Znakowanie fluorescencyjne białek fuzyjnych SNAP-tag z ekspresją COS-7 do obrazowania żywych komórek

Poszycie komórek CHO-K1:

1. Dodaj 50-100 μl komórek CHO-K1, które zostały wytrypsynizowane zgodnie ze standardowymi protokołami, do 6 ml kompletnego F-12K.
2.  Wymieszaj zawiesinę komórkową, pipetując kilkakrotnie w górę iw dół, a następnie podnieś 300 μl trypsynizowanej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sterylnego 8-komorowego szkła nakrywkowego Lab-Tek II z komorami ze szkła borokrzemianowego #1,5 (Nalgene Nunc Int.; Produkt #155409; Numer katalogowy: 100808-8-0).
3. Próbki inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO_{2 przez} noc.

Transfekcja przejściowa komórek CHO-K1 za pomocą pSNAP-ADRB2 i pSNAP-H2B:

1. Sprawdź komory do hodowli komórkowych wysiane poprzedniego dnia, aby sprawdzić gęstość i stan zdrowia komórek.
2. Oznacz odpowiednią liczbę probówek do mikrofuge.
3. W okapie z przepływem laminarnym ustawić mieszaniny kompleksów transfekcji zgodnie z poniższą tabelą próbek, używając 0,3 μg DNA plazmidu kontrolnego pSNAP-ADBR2 lub 0,3 μg DNA plazmidu kontrolnego pSNAP-H2B, 1 μl TransPass D2 i 1 μl TransPass V na reakcję. szt. pkt. szt. pkt. szt. szt.

   plazmid	Liczba reakcji	μl pożywki bez surowicy	μl TransPass D2	μl TransPass V	μl plazmidowego DNA	μl TransPass D2/reakcja	μl TransPass V/reakcja	ng DNA/ reakcja	Stężenie DNA (ng/μl)	μl plazmidowego DNA/reakcja
   ZATRZASK-ADRb2	5	236,5 pkt.	5	5	3,5	1	1	300	472,34	0,7
   PRZYCIĄGANIE H2B	5	Rozdział 237	5	5	3	1	1	300	515,89	0,6
   drwić	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Nietransfekowany	5	Z kolei 250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. Najpierw wymieszaj wolny od surowicy F-12K z odpowiednim plazmidowym DNA, następnie dodaj odczynnik do transfekcji TransPass D2, a następnie dodaj odczynnik do transfekcji TransPass V. Dobrze wymieszać składniki, delikatnie pipetując w górę i w dół kilka razy po dodaniu każdego odczynnika.
5. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
6. Podczas inkubacji przemyć komórki raz 600 μl kompletnego DMEM i dodać 450 μl kompletnego DMEM do każdej próbki.
7. Dodać 50 μl mieszaniny kompleksu transfekcji do każdej próbki, powoli i kroplami.
8. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO₂ .

SNAP-Cell TMR Star Oznaczanie komórek CHO-K1 przejściowo transfekowanych pSNAP-ADRB2 i pSNAP-H2B :

1. Ostrożnie usunąć złożone media transfekcyjne z każdej próbki przez odsysanie próżniowe. Przemyć komórki dwukrotnie 600 μl kompletnego F-12K i zastąpić pożywkę w każdym dołku 600 μl kompletnego F-12K.
2. Wymieszaj podłoża do etykietowania barwników, dodając 995 μl kompletnego substratu F-12K i 51 μl 0,6 mM SNAP-Cell TMR-Star . Końcowe stężenie SNAP-Cell TMR-Star powinno wynosić 3 mM.  Odpipetować w górę i w dół kilka razy, aby wymieszać po dodaniu substratu.
3. Ostrożnie usuń pożywkę wzrostową z próbek i dodaj 200 μl pożywki do etykietowania barwników do każdej studzienki. Próbki inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 30 minut.
4. Podczas inkubacji próbek należy przygotować roztwór Hoechst 33342 do barwienia jądrowego próbek, mieszając 1 μl Hoechst 33342, trichlorowodorku, trójwodzianu (10 mg/ml roztwór w wodzie, 16,2 mM roztwór; Sondy molekularne Invitrogen) w 10 ml kompletnego F-12K.
5. Usunąć pożywkę ze wszystkich próbek i dodać 600 μl rozcieńczonego roztworu Hoechsta do każdej próbki. Próbki inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 5 minut.
6. Przemyć próbki trzykrotnie 600 μl kompletnego F-12K.
7. Próbki należy inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez dodatkowe 30 minut, aby umożliwić dyfuzję nieinkorporowanego fluoroforu z komórek.
8. Po 30 minutach zmień pożywkę w próbkach SNAP-Cell po raz ostatni i przystąp do obrazowania.
9. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Apotome Axiovert 200M.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Oto kilka reprezentatywnych wyników obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek COS-7, które wykazują ekspresję fuzji SNAP-tag. Ten pierwszy obraz pokazuje żywe komórki COS-7 eksprymujące pSNAP-H2B (histon jądrowy) znakowane SNAP-Cell TMR-Star. Konstrukt pSNAP-H2B został wygenerowany przy użyciu wektora pSNAP-tag(m). Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star przez 30 minut i barwiono przeciwwagowo Hoechst 33342 (niebieskim) dla jąder. Różowa fluorescencja pokazuje nakładanie się czerwonej fluorescencji, w której oprócz niebieskiej fluorescencji wskazującej na jądro obecne jest białko histonowe. Ekspresja białka H2B jest wyraźnie i łatwo identyfikowana.

Rysunki 2 i 3. Te dwa następne obrazy pokazują żywe komórki COS-7 przejściowo transfekowane pSNAP-ADRβ2.
Komórki zostały oznaczone SNAP-Cell TMR-Star (czerwone) i wybarwione przeciwstawnie Hoechst 33342 (niebieski). Konstrukt pSNAP-ADRβ2 został wygenerowany przy użyciu wektora pSNAP-tag(m). Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star przez 30 minut i barwiono przeciwwagowo Hoechst 33342 (niebieskim) dla jąder. Czerwona fluorescencja wskazuje na obecność białka receptora powierzchniowego komórki ADRB2, podczas gdy niebieska fluorescencja identyfikuje jądro.

Autorzy są zatrudnieni przez New England Biolabs, które produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym artykule.