Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączanie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego w żywych komórkach. Po sklonowaniu i ekspresji białko z tagiem może być stosowane z różnymi substratami w wielu dalszych zastosowaniach bez konieczności ponownego klonowania.
Artykuł metodologiczny
Fluorescencyjne znakowanie linii COS-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych SNAP-tag w celu obrazowania żywych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączanie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego w żywych komórkach. Systemy te oferują szeroki wybór substratów fluorescencyjnych zoptymalizowanych dla różnych urządzeń do obrazowania. Po sklonowaniu i ekspresji białko z tagiem może być wykorzystywane z różnymi substratami w licznych zastosowaniach analitycznych bez konieczności ponownego klonowania. Stosowanie tego systemu składa się z dwóch etapów: klonowania i ekspresji białka docelowego jako fuzji z SNAP-tagiem oraz znakowania tej fuzji wybranym substratem SNAP-tag. SNAP-tag jest małym białkiem opartym na ludzkim O6-alkilguaninowa-DNA-alkilotransferaza (hAGT), białko naprawy DNA. Etykiety SNAP-tag to barwniki sprzężone z grupami opuszczającymi guaniny lub chloropirymidyny za pomocą łącznika benzylowego. W reakcji znakowania podstawiona grupa benzylowa substratu zostaje kowalencyjnie przyłączona do SNAP-tagu. CLIP-tag jest zmodyfikowaną wersją SNAP-tagu, zaprojektowaną tak, aby reagować z pochodnymi benzylo-cytozyny zamiast benzylo-guaniny. Stosowany wspólnie z SNAP-tagiem, CLIP-tag umożliwia ortogonalne i komplementarne znakowanie dwóch białek jednocześnie w tych samych komórkach.
Protokół
Wysiewanie komórek CHO-K1:
- Do 6 ml pełnego medium F-12K dodać 50-100 μl komórek CHO-K1 poddanych trypsynizacji zgodnie ze standardowymi protokołami.
- Zmieszać zawiesinę komórkową poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść po 300 μl zawiesiny komórek po trypsynizacji do każdej studni sterylnego 8-komorowego szkiełka podstawowego Lab-Tek II Chambered Coverglass z komorami z borokrzemianowego szkła okrywkowego nr 1,5 (Nalgene Nunc Int.; Product #155409; Lot: 100808-8-0).
- Próbki inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.
Przejściowa transfekcja komórek CHO-K1 plazmidami pSNAP-ADRB2 i pSNAP-H2B:
- Należy sprawdzić komory hodowli komórkowej zasiane w poprzednim dniu, aby ocenić gęstość oraz stan zdrowia komórek.
- Oznakuj odpowiednią liczbę probówek do mikrowirówki.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przygotować mieszaniny kompleksów do transfekcji zgodnie z poniższą tabelą próbek, wykorzystując albo 0.3 μg plazmid kontrolny DNA pSNAP-ADBR2 lub 0.3 μg plazmidowego DNA kontrolnego pSNAP-H2B, 1 μl TransPass D2 oraz 1 μl TransPass V na reakcję.
plazmid liczba reakcji μl pożywki bezsurowiczej μl TransPass D2 μl z TransPass V μl DNA plazmidowego μl z TransPass D2/reakcji μl TransPass V/reakcja ng DNA/reakcję stężenie DNA (ng/μl) μl plazmidowego DNA/reakcji SNAP-ADRb2 5 236.5 5 5 3.5 1 1 300 472.34 0.7 H2B-SNAP 5 237 5 5 3 1 1 300 515.89 0.6 Symulacja 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 Nietransfekowane 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 - Najpierw należy zmieszać bezsurowicze podłoże F-12K z odpowiednim plazmidowym DNA, następnie dodać odczyn do transfekcji TransPass D2, a potem odczyn do transfekcji TransPass V. Po dodaniu każdego odczynnika należy dokładnie wymieszać składniki, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół kilka razy.
- Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Podczas inkubacji wypłucz komórki raz za pomocą 600 μl pełnego medium DMEM i dodać 450 μl pełnego medium DMEM do każdej próbki.
- Dodaj 50 μl mieszaninę kompleksów transfekcyjnych do każdej próbki, powoli i kroplami.
- Inkubować próbki przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO22.
Znakowanie komórek CHO-K1 przejściowo transfekowanych pSNAP-ADRB2 i pSNAP-H2B za pomocą SNAP-Cell TMR Star:
- Ostrożnie usuń medium z kompleksem transfekcyjnym z każdej próbki za pomocą ssania próżniowego. Przemyj komórki dwukrotnie 600 μl pełnego medium F-12K i zastąp medium w każdej studience 600 μl pełnego F-12K.
- Przygotuj medium do znakowania barwnikiem, dodając 995 μl pełnego F-12K i 51 μl 0.6 mM substratu SNAP-Cell TMR-Star. Końcowe stężenie SNAP-Cell TMR-Star powinno wynosić 3mM. Po dodaniu substratu wymieszaj roztwór, kilkukrotnie pobierając i wypuszczając go pipetą.
- Ostrożnie usuń medium wzrostowe z próbek i dodaj 200 μl medium do znakowania barwnikiem do każdej studzienki. Inkubuj próbki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 30 minut.
- Podczas inkubacji próbek przygotuj roztwór Hoechst 33342 do barwienia jąder komórkowych, mieszając 1 μl Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (roztwór 10 mg/ml w wodzie, stężenie 16.2 mM; Invitrogen Molecular Probes) w 10 ml pełnego F-12K.
- Usuń medium ze wszystkich próbek i dodaj 600 μl rozcieńczonego roztworu Hoechst do każdej próbki. Inkubuj próbki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 5 minut.
- Przemyj próbki trzykrotnie 600 μl pełnego F-12K.
- Inkubuj próbki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez dodatkowe 30 minut, aby umożliwić dyfuzję niezwiązanego fluoroforu z komórek.
- Po 30 minutach wymień medium w próbkach SNAP-Cell po raz ostatni i przystąp do obrazowania.
- Wykonaj obrazowanie komórek przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu Zeiss Apotome Axiovert 200M.
Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazowania fluorescencyjnego z zastosowaniem standardowej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek COS-7 wykazujących ekspresję fuzji SNAP-tag. Pierwszy obraz przedstawia żywe komórki COS-7 exprimujące pSNAP-H2B (histon jądrowy) znakowane SNAP-Cell TMR-Star. Konstrukt pSNAP-H2B został wygenerowany przy użyciu wektora pSNAP-tag(m). Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star przez 30 minut, a następnie wykonano barwienie kontrastowe jąder Hoechst 33342 (niebieski). Różowa fluorescencja stanowi nałożenie czerwonej fluorescencji w miejscach występowania białka histonowego na niebieską fluorescencję wskazującą jądro komórkowe. Ekspresja białka H2B jest wyraźna i łatwa do zidentyfikowania.
Ryciny 2 i 3. Te dwa kolejne obrazy przedstawiają żywe komórki COS-7 przejściowo transfekowane pSNAP-ADRβ2.
Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star (czerwony) i barwiono kontrastowo Hoechst 33342 (niebieski). Konstrukt pSNAP-ADRβ2 został wygenerowany przy użyciu wektora pSNAP-tag(m). Komórki znakowano SNAP-Cell TMR-Star przez 30 minut i barwiono kontrastowo Hoechst 33342 (niebieski) w celu wybarwienia jąder. Czerwona fluorescencja wskazuje na obecność białka receptora powierzchni komórkowej ADRB2, natomiast niebieska fluorescencja identyfikuje jądro.
Dyskusja
Na obserwowane wyniki wpływa kilka zmiennych, takich jak ostrość, intensywność lasera, możliwości sprzętowe, zastosowany obiektyw itp. Fotostabilność fluoroforu determinuje, jak szybko należy zarejestrować fluorescencję przed jej wygaszeniem.
Ta metoda znakowania białek jest wszechstronna i odpowiednia do wielu zastosowań. Technologie SNAP-tag i CLIP-tag, służące do specyficznego znakowania białek fuzyjnych za pomocą sond syntetycznych, umożliwiają badanie różnych aspektów funkcji białek, w tym różnorodnych procesów dynamicznych w żywych komórkach oraz w lizatach komórkowych. Technologie SNAP-, CLIP-, MCP- i ACP-tag zapewniają prostotę i nadzwyczajną wszechstronność w obrazowaniu białek w komórkach żywych i utrwalonych, a także w badaniach białek in vitro. Stworzenie pojedynczej konstrukcji genowej pozwala na uzyskanie znakowanego białka fuzyjnego zdolnego do tworzenia wiązania kowalencyjnego z różnymi grupami funkcyjnymi, w tym z fluoroforami, biotyną lub kuleczkami. Białko docelowe musi zostać sklonowane i wyekspresjonowane tylko raz, a następnie fuzja ta może być wykorzystywana z wieloma fluorescencyjnymi substratami w licznych zastosowaniach analitycznych, takich jak jednoczesne znakowanie białek wewnątrz żywych komórek, badanie lokalizacji i translokacji białek, eksperymenty typu pulse-chase, badania internalizacji receptorów, selektywne znakowanie powierzchni komórki, testy pull-down, detekcja białek w SDS-PAGE, cytometria przepływowa, wysokoprzepustowe testy wiązania na płytkach mikrotitracyjnych, eksperymenty z interakcjami biosensorowymi oraz testy wiązania oparte na FRET.
Oświadczenia
Autorzy są zatrudnieni przez firmę New England Biolabs, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.
Podziękowania
Kai Johnsson
Ivan Correa
Andreas Brecht
Katrin Müentener
Chris Noren
Luo Sun
Ming Xu
Theodore Davis
Salvatore Russello
Aihua Zhang
Inca Ghosh
Elissa Maunus
Nicholas Labarthe
James MacFarland
John Buswell
Brenda Desmond
James Ellard
Grzebień Dona
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki CHO-K1 | ATCC | CCL-61 | |
| Bezserumowe pożywka F-12K | |||
| Szkiełka podstawowe z komorami Lab-Tek II ze szkiełkiem borokrzemianowym #1.5 | Nalge Nunc international | 155409 | Partia: 100808-8-0 |
| DMEM | |||
| H–chst 33342, trihydrochlorowodorek, trihydrat (roztwór 10 mg/ml w wodzie, roztwór 16.2 mM) | Invitrogen | H3570 | 470519 |
| Mikroskop fluorescencyjny Zeiss Apotome Axiovert 200M | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 |
| Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 |
| SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 |
| Plazmid kontrolny pSNAP-ADBR2 | New England Biolabs | N9178S | 0010811 |
| Plazmid kontrolny pSNAP-H2B | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |
Bibliografia
- Johnsson, K. Visualizing biochemical activities in living cells. Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).
- Johnsson, K. SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function. NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).
Przedruki i uprawnienia
