Protokół identyfikacji gatunków ryb na podstawie DNA

Summary

Ta publikacja opisuje, jak korzystać z Systemu Identyfikacji Gatunków Ryb Agilent do identyfikacji gatunków ryb poprzez ekstrakcję DNA i przeprowadzanie analizy PCR i RFLP.

Abstract

Opracowaliśmy szybką, prostą i dokładną metodę badań przesiewowych opartą na DNA, aby zidentyfikować gatunki ryb obecne w świeżych i przetworzonych próbkach owoców morza. Ta wszechstronna metoda wykorzystuje amplifikację PCR genomowego DNA wyekstrahowanego z próbek ryb, a następnie analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) w celu wygenerowania wzorców fragmentów, które można rozwiązać w bioanalizatorze Agilent 2100 i dopasować do właściwych gatunków za pomocą oprogramowania do dopasowywania wzorców RFLP.

Metoda identyfikacji ryb wykorzystuje prosty, niezawodny protokół oparty na kolumnach wirowych do izolowania DNA z próbek ryb. Próbki poddaje się działaniu proteinazy K w celu uwolnienia kwasów nukleinowych do roztworu. DNA jest następnie izolowane przez zawieszenie próbki w buforze wiążącym i załadowanie do kubka z mikrowirowaniem zawierającego matrycę z włókien krzemionkowych. Kwasy nukleinowe w próbce wiążą się z matrycą włóknistą. Unieruchomione kwasy nukleinowe są płukane w celu usunięcia zanieczyszczeń, a całkowite DNA jest odzyskiwane w końcowej objętości 100 μl. Wyizolowane DNA jest gotowe do amplifikacji PCR za pomocą dostarczonych starterów, które wiążą się z sekwencjami znajdującymi się we wszystkich genomach ryb. Produkty PCR są następnie trawione za pomocą trzech różnych enzymów restrykcyjnych i rozpuszczane w bioanalizatorze Agilent 2100. Długości fragmentów powstające w reakcjach trawienia można wykorzystać do określenia gatunku ryb, z których przygotowano próbkę DNA, przy użyciu oprogramowania do dopasowywania wzorców RFLP zawierającego bazę danych eksperymentalnie uzyskanych wzorców RFLP od komercyjnie istotnych gatunków ryb.

Protocol

1: Przygotuj próbki ryb do ekstrakcji DNA

1. Dla każdej próbki ryby, która ma być poddana badaniu, umieścić kawałek tkanki rybnej o wadze od 10 mg do 1 g (surowej lub gotowanej) w jednej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Poniższy rysunek służy jako wskazówka do oszacowania masy próbki surowej ryby na podstawie wielkości próbki.
   
   
   Rysunek 1. Oszacowanie masy próbek ryb na podstawie wielkości próbki.
   
   
2. Podgrzej bufor do trawienia proteinazy K do temperatury 65°C przez 5 minut w inkubatorze lub łaźni wodnej.
3. Przygotować roztwór roboczy proteinazy K, łącząc 200 μl buforu wytrawiającego proteinazę K i 20 μl proteinazy K na próbkę.
   Uwaga: Przygotuj świeży roztwór roboczy proteinazy K przed każdym użyciem.
4. Dodać 220 μl roztworu roboczego proteinazy K do każdej 1,5 ml probówki próbki ryb. Inkubować probówki w temperaturze 65°C przez 10 minut w inkubatorze lub łaźni wodnej.
5. Wiruj probówki w mikrowirówce przez 3 5 minut w temperaturze 14 000 x g, aby rozpalić niestrawione tkanki.
6. Przenieść 150 μl każdego supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Unikaj przenoszenia niestrawionego materiału z dna probówki lub jakiegokolwiek oleistego materiału, który może znajdować się w górnej części probówki. Te probówki supernatantu są próbkami, z których zostanie wyekstrahowane genomowe DNA.

2: Ekstrakcja genomowego DNA

1. W sterylnym pojemniku (probówka polipropylenowa lub szklana butelka) przygotuj roztwór roboczy sulfolianu i buforu wiążącego kwasy nukleinowe, łącząc 320 μl 90% sulfolanu i 170 μl buforu wiążącego kwasy nukleinowe na próbkę.
   Możesz przygotować wystarczającą ilość tej mieszaniny, aby przetworzyć tyle próbek, ile planujesz zbadać w ciągu najbliższych 4 tygodni. Ta mieszanina może być przechowywana do 30 dni w temperaturze pokojowej. Unikaj wystawiania mieszaniny na działanie światła podczas przechowywania.
2. Dodać 490 μl mieszaniny sulfolanu i buforu wiążącego (przygotowanej w kroku 1 powyżej) do każdej próbki ryb. Kilkakrotnie odpipetować lub pipetować próbkę, aż do homogenizacji. Dodanie tej mieszaniny spowoduje, że całkowita objętość każdej próbki wyniesie 640 μl.
3. Przenieś każdą próbkę do kubka wirowego wiążącego DNA, który został umieszczony w probówce o pojemności 2 ml (w zestawie) i zatrzaśnij nakrętkę probówki na górze kubka wirowego.
4. Wirować próbki w mikrowirówce przez 1 minutę przy 14 000 x g, aby załadować DNA na matrycę kubka wirowego.
5. Wyjąć i zachować kubki wirowe i wyrzucić filtraty. Dla każdej próbki wymień kubek wirowy w probówce pojemnika, a następnie dodaj 500 μl 1x buforu do płukania o wysokiej zawartości soli i zakryj probówkę.
6. Obracać próbki w mikrowirówce o masie 14 000 x g przez 1 minutę.
7. Wyjąć i zachować kubki wirowe i wyrzucić filtraty. Dla każdej próbki wymień kubek wirowy w probówce pojemnika, a następnie dodaj 500 μl 80% etanolu i zakryj probówkę.
8. Obracać próbki w mikrowirówce o masie 14 000 x g przez 1 minutę.
9. Powtórz kroki 7 i 8 jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania z użyciem 500 μl 80% etanolu.
10. Po trzecim przemyciu w 80% etanolu wyjąć i zachować kubki wirowe oraz wyrzucić filtraty. Wymień kubki wirowe w probówkach z pojemnikami i wiruj w mikrowirówce przez 2 minuty przy 14 000 x g, aby wysuszyć matrycę włóknistą.
11. Przenieś kubki wirujące do probówek zbiorczych o pojemności 1,5 m1. Dodaj 100 μl buforu elucyjnego do każdej filiżanki wirowej bezpośrednio na matrycy włókien wewnątrz kubka. Zatrzaśnij nakrętki probówek zbiorczych na kubkach wirowych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
12. Wirować próbki w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 1 minutę.
13. Oczyszczone DNA znajduje się w buforze elucyjnym w probówce mikrowirówki. Wyrzuć kubek wirowy i zakryj rurki. DNA może być przechowywane w temperaturze 4°C przez okres do jednego miesiąca. W przypadku długotrwałego przechowywania DNA należy przechowywać w temperaturze 20°C lub 80°C.
14. W razie potrzeby można zmierzyć stężenie próbek DNA w spektrofotometrze.

Protokół ekstrakcji genomowego DNA zazwyczaj daje próbki o stężeniu od 5 ng/μl do 500 ng/μl. Protokół PCR-RFLP działa dobrze z próbkami DNA w zakresie od 0,05 ng/μl do 2000 ng/μl.

3: Konfiguracja reakcji PCR

1. Przygotować rozcieńczenie 50 ng/μl DNA łososia w ramach kontroli pozytywnej, łącząc 8 μl podstawowego DNA z 32 μl sterylnej wody wolnej od DNaz. Wir do mieszania.
   Rozcieńczona próbka może być przechowywana w temperaturze 4°C do wykorzystania w przyszłości.
2. Przygotuj reakcje, łącząc składniki z poniższej tabeli w kolejności. Przygotuj pojedynczą mieszaninę odczynników dla wszystkich reakcji PCR, które będą przebiegać jednocześnie, skalując w górę objętości wymienione w tabeli. Oprócz badanych próbek DNA należy uwzględnić pozytywną reakcję kontrolną i reakcję kontrolną bez matrycy. Zaleca się przygotowanie podwójnych reakcji PCR dla każdej badanej próbki DNA. Przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny odczynników do wszystkich reakcji plus jeden nadmiar objętości reakcji.
   Na przykład, jeśli masz 5 próbek testowego DNA, przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny odczynników na 8 reakcji (5 reakcji testowych, 1 kontrola pozytywna, 1 kontrola bez matrycy i 1 nadmiar) lub 13 reakcji, jeśli uwzględniasz duplikaty reakcji testowych (10 zduplikowanych reakcji testowych, 1 kontrola pozytywna, 1 kontrola bez matrycy i 1 nadmiar).
   Mieszanina odczynników PCR składnik Tom 1 Reakcja Tom 5 Reakcje dH₂O, sterylne 9 μl 45 μl 2x PCR Master Mix 12,5 μl 62,5 μl Mieszanka podkładowa 2,5 μl 12,5 μl Całkowita objętość 24 μl 120 μl
3. Dobrze zmieszaj mieszaninę odczynników, a następnie rozprowadź 24 μl do każdej pojedynczej cienkościennej probówki reakcyjnej PCR.
4. Dodać 1 μl rozcieńczonego DNA kontroli dodatniej do probówki z reakcją kontroli dodatniej. Do probówek z próbką do badań dodać 1 μl próbki badanego DNA. W przypadku reakcji kontrolnej bez matrycy należy dodać 1 μl wody wolnej od DNaz w miejsce DNA.
   Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, do każdej próbki DNA należy użyć świeżej końcówki pipety. Po dodaniu próbki należy wymieszać reakcję, szybko pipetując zawartość probówki w górę iw dół.
5. Zakryj probówki reakcyjne, zwiruj probówki, aby wymieszać i krótko odwiruj probówki.

4: Uruchom protokół PCR

1. Umieść reakcje w termocyklerze i uruchom program PCR pokazany poniżej.
   Protokół kolarski PCR segment Liczba cykli temperatura czas trwania 1 1 95°C 5 minut cyfra arabska Rozdział 40 95°C
   50°C
   72°C 30 sekund
   30 sekund
   30 sekund 3 1 72°C 7 minut

5: Produkty do analizy PCR z enzymami restrykcyjnymi

1. Oznaczyć probówki o pojemności 0,5 ml lub probówki paskowe o pojemności 0,2 ml, które mają być używane w reakcjach trawienia restrykcyjnego. Każda reakcja PCR zostanie wytrawiona trzema różnymi enzymami restrykcyjnymi: DdeI, HaeIII i NlaIII. Dlatego dla każdej reakcji PCR oznacz trzy oddzielne probówki nazwą próbki PCR i nazwą enzymu restrykcyjnego.
2. Przygotuj mieszaninę odczynników do mineralizacji DdeI, łącząc poniższe składniki w kolejności. Przygotować pojedynczą mieszaninę odczynników dla wszystkich reakcji trawienia DdeI (plus co najmniej jeden nadmiar objętości reakcji), używając wielokrotności każdego składnika. Po zakończeniu PCR reakcje PCR są traktowane enzymami restrykcyjnymi w celu analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).
   Mieszanina odczynników do mineralizacji DdeI składnik głośność dH₂O, sterylne 1,5 μl 10x bufor DdeI 0,5 μl 10x enzym DdeI 0,5 μl
3. Dobrze zmieszać mieszaninę odczynników, a następnie rozprowadzić 2,5 μl do poszczególnych probówek reakcyjnych, które zostały oznaczone jako DdeI.
4. Przygotować mieszaninę odczynników do mineralizacji HaeIII, łącząc poniższe składniki w podanej kolejności. Przygotować pojedynczą mieszaninę odczynników dla wszystkich reakcji trawienia HaeIII (plus co najmniej jeden nadmiar objętości reakcji), używając wielokrotności każdego składnika.
   Mieszanina odczynników do trawienia HaeIII składnik głośność dH₂O, sterylne 1,5 μl 10x Bufor HaeIII 0,5 μl 10x enzym HaeIII 0,5 μl
5. Dokładnie zmieszać mieszaninę odczynników, a następnie rozprowadzić 2,5 μl do poszczególnych probówek reakcyjnych, które zostały oznaczone jako HaeIII.
6. Przygotować mieszaninę odczynników do mineralizacji NlaIII, łącząc poniższe składniki w kolejności. Przygotować pojedynczą mieszaninę odczynników dla wszystkich reakcji roztwarzania NlaIII (plus co najmniej jeden nadmiar objętości reakcji), używając wielokrotności każdego składnika.
   Mieszanina odczynników do mineralizacji NlaIII składnik głośność dH₂O, sterylne 1,5 μl 10x Bufor NlaIII 0,5 μl 10x enzym NlaIII 0,5 μl
7. Dobrze zmieszać mieszaninę odczynników, a następnie rozprowadzić 2,5 μl do poszczególnych probówek reakcyjnych, które zostały oznaczone jako NlaIII.
8. Dla każdej reakcji trawienia dodać 2,5 μl odpowiedniego produktu PCR do oznakowanych probówek. Wszystkie reakcje testowe PCR, jak również reakcja kontroli dodatniej, muszą zostać strawione przez wszystkie trzy enzymy restrykcyjne.
9. Zwirować reakcje trawienia, a następnie krótko odwirować probówki.
10. Inkubować wszystkie reakcje trawienia w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Tę inkubację można przeprowadzić w termocyklerze. W razie potrzeby reakcje można pozostawić na noc w temperaturze 37°C.
11. Przenieść reakcje do 65°C na 15 minut. Ten krok można wykonać w termocyklerze.
12. Dodaj 1 μl 60 mM EDTA (dostarczonego z zestawem) do każdej reakcji i dobrze wiruj.

6: Analizuj wzorce skrótu ograniczeń

1. Przygotuj mieszankę żelu i barwnika, umieść chip DNA na stacji konfekcjonowania chipów i załaduj mieszaninę na chip DNA.
2. Pobrać 5 μl markera DNA do studzienki oznaczonej symbolem drabinki i do każdej z 12 studzienek na próbkę na chipie.
   Marker DNA znajduje się w zestawie odczynników DNA 1000 w probówce z zieloną nakrętką.
3. Wlej 1 μl drabinki DNA do studzienki oznaczonej symbolem drabinki.
   Drabinka DNA znajduje się w zestawie odczynników DNA 1000 w probówce z żółtą nakrętką.
4. Dla każdej z próbek DNA odpipetować 1 μl każdej reakcji trawienia restrykcyjnego do jednego z 12 dołków na próbki na chipie zgodnie z wytycznymi na poniższym rysunku. Stosując to podejście, dołki 1-3 są przeznaczone dla 3 reakcji trawienia dla próbki kontroli pozytywnej, dołki 4-6 są przeznaczone dla 3 reakcji trawienia dla próbki testowej 1, dołki 7-9 są przeznaczone dla 3 reakcji trawienia dla próbki testowej 2, a dołki 10-12 są przeznaczone dla 3 reakcji trawienia dla próbki testowej 3. Przeanalizuj reakcje trawienia restrykcyjnego w bioanalizatorze Agilent 2100, aby określić długości fragmentów wytwarzanych podczas trawienia. Przewodnik po zestawie Agilent DNA 1000 zawiera pełne instrukcje dotyczące uruchamiania chipów laboratoryjnych w bioanalizatorze. Dla Twojej wygody poniżej znajduje się krótki protokół.
   
   
   Rysunek 2. Organizacja próbek na chipie.
   
   Jeśli masz mniej niż 4 próbki DNA, wlej 1 μl wody do nieużywanych studzienek. Jeśli masz więcej niż 4 próbki DNA, będziesz musiał uruchomić więcej niż jeden chip. Należy zauważyć, że nie jest konieczne przeprowadzanie kontroli dodatniej na każdym chipie.
5. Umieść wiór poziomo w adapterze mieszalnika wirowego IKA i wiruj przez 60 sekund z prędkością 2400 obr./min.
6. Włóż chip do bioanalizatora Agilent 2100 i rozpocznij pracę z chipem. Przychodzące nieprzetworzone sygnały są wyświetlane w Instrument context.
   Po zakończeniu serii piki są identyfikowane dla wszystkich próbek przy użyciu ustawień algorytmu wyszukiwania pików. Jeśli uważasz, że algorytm nie wykrył prawdziwego szczytu, możesz obniżyć nastawę progu wysokości do wartości, która pozwala algorytmowi zidentyfikować szczyt.
7. Przejdź do kontekstu testu i wybierz zakładkę Podsumowanie chipów. W polu Sample Name (Nazwa próbki) wprowadź nazwę próbki dla wszystkich 12 dołków na chipie, jak pokazano na poniższym rysunku.
   
   
   Rysunek 3. Przykładowy wpis nazwy w zakładce Podsumowanie układu.

7: Zidentyfikuj gatunki próbki testowej za pomocą RFLP Matcher

Aplikacja RFLP Dekoder oprogramowania Agilent może być używana do identyfikacji gatunków ryb do testowych próbek DNA na podstawie długości fragmentów powstających w reakcjach trawienia. Tabela 7 Oczekiwane rozmiary fragmentów DNA w enzymie ograniczającym kontrolę pozytywną Oczekiwana wielkość produktu (bp) DdeI 117, 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 Instrukcje podane tutaj używają domyślnych ustawień analizy w RFLP Matcher. Zapoznaj się z systemem pomocy oprogramowania, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obsługi oprogramowania i interpretacji wyświetlacza.

1. Uruchom program dekoder RFLP.
2. Kliknij Plik> Otwórz > plik XAD.
   Otworzy się okno dialogowe Otwieranie.
3. Wybierz plik XAD dla chipa DNA, który zawierał reakcje trawienia restrykcyjnego. Kliknij przycisk Open.
   Otworzy się okno dialogowe z listą próbek, które zostały załadowane na chip.
4. Wybierz trzy reakcje trawienia odpowiadające jednej próbce DNA i określ odpowiedni enzym restrykcyjny dla każdej próbki, korzystając z menu rozwijanych w kolumnie Enzym. Na poniższym rysunku kolumna Enzym została wypełniona dla próbki DNA 1,
   
   
   Rysunek 4. Określanie enzymu restrykcyjnego dla każdej próbki.
   
   
5. W polu oznaczonym minimalną wysokością piku jako % dolnego znacznika" wartość domyślna to 10,0%. W razie potrzeby wartość ta może zostać obniżona w celu zidentyfikowania małych pików, które zostały pominięte, lub podniesiona w celu odrzucenia pików wynikających z niespecyficznego szumu w elektroferogramie. Kliknij przycisk Integruj ponownie po wprowadzeniu jakichkolwiek zmian w minimalnej wartości wysokości szczytu.
   
   
   Rysunek 5. Przypisywanie minimalnej wysokości piku.
   
   
6. Kliknij przycisk Calc u dołu okna dialogowego.
   Dane o długości fragmentu uzyskane z przebiegu Bioanalyzer wypełnią pola oprogramowania.
7. Z listy rozwijanej wyników w lewym górnym rogu ekranu wybierz odpowiedni algorytm analizy danych. Jeśli analizowana próbka ryby składa się z jednego gatunku ryby, wybierz Kostkę (Nei Li) z listy rozwijanej wyników. Jeżeli próbki mogą składać się z mieszaniny gatunków, należy wybrać Mieszanina.
   Tabela u dołu ekranu oznaczona jako łączny wynik zawiera listę najlepszych dopasowań gatunków na podstawie wyników wszystkich trzech reakcji trawienia. Nazwa gatunku oraz nazwa zwyczajowa są wymienione w tabeli (patrz poniżej). Idealne dopasowania (te z wynikiem 1) są podświetlone na zielono. Dopasowania zaznaczone na żółto są uważane za bliskie dopasowania. Możesz kliknąć dwukrotnie nazwę gatunku, aby wyświetlić stronę internetową FishBase dla tego gatunku.
   
   
   Rysunek 6. Identyfikacja gatunku na podstawie trawienia.
   
   
8. W dolnych polach odcięcia i tolerancji dopasowania u góry ekranu możesz dostosować ustawienia domyślne, aby poprawić wynik najlepszego dopasowania gatunku. Dolna wartość odcięcia służy do odrzucenia wszelkich fragmentów krótszych niż długość wyznaczona w polu. Wartość tolerancji dopasowania określa, jak blisko długości musi znajdować się fragment przewidywany, aby został uznany za zgodny.
9. Powtórz kroki od 4 do 8 dla pozostałych próbek DNA, które zostały zawarte na tym samym chipie.

8: Reprezentatywne wyniki:

Na poniższym rysunku pokazany jest obraz żelu Bioanlyzer z próbkami trawienia z ograniczeniami od 4 różnych gatunków ryb. Oczekiwane wyniki dla dodatniej próbki DNA podsumowano w poniższej tabeli.


Rysunek 7. Obraz żelu bioanalitycznego próbek reakcji trawienia restrykcyjnego. Każdy pas żelu jest znakowany enzymem restrykcyjnym używanym w tej reakcji.

Oczekiwane rozmiary fragmentów DNA w kontroli pozytywnej łososia

Rysunek 8. Oczekiwane rozmiary fragmentów DNA w kontroli pozytywnej łososia.

Discussion

Demonstrujemy prostą, szybką i dokładną metodę badań przesiewowych opartą na DNA do identyfikacji gatunków ryb w produktach z owoców morza. Ta potężna metoda zapewnia powtarzalne, precyzyjne wyniki w czasie krótszym niż jeden dzień roboczy i może być wdrożona w komercyjnych obiektach testowych dzięki uproszczonym protokołom i prostej konfiguracji. Charakteryzuje się generowaniem obiektywnych danych, które są analizowane za pomocą oprogramowania RFLP Decoder z rozszerzalną bazą danych eksperymentalnych profili gatunków ryb.

Dzięki rutynowemu wdrażaniu, ta metoda testowania może potencjalnie zapobiec błędnemu etykietowaniu produktów z owoców morza i pomóc w utrzymaniu dokładnej dokumentacji odpowiedniej do zgodności z przepisami rządowymi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalizator Agilent 2100 (ze stacją do zasysania wiórów i mieszalnikiem wirowym IKA)	Agilent Technologies	G2939AA
Laptop i bioanalizator Agilent 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - komputery stacjonarne i Expert Software
Zestaw odczynników Agilent Bioanalyzer DNA 1000 (część #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Termocykler	Różne	różne
probówki paskowe do PCR	Agilent Technologies	401428
Nasadki paskowe do PCR	Agilent Technologies	401425
96-dołkowy stojak roboczy	Agilent Technologies
identyfikacji gatunków ryb 410094 Zestaw do izolacji DNA	Agilent Technologies	Skontaktuj się z
systemem identyfikacji gatunków ryb Zestaw odczynników PCR-RFLP	Agilent Technologies	Skontaktuj się z
oprogramowaniem RFLP Matcher	Agilent Technologies	Skontaktuj się
100% etanolem, 200 proof (klasa USP lub odpowiednik)	Różne	Różne
Sterylna, wolna od nukleaz woda	Różne
Różne
Różne Inkubator lub łaźnia wodna ustawiona na 65° C	Różne	Różne
Sterylna szklana butelka lub rurka polipropylenowa (np. 14 ml BD Falcon polipropylen)	Różne	Różne
probówki okrągłodenne lub 50-ml polipropylenowe probówki stożkowe BD Falcon)	Różne	Różne Mieszalnik
wirowy	Różne	Różne
Mikrowirówki	Różne	Różne
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Różne	różne
Stojak na probówki 1,5 ml	Różne	Różne Końcówki
do pipet	Różne	Różne Różne