Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na rybkach danio pręgowanych.

Podsumowanie

Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.

Streszczenie

Prezentujemy zastosowanie metodologii wysokoprzepustowego przesiewu obrazowego (HCS) w celu zidentyfikowania małych cząsteczek zdolnych do modulacji szlaku FGF/RAS/MAPK w embrionach danio pręgowanego. Embrion danio pręgowanego stanowi idealny system do wysokoprzepustowych badań chemicznych in vivo. Jednodniowy embrion ma średnicę około 1mm i może być łatwo rozmieszczony w płytkach 96-dołkowych, które są standardowym formatem w badaniach wysokoprzepustowych. W ciągu pierwszej doby rozwoju embriony są przezroczyste, a większość głównych narządów jest już obecna, co umożliwia wizualizację formowania się tkanek podczas embriogenezy. Pełna automatyzacja chemicznych badań przesiewowych na danio pręgowanym wciąż stanowi jednak wyzwanie, szczególnie w zakresie opracowania zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Wcześniej stworzyliśmy transgeniczną linię reporterową, która wykazuje ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą aktywności FGF, i wykazaliśmy jej przydatność w badaniach chemicznych.¹Aby opracować metodologię wysokoprzepustowych przesiewów całych organizmów, stworzyliśmy system zautomatyzowanego obrazowania i analizy embrionów zebrafish w 24–48 godzinach po zapłodnieniu (hpf) w płytkach 96-dołkowych.²W tym filmie przedstawiamy procedury rozmieszczania embrionów transgenicznych w płytkach wielodołkowych w 24hpf oraz dodawanie cząsteczki o małej masie cząsteczkowej (BCI), która hiperaktywuje sygnalizację FGF³Płytki inkubuje się przez 6 godzin, po czym dodaje się trikainę w celu znieczulenia larw przed automatycznym obrazowaniem przy użyciu skaningowego konfokalnego czytnika HCS Molecular Devices ImageXpress Ultra. Obrazy są przetwarzane przez oprogramowanie Definiens Developer z wykorzystaniem algorytmu Cognition Network Technology, który opracowaliśmy w celu wykrywania i ilościowego określania ekspresji GFP w głowach embrionów transgenicznych. W tym przykładzie podkreślamy zdolność algorytmu do pomiaru efektów zależnych od dawki BCI w ekspresji genu reporterowego GFP w traktowanych embrionach.

Protokół

1) Przygotowanie krzyżówek ryb zebrafish oraz traktowanie BCI.

1. Na dwa dni przed rozpoczęciem zabiegu należy wyselekcjonować homozygotyczne samce danio pręgowanego Tg(dusp6:d2eGFP)^pt6 i umieścić je indywidualnie w zbiornikach do rozrodu¹. Następnie należy dodać przegrodę oraz samicę typu dzikiego AB* i pozostawić je w klatkach do rozrodu na noc.
2. Następnego dnia rano należy usunąć przegrodę i zebrać embriony po upływie 1 godziny. Embriony należy przenieść do szalek 100 mm z roztworem E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) i inkubować w temperaturze 28°C przez 6 godzin. Następnie należy usunąć martwe i niezapłodnione embriony, dodać świeży roztwór E3 i inkubować przez noc.
3. Należy wyselekcjonować embriony transgeniczne o podobnym stadium rozwoju (24hpf) i jednolitej ekspresji GFP. Następnie należy umieścić embriony pojedynczo w każdym dołku płytki 96-dołkowej.
4. Nadmiar roztworu E3 należy usunąć za pomocą mikropipety. Do każdego dołka należy dodać 200μl roztworu E3 przy użyciu pipety wielokanałowej.
5. Należy dodać następujące związki zgodnie z listą:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   A

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl BCl (0.1mM)

   2μl BCl (0.5mM)

   2μl BCl (1mM)

   2μl BCl (2mM)

   2μl BCl (2.5mM)

   2μl DMSO

   Stężenia końcowe wynoszą 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI w 1% DMSO. Płytkę należy przykryć folią aluminiową i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 28°C.

2) Zautomatyzowane obrazowanie płytek 96-dołkowych i analiza.

1. Do każdej studzienki dodaj 10μl trikainy (0.61mM), aby znieczulić zarodki w 30hpf.
2. Włóż płytkę do urządzenia Molecular Devices Imagexpress Ultra.
3. Otwórz oprogramowanie Metaxpress. Wybierz konfigurację z obiektywem 4x i maksymalną średnicą otworu przesłony (pinhole), skonfiguruj laserowy autofokus do wykrywania dna płytki i określ optymalną płaszczyznę Z w celu wykrycia obszarów zainteresowania. Pozyskaj obrazy przy długościach fal wzbudzenia / emisji 488/525 nm (GFP). Ustaw obszar skanowania jako pojedynczy punkt o rozmiarze 2000x2000 pikseli (4 x 4 mm) bez binningu. Skonfiguruj moc lasera i wzmocnienie (gain) w taki sposób, aby najjaśniejsze obszary na obrazach kontroli pozytywnej nie uległy nasyceniu. Potwierdź prawidłowe pozyskiwanie obrazów w kilku studzienkach kontroli pozytywnej i negatywnej.
4. Rozpocznij skanowanie płytki. Instrument automatycznie pozyska obrazy ze wszystkich studzienek i zarchiwizuje je w bazie danych serwera SQL.
5. Prześlij obrazy do programu Definiens Developer, korzystając z modułu aplikacji Cellenger oraz filtra importu rozpoznającego format obrazów i strukturę plików generowaną przez platformę Molecular Devices Imagexpress Ultra.
6. Przetwórz obrazy za pomocą specjalnie zaprojektowanego algorytmu Cognition Network Technology (nazywanego również zestawem reguł – ruleset). Algorytm, który opracowaliśmy na podstawie niedawno opublikowanego zestawu reguł ², służy do automatycznej identyfikacji zarodka, żółtka i głowy oraz do ilościowego określenia jasności i powierzchni struktur głowy wykazujących ekspresję GFP. Studzienki, w których nie wykryto zarodka lub w których nie można jednoznacznie przypisać głowy (na przykład przy wysokiej toksyczności związku lub w przypadku obrazów nieostrych), są wykluczane z analizy. Skonfiguruj algorytm, używając kilku obrazów kontroli negatywnej (traktowanych nośnikiem) i obrazów kontroli pozytywnej (traktowanych BCI), tak aby głowa i żółtko były prawidłowo zidentyfikowane w obu przypadkach. Ustaw próg detekcji „struktur głowy” jako wielokrotność średniej intensywności żółtka, aż do momentu, gdy detekcja jasnych struktur głowy będzie zgodna z obserwacją wizualną. Zdefiniuj parametry do eksportu. W tym przykładzie najbardziej informacyjnym parametrem była całkowita zintegrowana jasność obszarów GFP-dodatnich w obrębie głowy, określana w dalszej części jako „całkowita jasność struktur głowy” (Rysunek 1).
   
   
   Rysunek 1
   Wykres przedstawiający zależne od dawki efekty BCI na ekspresję GFP w zarodkach transgenicznych.
7. Uruchom algorytm dla wszystkich obrazów z płytki, korzystając z zintegrowanego harmonogramu zadań. Oprogramowanie Definiens wykorzystuje obliczenia rozproszone na kilku procesorach („silnikach”), co umożliwia jednoczesną analizę wielu obrazów. Algorytm oblicza miary numeryczne na podstawie wyników analizy obrazu, które są zapisywane w bazie danych wraz z kopią przetworzonego obrazu z naniesioną analizą.

Reprezentatywne wyniki:

Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów dane można zwizualizować w programie Cellenger lub wyeksportować do zewnętrznego oprogramowania (Excel, GraphPad Prism) w celu dalszej analizy i reprezentacji graficznej. Rysunek 2 przedstawia zarchiwizowane obrazy skanów z dołka kontrolnego (nośnik) oraz dołka traktowanego BCI, z zastosowaną i bez zastosowanej analizą CNT. Rysunek 1 dokumentuje zależny od dawki efekt BCI na ekspresję genu reporterowego GFP w embrionach Tg(dusp6:d2EGFP)^pt6. Stężenie wymagane do wywołania połowy maksymalnej odpowiedzi (EC50) wynosiło około 12 μM.


Rysunek 2
Zautomatyzowane przechwytywanie i analiza obrazów transgenicznych embrionów zebrafish. (A) Embrion Tg(dusp6:d2eGFP)^pt6 w 30hpf traktowany nośnikiem DMSO. (B) Embriony transgeniczne traktowane 20μM BCI wykazują zwiększoną ekspresję GFP. (C) Obraz embrionu z (A) po uruchomieniu zestawu reguł Definiens w celu znalezienia ekspresji GFP w głowie. Pomarańczowe plamki wskazują miejsca, w których oprogramowanie mierzy intensywność GFP. (D) Obraz embrionu z (B) po uruchomieniu zestawu reguł Definiens w celu znalezienia ekspresji GFP w głowie. Pomarańczowe plamki wskazują miejsca, w których oprogramowanie mierzy intensywność GFP. Należy zauważyć, że zestaw reguł był w stanie wykryć rozszerzony obszar ekspresji GFP w traktowanym embrionie.

Dyskusja

Głównym czynnikiem ograniczającym wydajność chemicznych badań przesiewowych na danio pręgowanym jest brak metodologii pozwalającej na systematyczne przetwarzanie płytek 96-dołkowych w celu obrazowania i analizy. Ponieważ obrazy organizmów wielokomórkowych są złożone, charakteryzują się niskim kontrastem i są z natury heterogeniczne, istniejące algorytmy analizy obrazu nie radzą sobie z wykrywaniem i kwantyfikowaniem konkretnych struktur wewnątrz organizmu. W związku z tym większość opublikowanych badań przesiewowych na danio pręgowanym opiera się na wizualnej ocenie poszczególnych dołków przez wykwalifikowany personel w trakcie całej procedury. Zazwyczaj uniemożliwia to generowanie numerycznych wyników oraz pełną archiwizację obrazów i danych z przesiewu. Co więcej, ocena manualna eliminuje kilka kluczowych zalet przesiewania opartego na obrazowaniu, a mianowicie możliwość przeprowadzania retrospektywnych analiz efektywności przesiewu, badanie zmian fenotypowych, które nie były głównym celem kampanii przesiewowej (np. toksyczność lub wady rozwojowe), oraz korelację danych z przesiewu z poprzednimi lub przyszłymi badaniami z wykorzystaniem tej samej biblioteki związków.

W niniejszym raporcie przedstawiamy metodologię zautomatyzowanego obrazowania i analizy zarodków danio pręgowanego w płytkach wielodołkowych bez ingerencji użytkownika. Zautomatyzowaliśmy proces akwizycji obrazów za pomocą konfokalnego skanera laserowego ImageXpress Ultra (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), aby obrazować zarodki Tg(dusp6:d2EGFP)^pt6 w płytkach 96-dołkowych, oraz opracowaliśmy algorytm analizy obrazu oparty na technologii Cognition Network firmy Definiens, który ilościowo określił ekspresję GFP w głowach zarodków transgenicznych. Metoda ta dostarczyła odpowiedzi stopniowane i pozwoliła na ilościowe określenie aktywności in vivo małocząsteczkowego aktywatora sygnalizacji FGF. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu systemu ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) opartego na epifluorescencji, co dowodzi, że możliwe jest wdrożenie zautomatyzowanej akwizycji obrazów zarodków danio pręgowanego na różnych komercyjnie dostępnych czytnikach płytek ². Opracowanie metodologii automatycznej analizy obrazów organizmów wielokomórkowych wyeliminowało potrzebę wizualnej oceny przez obserwatora i umożliwiło generowanie oraz archiwizowanie danych liczbowych i obrazów do późniejszej analizy retrospektywnej oraz porównań z przyszłymi badaniami przesiewowymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tricaina (MS222)	Sigma-Aldrich	Kat. nr A-5040