Protokół identyfikacji gatunków ryb w oparciu o DNA

Podsumowanie

Niniejsza publikacja opisuje sposób wykorzystania systemu identyfikacji gatunków ryb Agilent Fish Species Identification System do określania gatunku ryby poprzez ekstrakcję DNA oraz przeprowadzenie analizy PCR i RFLP.

Streszczenie

Opracowaliśmy szybką, prostą i dokładną metodę przesiewową opartą na analizie DNA w celu identyfikacji gatunków ryb występujących w próbkach świeżych i przetworzonych produktów rybnych. Ta wszechstronna metoda wykorzystuje amplifikację PCR DNA genomowego wyekstrahowanego z próbek ryb, a następnie analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) w celu wygenerowania wzorów fragmentów, które można rozdzielić za pomocą systemu Agilent 2100 Bioanalyzer i dopasować do odpowiednich gatunków przy użyciu oprogramowania do dopasowywania wzorów RFLP.

Metoda identyfikacji ryb wykorzystuje prosty i niezawodny protokół oparty na kolumnach wirowych do izolacji DNA z próbek ryb. Próbki są poddawane działaniu proteinazy K w celu uwolnienia kwasów nukleinowych do roztworu. Następnie DNA jest izolowane poprzez zawieszenie próbki w buforze wiążącym i naniesienie jej na mikrokolumny wirowe zawierające matrycę z włókien krzemionkowych. Kwasy nukleinowe w próbce wiążą się z matrycą włóknistą. Unieruchomione kwasy nukleinowe są płukane w celu usunięcia zanieczyszczeń, a całkowite DNA jest odzyskiwane w końcowej objętości 100 μl. Izolowane DNA jest gotowe do amplifikacji PCR z użyciem dostarczonych starterów, które wiążą się z sekwencjami występującymi we wszystkich genomach ryb. Produkty PCR są następnie trawione trzema różnymi enzymami restrykcyjnymi i analizowane za pomocą Agilent 2100 Bioanalyzer. Długości fragmentów powstałych w reakcjach trawienia mogą być wykorzystane do określenia gatunku ryby, z której przygotowano próbkę DNA, przy użyciu oprogramowania do dopasowywania wzorów RFLP zawierającego bazę danych eksperymentalnie wyznaczonych wzorów RFLP dla komercyjnie istotnych gatunków ryb.

Protokół

1: Przygotowanie próbek ryb do ekstrakcji DNA

1. Dla każdej próbki ryby przeznaczonej do badania należy umieścić fragment tkanki rybiej o masie od 10 mg do 1 g (surowej lub gotowanej) w pojedynczej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Jako wskazówkę do szacowania masy surowej próbki ryby na podstawie jej wielkości należy wykorzystać poniższą rycinę.
   
   
   Rycina 1. Szacowanie masy próbek ryb na podstawie ich wielkości.
   
   
2. Należy wstępnie podgrzać bufor do trawienia Proteinazą K do 65°C przez 5 minut w inkubatorze lub łaźni wodnej.
3. Należy przygotować roztwór roboczy Proteinazy K, łącząc 200 μl buforu do trawienia Proteinazą K i 20 μl Proteinazy K na każdą próbkę.
   Uwaga: Przed każdym użyciem należy przygotować świeży roztwór roboczy Proteinazy K.
4. Do każdej probówki 1,5 ml z próbką ryby należy dodać 220 μl roztworu roboczego Proteinazy K. Probówki należy inkubować w temperaturze 65°C przez 10 minut w inkubatorze lub łaźni wodnej.
5. Probówki należy wirować w mikrocentryfudze przez 3–5 minut przy 14 000 x g, aby utworzyć osad z nietrawionych tkanek.
6. Należy przenieść 150 μl każdego nadsączu do nowej probówki 1,5 ml. Należy unikać przenoszenia jakiegokolwiek nietrawionego materiału z dna probówki lub tłustych substancji, które mogą znajdować się na powierzchni. Te probówki z nadsączem stanowią próbki, z których zostanie wyekstrahowane genomiczne DNA.

2: Izolacja genomowego DNA

1. W sterylnym pojemniku (probówce polipropylenowej lub szklanej butelce) należy przygotować roztwór roboczy sulfolanu i buforu wiążącego kwasy nukleinowe (Nucleic Acid Binding Buffer), łącząc 320 μl 90% sulfolanu i 170 μl buforu do wiązania kwasów nukleinowych na próbkę.
   Zaleca się przygotowanie takiej ilości tej mieszaniny, która wystarczy do opracowania wszystkich próbek planowanych do analizy w ciągu najbliższych 4 tygodni. Mieszaninę tę można przechowywać do 30 dni w temperaturze pokojowej. Należy unikać wystawiania mieszaniny na działanie światła podczas przechowywania.
2. Dodaj 490 μl mieszaniny sulfolanu i buforu wiążącego (przygotowanej w kroku 1 powyżej) do każdej próbki ryby. Próbkę należy wymieszać w wstrząsarze typu vortex lub kilkukrotnie pipetować aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny. Dodanie tej mieszaniny spowoduje zwiększenie całkowitej objętości każdej próbki do 640 μl.
3. Przenieś każdą próbkę do kolumienki wiążącej DNA (DNA Binding Spin Cup) umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml (dołączonej do zestawu), a następnie zamknij probówkę, dociskając jej zakrętkę do góry kolumienki.
4. Wirować próbki w mikrowirówce przez 1 minutę przy 14 000 x g, aby osadzić DNA na matrycy kolumny wirowej.
5. Usuń i zachować kubeczki do wirowania i odrzucić filtraty. W przypadku każdej próbki należy umieścić koszyczek wirówki z powrotem w probówce zbiorczej, a następnie dodać 500 μl buforu do płukania o wysokim zasoleniu (1x High Salt Wash Buffer) i zakręcić probówkę.
6. Wirować próbki w mikrowirówce przy 14 000 x g przez 1 minutę.
7. Usuń i zachować kubeczki wirówki i odrzucić filtraty. Dla każdej próbki umieścić koszyczek wirówki z powrotem w probówce zbiorczej, a następnie dodać 500 μl 80% etanolu i zakręcić probówkę.
8. Wiruj próbki w mikrowirowarce z prędkością 14 000 x g przez 1 minutę.
9. Powtórz kroki 7 i 8 jeszcze dwukrotnie, aby w sumie przeprowadzić 3 przemycia za pomocą 500 μl 80% etanolu.
10. Po trzecim płukaniu w 80% etanolu wyjąć i zachować wirówki do odwirowywania (spin cups) a następnie odrzuć filtraty. Umieść koszyczki wirówkowe z powrotem w probówkach i wiruj w mikrocentryfużce przez 2 minuty przy 14 000 x g, aby osuszyć matrycę włóknistą.
11. Przenieść probówki wirówkowe (spin cups) do probótek do zbierania o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 μl buforu do elucji do każdej kolumny wirowej, bezpośrednio na matrycę z włókna wewnątrz kolumny. Zatrzasnąć nakrętki probówek zbiorczych na kolumnach wirowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
12. Wirować próbki w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 1 minutę.
13. Oczyszczone DNA znajduje się w buforze elucyjnym w probówce do mikrocentryfugi. Usuń koszyk wirówki i zakręć probówki. DNA można przechowywać w temperaturze 4°C do jednego miesiąca. W przypadku przechowywania długoterminowego DNA należy przechowywać w 20°C lub 80°C.
14. W razie potrzeby można zmierzyć stężenie próbek DNA za pomocą spektrofotometru.

Protokół ekstrakcji genomowego DNA zazwyczaj pozwala na uzyskanie próbek o stężeniu od 5 ng/μl do 500 ng/μl. Protokół PCR-RFLP działa prawidłowo przy próbkach DNA o stężeniu od 0,05 ng/μl do 2000 ng/μl.

3: Przygotowanie reakcji PCR

1. Przygotuj 50 ng/μl rozcieńczenie dodatniej kontroli DNA łososia poprzez połączenie 8 μl roztworu zapasu DNA za pomocą 32 μl sterylnej wody wolnej od DNaz. Wymieszać za pomocą vortexa.
   Rozcieńczoną próbkę można przechowywać w temperaturze 4°C do późniejszego użycia.
2. Przygotować reakcje, łącząc składniki wymienione w poniższej tabeli w podanej kolejności. Dla wszystkich reakcji PCR przeprowadzanych jednocześnie przygotować jedną wspólną mieszaninę odczynników, zwiększając proporcjonalnie objętości podane w tabeli. Oprócz badanych próbek DNA należy uwzględnić reakcję kontrolną dodatnią oraz reakcję kontrolną bez matrycy. Zaleca się przygotowanie powtórzeń dla każdej badanej próbki DNA. Przygotować ilość mieszaniny odczynników wystarczającą dla wszystkich reakcji oraz dodatkową objętość odpowiadającą jednej reakcji.
   Na przykład, jeśli dysponują Państwo 5 testowymi próbkami DNA, należy przygotować odpowiednią ilość mieszaniny odczynników dla każdego z nich 8 reakcji (5 reakcji testowych, 1 kontrola pozytywna, 1 kontrola bez matrycy i 1 nadmiar) lub 13 reakcji jeśli uwzględniają Państwo powtórzenia reakcji testowych (10 powtórzeń reakcji testowych, 1 kontrolę pozytywną, 1 kontrolę bez matrycy i 1 nadmiar).
   Mieszanina odczynników do PCR

   Komponent	Reakcja w objętości 1	Tom 5 Reakcje
   dH2O, sterylne	9 μl	45 μl
   2x Master Mix do PCR	12.5 μl	62.5 μl
   Mieszanina starterów	2.5 μl	12.5 μl
   Objętość całkowita	24 μl	120 μl

3. Dokładnie wymieszać mieszaninę odczynników za pomocą vortexa, a następnie rozdysponować 24 μl do każdej z pojedynczych cienkościennych probówek do reakcji PCR.
4. Dodaj 1 μl rozcieńczonego DNA kontroli pozytywnej do probówki z reakcją kontroli pozytywnej. Do probówek z próbkami testowymi dodać 1 μl próbki DNA do badania. W przypadku reakcji kontrolnej bez matrycy należy dodać 1 μl wody wolnej od DNazy zamiast DNA.
   Aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych, należy używać nowej końcówki do pipety dla każdej próbki DNA. Po dodaniu próbki wymieszaj odczynnik, szybko pipetując zawartość probówki w górę i w dół.
5. Zakręć probówki reakcyjne, wymieszaj ich zawartość za pomocą wortexa, a następnie krótko odwiruj probówki w wirówce.

4: Przeprowadzenie protokołu PCR

1. Umieść reakcje w termocyklerze i uruchom program PCR przedstawiony poniżej.
   Protokół cykli PCR

   Segment	Liczba cykli	Temperatura	Czas trwania
   1	1	95°C	5 minut
   2	40	95°C 50°C 72°C	30 sekundów 30 sekundów 30 sekundów
   3	1	72°C	7 minut

5: Trawienie produktów PCR za pomocą enzymów restrykcyjnych

1. Oznakuj probówki 0,5 ml lub probówki paskowe 0,2 ml, które będą wykorzystane do reakcji trawienia restrykcyjnego. Każda reakcja PCR zostanie poddana trawieniu trzema różnymi enzymami restrykcyjnymi: DdeI, HaeIII i NlaIII. W związku z tym dla każdej reakcji PCR oznakuj trzy oddzielne probówki, podając nazwę próbki PCR oraz nazwę enzymu restrykcyjnego.
2. Przygotuj mieszaninę odczynników do trawienia enzymem DdeI, łącząc poniższe składniki w podanej kolejności. Przygotuj jedną wspólną mieszaninę odczynników dla wszystkich reakcji trawienia DdeI (z nadwyżką odpowiadającą objętości co najmniej jednej reakcji), stosując wielokrotności każdego składnika. Po zakończeniu etapu PCR produkty reakcji są traktowane enzymami restrykcyjnymi w celu analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).
   Mieszanina odczynników do trawienia DdeI

   Składnik	Objętość
   dH2O, sterylna	1.5 μl
   10x Bufor DdeI	0.5 μl
   10x enzym DdeI	0.5 μl

3. Dobrze wymieszaj mieszaninę odczynników w wortexie, a następnie rozdziel po 2,5 μl do poszczególnych probówek reakcyjnych oznakowanych dla DdeI.
4. Przygotuj mieszaninę odczynników do trawienia enzymem HaeIII, łącząc poniższe składniki w podanej kolejności. Przygotuj jedną wspólną mieszaninę odczynników dla wszystkich reakcji trawienia HaeIII (z nadwyżką odpowiadającą objętości co najmniej jednej reakcji), stosując wielokrotności każdego składnika.
   Mieszanina odczynników do trawienia HaeIII

   Składnik	Objętość
   dH2O, sterylna	1.5 μl
   10x Bufor HaeIII	0.5 μl
   10x enzym HaeIII	0.5 μl

5. Dobrze wymieszaj mieszaninę odczynników w wortexie, a następnie rozdziel po 2,5 μl do poszczególnych probówek reakcyjnych oznakowanych dla HaeIII.
6. Przygotuj mieszaninę odczynników do trawienia enzymem NlaIII, łącząc poniższe składniki w podanej kolejności. Przygotuj jedną wspólną mieszaninę odczynników dla wszystkich reakcji trawienia NlaIII (z nadwyżką odpowiadającą objętości co najmniej jednej reakcji), stosując wielokrotności każdego składnika.
   Mieszanina odczynników do trawienia NlaIII

   Składnik	Objętość
   dH2O, sterylna	1.5 μl
   10x Bufor NlaIII	0.5 μl
   10x enzym NlaIII	0.5 μl

7. Dobrze wymieszaj mieszaninę odczynników w wortexie, a następnie rozdziel po 2,5 μl do poszczególnych probówek reakcyjnych oznakowanych dla NlaIII.
8. Do każdej reakcji trawienia dodaj 2,5 μl odpowiedniego produktu PCR do oznakowanych probówek. Wszystkie testowe reakcje PCR, jak również reakcja kontrolna dodatnia, muszą zostać poddane trawieniu wszystkimi trzema enzymami restrykcyjnymi.
9. Wymieszaj reakcje trawienia w wortexie, a następnie krótko odwiruj probówki w wirówce.
10. Inkubuj wszystkie reakcje trawienia w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Inkubację tę można przeprowadzić w termocyklerze. W razie potrzeby reakcje można pozostawić w temperaturze 37°C przez noc.
11. Przenieś reakcje do temperatury 65°C na 15 minut. Ten etap można przeprowadzić w termocyklerze.
12. Do każdej reakcji dodaj 1 μl EDTA 60 mM (dołączonego do zestawu) i dobrze wymieszaj w wortexie.

6: Analiza wzorów trawienia restrykcyjnego

1. Przygotować mieszaninę żelu i barwnika, umieścić chip do DNA na stacji przygotowawczej i nanieść mieszaninę na chip.
2. Pipetować 5 μl markera DNA do dołka oznaczonego symbolem drabinki oraz do każdego z 12 dołków na próbki na chipie.
   Marker DNA znajduje się w zestawie odczynników DNA 1000 Reagent Kit w probówce z zieloną zakrętką.
3. Pipetować 1 μl drabinki DNA do dołka oznaczonego symbolem drabinki.
   Drabinka DNA znajduje się w zestawie odczynników DNA 1000 Reagent Kit w probówce z żółtą zakrętką.
4. Dla każdej z próbek DNA pipetować 1 μl każdej reakcji trawienia restrykcyjnego do jednego z 12 dołków na próbki na chipie, zgodnie z wytycznymi na poniższej rysunku. Stosując to podejście, dołki 1-3 są przeznaczone na 3 reakcje trawienia dla próbki kontrolnej pozytywnej, dołki 4-6 na 3 reakcje trawienia dla próbki testowej 1, dołki 7-9 na 3 reakcje trawienia dla próbki testowej 2, a dołki 10-12 na 3 reakcje trawienia dla próbki testowej 3. Przeanalizować reakcje trawienia restrykcyjnego na analizatorze Agilent 2100 Bioanalyzer, aby określić długości fragmentów powstałych podczas trawienia. Instrukcja Agilent DNA 1000 Kit Guide zawiera pełne instrukcje dotyczące uruchamiania chipów laboratoryjnych na Bioanalyzerze. Poniżej zamieszczono skrócony protokół dla ułatwienia.
   
   
   Rysunek 2. Organizacja próbek na chipie.
   
   Jeśli dysponują Państwo mniej niż 4 próbkami DNA, należy pipetować 1 μl wody do niewykorzystanych dołków. Jeśli dysponują Państwo więcej niż 4 próbkami DNA, konieczne będzie użycie więcej niż jednego chipu. Należy pamiętać, że nie ma potrzeby analizowania próbki kontrolnej pozytywnej na każdym chipie.
5. Umieścić chip poziomo w adapterze mieszalnika wiertłowego IKA i mieszać w wibratorze (vortex) przez 60 sekund przy 2400 rpm.
6. Włożyć chip do analizatora Agilent 2100 Bioanalyzer i rozpocząć analizę chipu. Przychodzące surowe sygnały są wyświetlane w kontekście Instrument.
   Po zakończeniu analizy piki są identyfikowane dla wszystkich próbek przy użyciu ustawień algorytmu wykrywania pików. Jeśli uważają Państwo, że algorytm nie wykrył rzeczywistego piku, można obniżyć wartość progową Height Threshold do poziomu, który pozwoli algorytmowi na zidentyfikowanie piku.
7. Przejść do kontekstu Assay i wybrać kartę Chip Summary. W polu Sample Name wpisać nazwy próbek dla wszystkich 12 dołków na chipie, jak pokazano na poniższej rysunku.
   
   
   Rysunek 3. Wprowadzanie nazw próbek w karcie Chip Summary.

7: Identyfikacja gatunku próbki testowej za pomocą programu RFLP Matcher

Aplikacja programistyczna RFLP Decoder firmy Agilent może być wykorzystana do identyfikacji gatunków ryb w testowych próbkach DNA na podstawie długości fragmentów powstałych w reakcjach trawienia. Tabela 7 Oczekiwane rozmiary fragmentów DNA w dodatniej kontroli – Oczekiwany rozmiar produktu dla enzymu restrykcyjnego (bp) DdeI 117, 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 Przedstawione tutaj instrukcje wykorzystują domyślne ustawienia analizy w programie RFLP Matcher. Szczegółowe informacje dotyczące obsługi oprogramowania i interpretacji wyników znajdują się w systemie pomocy programu.

1. Uruchom program RFLP Decoder.
2. Kliknij File > Open > XAD File.
   Otworzy się okno dialogowe Open.
3. Wybierz plik XAD dla chipa DNA, który zawierał reakcje trawienia restrykcyjnego. Kliknij Open.
   Otworzy się okno dialogowe z listą próbek, które zostały naniesione na chip.
4. Wybierz trzy reakcje trawienia odpowiadające jednej próbce DNA i określ odpowiedni enzym restrykcyjny dla każdej próbki, korzystając z menu rozwijanego w kolumnie Enzyme. Na poniższej rycinie kolumna Enzyme została wypełniona dla próbki DNA 1.
   
   
   Rycina 4. Określanie enzymu restrykcyjnego dla każdej próbki.
   
   
5. W polu opisanym jako „min peak height as % of lower marker” wartość domyślna wynosi 10,0%. W razie potrzeby wartość tę można obniżyć, aby zidentyfikować pominięte małe piki, lub podwyższyć, aby odrzucić piki wynikające z niespecyficznego szumu w elektroferogramie. Po wprowadzeniu jakichkolwiek korekt wartości minimalnej wysokości piku kliknij Reintegrate.
   
   
   Rycina 5. Przypisywanie minimalnej wysokości piku.
   
   
6. Kliknij Calc na dole okna dialogowego.
   Dane o długości fragmentów uzyskane z analizy Bioanalyzer zostaną wprowadzone do pól oprogramowania.
7. Z listy rozwijanej score w lewym górnym rogu ekranu wybierz odpowiedni algorytm do analizy danych. Jeśli analizowana próbka ryb składa się z jednego gatunku ryb, wybierz Dice (Nei Li) z listy rozwijanej score. Jeśli próbki mogą składać się z mieszaniny gatunków, wybierz Mixture.
   Tabela na dole ekranu opisana jako combined score wyświetla najlepsze dopasowania gatunków na podstawie wyników wszystkich trzech reakcji trawienia. W tabeli wymienione są nazwy gatunkowe oraz nazwy pospolite (patrz poniżej). Idealne dopasowania (te z wynikiem 1) są wyróżnione na zielono. Dopasowania wyróżnione na żółto są uznawane za dopasowania zbliżone. Można dwukrotnie kliknąć nazwę gatunku, aby otworzyć stronę internetową FishBase dla tego gatunku.
   
   
   Rycina 6. Identyfikacja gatunków na podstawie trawienia.
   
   
8. W polach lower cutoff i match tolerance na górze ekranu można dostosować ustawienia domyślne, aby poprawić wynik najlepszego dopasowania gatunku. Wartość lower cutoff jest używana do odrzucenia fragmentów krótszych niż długość określona w tym polu. Wartość match tolerance określa, jak bliska długością musi być długość fragmentu w stosunku do przewidywanego fragmentu, aby zostało ono uznane za dopasowane.
9. Powtórz kroki od 4 do 8 dla pozostałych próbek DNA, które znajdowały się na tym samym chipie.

8: Reprezentatywne wyniki:

Na poniższej rycinie przedstawiono obraz żelu z Bioanalyzera z próbkami trawienia restrykcyjnego czterech różnych gatunków ryb. Oczekiwane wyniki dla pozytywnej próbki DNA zostały podsumowane w poniższej tabeli.


Rycina 7. Obraz żelu z Bioanalyzera dla próbek reakcji trawienia restrykcyjnego. Każda ścieżka żelu jest oznaczona enzymem restrykcyjnym użytym w danej reakcji.

Oczekiwane rozmiary fragmentów DNA w dodatniej kontroli łososia

Rycina 8. Oczekiwane rozmiary fragmentów DNA w dodatniej kontroli łososia.

Dyskusja

Prezentujemy prostą, szybką i dokładną metodę przesiewową opartą na analizie DNA, służącą do identyfikacji gatunków ryb w produktach spożywczych z owoców morza. Ta skuteczna metoda dostarcza powtarzalnych i precyzyjnych wyników w czasie krótszym niż jeden dzień roboczy i może zostać wdrożona w komercyjnych laboratoriach badawczych dzięki usprawnionym protokołom i prostemu zestawowi aparatury. Charakteryzuje się ona generowaniem obiektywnych danych, które są analizowane za pomocą oprogramowania RFLP Decoder z rozszerzalną bazą danych profili gatunków ryb uzyskanych drogą eksperymentalną.

Przy rutynowym wdrożeniu, ta metoda testowania ma potencjał zapobiegania błędnemu etykietowaniu produktów z owoców morza oraz pomagać w prowadzeniu dokładnej dokumentacji niezbędnej do zachowania zgodności z przepisami rządowymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agilent 2100 Bioanalyzer (ze stacją do przygotowania chipów i mieszadłem wirującym IKA)	Agilent Technologies	G2939AA
laptop Agilent 2100 Bioanalyzer &oprogramowanie specjalistyczne Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - komputer stacjonarny PC &oprogramowanie specjalistyczne Expert Software
zestaw odczynników Agilent Bioanalyzer DNA 1000 (nr kat. 5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Termocykler	Różne	Różne
Probówki paskowe do PCR	Agilent Technologies	401428
Nakrętki do pasków PCR	Agilent Technologies	401425
Statyw roboczy na płytki 96-dołkowe	Agilent Technologies	410094
Zestaw do izolacji DNA w systemie identyfikacji gatunków ryb	Agilent Technologies	Kontakt
Zestaw odczynników PCR-RFLP do systemu identyfikacji gatunków ryb	Agilent Technologies	Kontakt
Oprogramowanie RFLP Matcher	Agilent Technologies	Kontakt
100% etanol, 200 proof (klasy USP lub równoważny)	Różne	Różne
Sterylna woda wolna od nukleaz	Różnorodne	Różne
Pipety automatyczne	Różne	Różne
Inkubator lub łaźnia wodna ustawiona na 65°C°C	Różnorodne	Różne
Sterylna butelka szklana lub probówka polipropylenowa (np. 14-ml BD Falcon z polipropylenu)	Różne	Różne
probówki z okrągłym dnem lub 50-ml polipropylenowe probówki stożkowe BD Falcon)	Różnorodne	Różne
Mieszadło wirowirujące	Różne	Różnorodne
Mikrowirówka	Różne	Różnorodne
Probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml	Różne	Różnorodne
Statyw na probówki 1,5 ml	Różne	Różnorodne
końcówki do pipet	Różne	Różne