Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Podsumowanie

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ_1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ_1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Streszczenie

Upośledzenie połączeń synaptycznych prawdopodobnie leży u podłoża subtelnych zmian amnestycznych występujących we wczesnych stadiach choroby Alzheimera (AD). Wiadomo, że β-amyloid (Aβ), peptyd produkowany w dużych ilościach w przebiegu AD, redukuje długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP), które jest komórkowym korelatem uczenia się i pamięci. W rzeczywistości upośledzenie LTP wywołane przez Aβ stanowi przydatny paradygmat eksperymentalny do badania dysfunkcji synaptycznych w modelach AD oraz do przesiewania leków zdolnych łagodzić lub odwracać takie zaburzenia synaptyczne. Badania wykazały, że Aβ wywołuje zaburzenia LTP przede wszystkim za pośrednictwem swojej formy oligomerycznej. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół upośledzania LTP poprzez perfuzję oligomeryzowanego syntetycznego peptydu Aβ1-42 na ostre skrawki hipokampa. W tym filmie opisujemy krok po kroku procedurę przygotowania oligomerycznego Aβ_1-42Następnie śledzimy pojedynczy eksperyment, w którym LTP zostaje zredukowane w przekrojach hipokampa poddanych działaniu oligomeryzowanego Aβ_1-42w porównaniu do plastrów w eksperymencie kontrolnym, w którym nie zastosowano Aβ_1-42doszło do ekspozycji.

Protokół

Resuspensja peptydu β-amyloidu

Przed rozpoczęciem należy przygotować:

• Aβ_1-42 (liofilizowany proszek)
• 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)
• Probówki do mikrocentryfugi z polipropylenu o niskim stopniu wiązania (1.5 ml)
• Strzykawka GasTight firmy Hamilton z teflonowym ogranicznikiem tłoka (250 μl)
• Dimetylosulfotlenek (DMSO)

1. Pozostaw liofilizowany Aβ_1-42 w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby uniknąć kondensacji pary wodnej po otwarciu fiolki z peptydem.
2. W dygestorium resuspenduj peptyd Aβ_1-42 w lodowatym HFIP, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 mM, a następnie mieszaj roztwór w wortexie przez kilka sekund.
3. Używając szklanej strzykawki Hamilton GasTight z teflonowym tłokiem, szybko i równomiernie podziel roztwór Aβ_1-42/HFIP do trzech polipropylenowych fiolek i szczelnie je zamknij.
4. Fiolki inkubuj przez 2 godziny, aby umożliwić monomeryzację Aβ. Następnie otwórz fiolki i odparuj roztwór Aβ_1-42/HFIP pod próżnią za pomocą wirówki SpeedVac (800 g, temperatura pokojowa), aż na dnie fiolek pojawi się przejrzysty film peptydowy. Starannie kontroluj temperaturę wewnątrz wirówki SpeedVac, aby uniknąć degradacji peptydu (max 25°C).
5. Zamknij fiolki i przechowuj alikwoty w temperaturze -80°C. Film Aβ można przechowywać przez 6 miesięcy.
6. Resuspenduj jeden film, dodając DMSO, aby uzyskać stężenie Aβ_1-42 do 5 mM. Poddaj próbkę sonikacji w kąpieli wodnej przez 10 minut, aby zapewnić całkowitą resuspensję.
7. Podziel roztwór Aβ_1-42 o stężeniu 5 mM do polipropylenowych fiolek. Szczelnie zamknij wszystkie fiolki i przechowuj je w temperaturze -20°C. Alikwoty należy rozmrażać tylko raz. Uważaj na kondensację wody wewnątrz zamrażarki. Peptydy w roztworze ulegają bardzo łatwej degradacji.

Oligomeryzacja

Przed rozpoczęciem przygotuj:

• Aβ_1-42/DMSO (5mM)
• Sterylny bufor fosforanowy
• Polipropylenowe probówki do mikrowirowania o niskim stopniu wiązania (1,5 ml)
• Polipropylenowe probówki wirówkowe o niskim stopniu wiązania (50 ml)

1. Rozcieńcz uzyskaną aликwotkę Aβ_1-42/DMSO o stężeniu 5mM sterylnym buforem fosforanowym (do objętości 100 μl).
2. Mieszaj w wstrząsarzu typu vortex przez 30 sekund, a następnie inkubuj przez 12 godzin w temperaturze 4°C.

Opracowanie preparatów skrawków hipokampa

Podczas traktowania skrawków hipokampa ważne jest unikanie niespecyficznej adhezji peptydów do zlewów, powierzchni drenów perfuzyjnych oraz komory rejestracyjnej. Należy preferencyjnie stosować pojemniki i dreny z polipropylenu o niskiej wiązalności. Należy unikać stosowania szkła laboratoryjnego lub plastikowych wyrobów ogólnego przeznaczenia. Media perfuzyjne powinny być wolne od surowicy lub albuminy.

Perfuzja Aβ

Przed rozpoczęciem należy przygotować:

• Oligomeryzowany Aβ_1-42
• Bufor do rejestracji (w mM: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 Na₂HPO₄, 25 NaHCO₃, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂ oraz 10 glukozy)
• Układ do rejestracji elektrofizjologicznej z komorą interfejsową
• Poprzeczne skrawki hipokampa inkubowane w natlenionym buforze do rejestracji przez co najmniej 90 minut po wycięciu (T = 29° C; stała szybkość perfuzji = 2 ml/minutę)

1. Bezpośrednio przed eksperymentem rozcieńczyć alikwot oligomeryzowanego Aβ_1-42 do odpowiedniego stężenia roboczego (200 nM lub wyższego) w probówce polipropylenowej z uprzednio natlenionym buforem rejestracyjnym.
2. Przez 20 minut perfundować skrawki roztworem Aβ_1-42 przed indukcją plastyczności synaptycznej.

Indukcja plastyczności i obserwacje kontrolne

1. Zazwyczaj najszerzej stosowanym modelem plastyczności synaptycznej jest LTP. Można go indukować poprzez stymulację tetaniczną danej synapsy w hipokampie. Rejestrujemy odpowiedzi polowe z synaps pomiędzy projekcjami włókien komisarialnych Schaffera a neuronami piramidowymi obszaru CA1 w stratum radiatum. Nasza stymulacja tetaniczna polega na stymulacji wiązkami theta (theta burst stimulation), która obejmuje 3 serie oddzielone 15 sekundowymi odstępami. Każda seria składa się z 10 wiązek o częstotliwości 5 Hz, gdzie każda wiązka zawiera 5 impulsów o częstotliwości 100 Hz. Zastosuj stymulację tetaniczną natychmiast po zakończeniu perfuzji oligomeryzowanego Aβ.
2. Bezpośrednio po stymulacji tetanicznej powróć do perfuzji normalnym buforem rejestracyjnym. Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj stałą prędkość perfuzji, temperaturę komory rejestracyjnej oraz odpowiednie natlenienie.

Reprezentatywne wyniki i możliwe problemy

Oligomery Aβ, otrzymane zgodnie z klasycznym protokołem Stine i wsp.¹, generują monomery Aβ oraz różnorodne oligomery o różnych rozmiarach (dimery, trimery itp.). Perfuzja oligomeryzowanego Aβ_1-42 prowadzi do zmniejszenia LTP w skrawkach traktowanych Aβ w porównaniu ze skrawkami kontrolnymi. W naszych warunkach eksperymentalnych, z wykorzystaniem samców myszy C57BL/6J w wieku 3-5 miesięcy, LTP w skrawkach traktowanych 200 nM Aβ wynosi średnio 150% wartości bazowych dwie godziny po stymulacji tetanicznej, podczas gdy w skrawkach kontrolnych wartości LTP wynoszą średnio 200-250% wartości bazowej2. W niektórych przypadkach traktowanie Aβ może nie doprowadzić do redukcji LTP w hipokampie. Do kilku krytycznych błędów, które mogą wystąpić, należą: nadmierne wysuszenie filmu podczas zagęszczania Aβ oraz niepełna oligomeryzacja. Perfuzja Aβ w skrawkach hipokampa może być kolejnym źródłem problemów ze względu na właściwości fizykochemiczne peptydy Aβ w roztworze, który wykazuje tendencję do niespecyficznej adhezji do tworzyw sztucznych. Rozwiązywanie tych problemów omówiono poniżej.

Dyskusja

Jak opisano powyżej, kilka problemów podczas przygotowywania oligomerycznego Aβ może skutkować niezakłóconym LTP. Jednym ze sposobów oceny, czy doszło do degradacji Aβ lub braku oligomeryzacji Aβ, jest analiza preparatu Aβ za pomocą analizy TRIS-Tricine PAGE/Western Blotting oraz analitycznej ultrawirówki (nieopisanej w niniejszym protokole). Gdy próbki do Western Blottingu są przygotowywane w warunkach niedenaturujących/nieredukujących, prawidłowo przygotowany preparat powinien wygenerować sygnaturę Western Blotting z p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aβ 1-42 (liofilizowany)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)	Fluka	52517
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
Polipropylenowe probówki wirówkowe 50mL	Corning	05-538-67
Mikroprobówki MaxyClear 1.5ml o maksymalnym odzysku	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
Fosforanowy bufor solny pH 7.4	Invitrogen	10010-023
Strzykawki GASTIGHT 250 μL	Hamilton Co	1725
Myjka ultradźwiękowa	Branson	3510
System koncentracyjny Savant SpeedVac	Różne	SC 110A