dla drożdży rosnących na podłożach z glukozą i galaktozą.

Dyskusja

W niniejszej prezentacji zilustrowaliśmy, jak wykorzystać drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae jako system heterologiczny do ekspresji bakteryjnych białek efektorowych typu III oraz jak identyfikować fenotypy zahamowania wzrostu indukowane przez efektory. Co ważne, fenotypy te mogą być wykorzystane w przesiewach genetycznych do identyfikacji supresorów negatywnego wpływu efektorów na wzrost drożdży. Supresory mogą reprezentować albo bezpośrednie cele badanego efektora, albo białka uczestniczące w procesac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekstrakt drożdżowy	Difco Laboratories	212750
Pepton	Difco Laboratories	211677
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G5767
Agar	Difco Laboratories	214010
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Azotowa baza drożdżowa bez aminokwasów	Difco Laboratories	291940
Suplement syntetycznej pożywki drożdżowej z pominięciem składników (drop-out)	Sigma-Aldrich	Y2001
D-galaktoza	Sigma-Aldrich	G0750	>99%; <0,1% glukozy
D-rafinoza	Sigma-Aldrich	R0250	>98%
L-leucyna	Sigma-Aldrich	L8000
Uracyl	Sigma-Aldrich	U0750
L-tryptofan	Sigma-Aldrich	T0254
L-histydyna	Sigma-Aldrich	H6034
DNA jednoniciowy z jąder łososi	Sigma-Aldrich	D7656
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879	Przesuszony
Kwas solny (HCl)	Sigma-Aldrich	H1758
Glikol polietylenowy (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	P4338
Octan litu (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4958
Tris (zasada)	JT Baker	4109-02
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
β-merkapto–etanol	Sigma-Aldrich	M6250
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	B6131
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Merck & Co., Inc.	8.22050.1000
Probówki do wirowania (15 ml)	Corning	430052	Sterylne
Kuweta spektrofotometryczna (10x4x45 mm)	Sarstedt Ltd	67.742
Pętla do szczepienia	Sigma-Aldrich	Z643009	Sterylna
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7543
Paski wskaźnikowe pH, pH 6,5-10,0	Merck & Co., Inc.	1.09543.0001