Artykuł metodologiczny

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy badań przesiewowych chemicznych ryb pręgowanych.

DOI:

10.3791/1900

⸱

24 czerwca 2010

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh Drug Discovery Institute, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of Pittsburgh, 4Department of Chemistry, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informujemy o rozwoju systemu do automatycznego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów danio pręgowanego na płytkach wielodołkowych. Pokazuje to zdolność do pomiaru zależnego od dawki wpływu małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego czynnika wzrostu fibroblastów i zapewnia technologię do tworzenia wysokoprzepustowych badań chemicznych danio pręgowanego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Demonstrujemy zastosowanie metodologii badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) opartej na obrazach w celu identyfikacji małych cząsteczek, które mogą modulować szlak FGF / RAS / MAPK w zarodkach danio pręgowanego. Zarodek danio pręgowanego jest idealnym systemem do badań przesiewowych in vivo o wysokiej zawartości substancji chemicznych. 1-dniowy zarodek ma około 1 mm średnicy i można go łatwo ułożyć w 96-dołkowe płytki, co jest standardowym formatem do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. W pierwszym dniu rozwoju zarodki są przezroczyste, a większość głównych narządów jest obecna, co umożliwia wizualizację tworzenia się tkanek podczas embriogenezy. Pełna automatyzacja badań przesiewowych chemicznych danio pręgowanego nadal stanowi jednak wyzwanie, szczególnie w zakresie rozwoju zautomatyzowanej akwizycji i analizy obrazów. Wcześniej wygenerowaliśmy transgeniczną linię reporterową, która wyraża białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą aktywności FGF i wykazaliśmy ich przydatność w chemicznych badaniach przesiewowych 1. Aby ustalić metodologię wysokoprzepustowych badań przesiewowych całego organizmu, opracowaliśmy system do automatycznego obrazowania i analizy zarodków danio pręgowanego w ciągu 24-48 godzin po zapłodnieniu (hpf) na 96-dołkowych płytkach 2. W tym filmie przedstawiamy procedury układania transgenicznych zarodków w wielodołkowych płytkach w temperaturze 24hpf i dodawania małej cząsteczki (BCI), która hiperaktywuje sygnalizację FGF 3. Płytki inkubuje się przez 6 godzin, a następnie dodaje się trikainę w celu znieczulenia larw przed automatycznym obrazowaniem za pomocą konfokalnego czytnika HCS ImageXpress Ultra do skanowania laserowego. Obrazy są przetwarzane przez oprogramowanie Definiens Developer przy użyciu algorytmu technologii Cognition Network Technology, który opracowaliśmy w celu wykrywania i ilościowego określania ekspresji GFP w głowach transgenicznych embrionów. W tym przykładzie podkreślamy zdolność algorytmu do pomiaru zależnego od dawki wpływu BCI na ekspresję genu reporterowego GFP w leczonych zarodkach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1) Ustaw kojarzenie danio pręgowanego i leczenie BCI.

  1. Dwa dni przed podaniem zabiegu zidentyfikuj homozygotycznego samca danio pręgowanego Tg(dusp6:d2eGFP)pt6 i umieść go pojedynczo w zbiornikach godowych1. Dodaj separator i samicę dzikiej rasy AB* i pozostaw na noc w klatkach godowych.
  2. Następnego ranka wyjmij separator i zbierz zarodki po 1 godzinie. Przenieść zarodki do 100 mm szalek z E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), roztworem i inkubować w temperaturze 28°C przez 6 godzin. Usuń martwe i niezapłodnione zarodki, dodaj świeży roztwór E3 i inkubuj przez noc.
  3. Sortuj zarodki transgeniczne pod kątem podobnego stadium (24hpf) i jednolitej ekspresji GFP. Ułóż zarodki pojedynczo w każdym dołku na 96-dołkowej płytce.
  4. Usunąć nadmiar roztworu E3 za pomocą mikropipety. Dodaj 200 μl roztworu E3 za pomocą pipety wielokanałowej do każdej studzienki.
  5. Dodaj następujące związki zgodnie z listą:

      1 cyfra arabska 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ZA 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5 mM) 2μl
    DMSO W 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    DMSO Z 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    DMSO D 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    DMSO E 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    DMSO Z 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    DMSO Z 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    DMSO H 2μl
    DMSO 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    BCl
    (0,1 mM) 2μl
    BCl
    (0,5 mM) 2μl
    BCl
    (1mM) 2μl
    BCl
    (2mM) 2μl
    BCl
    (2,5mM) 2μl
    DMSO Stężenia końcowe wynoszą 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI w 1% DMSO. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez 6 godzin w temperaturze 28°C.

2) Automatyczne obrazowanie 96-dołkowych płytek i analiza.

  1. Dodaj 10 μl trikainy (0,61 mM) do każdego dołka, aby znieczulić zarodki 30hpf.
  2. Załaduj płytkę do urządzeń molekularnych Imagexpress Ultra.
  3. Otwórz oprogramowanie Metaxpress. Wybierz konfigurację z obiektywem 4x i maksymalną średnicą otworka, skonfiguruj laserowy autofokus do wykrywania dna płytki i określ optymalną płaszczyznę Z do wykrywania obszarów zainteresowania. Rejestruj obrazy na długościach fal wzbudzenia / emisji 488/525 nm (GFP). Ustaw obszar skanowania jako pojedynczą witrynę o wymiarach 2000 x 2000 pikseli (4 x 4 mm) bez łączenia na grupy. Skonfiguruj moc i wzmocnienie lasera w taki sposób, aby najjaśniejsze obszary na obrazach kontroli dodatniej nie ulegały nasyceniu. Potwierdź prawidłową akwizycję obrazu w kilku studzienkach kontroli dodatniej i ujemnej.
  4. Rozpocznij skanowanie tablicy rejestracyjnej. Przyrząd automatycznie pobierze obrazy ze wszystkich studni i zarchiwizuje je w bazie danych serwera SQL.
  5. Prześlij obrazy do Definiens Developer za pomocą modułu aplikacji Cellenger i filtra importu, który rozpoznaje format obrazu i strukturę pliku wygenerowane przez platformę Molecular Devices Imagexpress Ultra.
  6. Przetwarzaj obrazy za pomocą specjalnie zaprojektowanego algorytmu technologii sieci poznawczych (nazywanego również zestawem reguł). Algorytm, który opracowaliśmy na podstawie niedawno opublikowanego zestawu reguł 2, został zaprojektowany do automatycznej identyfikacji zarodka, żółtka i główki oraz do ilościowego określania jasności i obszaru struktur głowy wykazujących ekspresję GFP. Studzienki, w których nie wykryto zarodka lub w których nie można jednoznacznie przypisać głowy (na przykład o wysokiej toksyczności związków lub nieostrych obrazach), są wyłączone z analizy. Skonfiguruj algorytm przy użyciu kilku obrazów kontroli ujemnej (podłoże poddane działaniu nośnika) i obrazów kontroli dodatniej (poddane działaniu BCI) w taki sposób, aby głowa i żółtko były prawidłowo zidentyfikowane w obu. Ustaw próg wykrywania "struktur głowy" jako wielokrotność średniej intensywności żółtka, aż wykrycie jasnych struktur głowy będzie zgodne z obserwacją wzrokową. Zdefiniuj parametry do eksportu. W tym przykładzie najbardziej pouczającym parametrem była całkowita całkowita zintegrowana jasność obszarów GFP-dodatnich w głowie, zwana dalej "całkowitą jasnością struktur głowy" (ryc. 1).

    figure-protocol-1
    Rysunek 1
    Wykres przedstawiający zależny od dawki wpływ BCI na ekspresję GFP w zarodkach transgenicznych.
  7. Uruchom algorytm na wszystkich obrazach płyt za pomocą zintegrowanego harmonogramu zadań. Oprogramowanie Definiens wykorzystuje rozproszone przetwarzanie na kilku procesorach ("silnikach"), umożliwiając jednoczesną analizę wielu obrazów. Algorytm oblicza miary numeryczne na podstawie wyników analizy obrazu, które są zapisywane w bazie danych wraz z kopią przetworzonego obrazu, z zastosowaną analizą.

Reprezentatywne wyniki:

Po przeanalizowaniu wszystkich obrazów, dane mogą być wizualizowane w Cellenger lub eksportowane do oprogramowania innych firm (Excel, GraphPad Prism) w celu dalszej analizy i graficznej reprezentacji. Rysunek 2 przedstawia zarchiwizowane obrazy skanów z pojazdu poddanego działaniu środka i dobrze poddanego działaniu BCI, z zastosowaną analizą CNT i bez niej. Rycina 1 dokumentuje zależny od dawki wpływ BCI na ekspresję genu reporterowego GFP w zarodkach Tg(dusp6:d2EGFP)pt6. Stężenie wymagane do wywołania połowy maksymalnej odpowiedzi (EC50) wynosiło około 12 μM.

figure-protocol-2
Rysunek 2
Zautomatyzowane przechwytywanie i analiza obrazu transgenicznych zarodków danio pręgowanego. (A) Zarodek Tg(dusp6:d2eGFP)pt6 traktowany nośnikiem DMSO w temperaturze 30hpf. (B) Transgeniczne zarodki poddane działaniu 20 μM BCI wykazują wzrost ekspresji GFP. (C) Obraz zarodka z (A) po uruchomieniu zestawu reguł Definiens w celu znalezienia ekspresji GFP w głowie. Pomarańczowe plamki oznaczają miejsca, w których oprogramowanie mierzy intensywność GFP. (D) Obraz zarodka z (B) po uruchomieniu zestawu reguł Definiens w celu znalezienia ekspresji GFP w głowie. Pomarańczowe plamki oznaczają miejsca, w których oprogramowanie mierzy intensywność GFP. Należy zauważyć, że zestaw reguł był w stanie znaleźć rozszerzony obszar ekspresji GFP w leczonym zarodku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym czynnikiem ograniczającym przepustowość badań przesiewowych chemicznych danio pręgowanego jest brak metodologii systematycznego przetwarzania 96-dołkowych płytek do obrazowania i analizy. Ponieważ obrazy organizmów wielokomórkowych są złożone, o niskim kontraście i niejednorodne, istniejące algorytmy analizy obrazu nie są w stanie wykryć i określić ilościowo określonych struktur w organizmie. Większość opublikowanych badań przesiewowych chemicznych danio pręgowanego obejmuje zatem oględziny poszczególnych studzienek przez dedykowany personel podczas całej procedury. Zazwyczaj uniemożliwia to generowanie odczytów numerycznych oraz pełną archiwizację obrazów i danych z ekranu. Co więcej, ręczna ocena eliminuje kilka kluczowych zalet badań przesiewowych opartych na obrazie, a mianowicie możliwość przeprowadzania retrospektywnych analiz wydajności ekranu, badania zmian fenotypowych, które nie były głównym celem kampanii przesiewowej (np. toksyczność lub wady rozwojowe) oraz porównywania danych przesiewowych z przeszłymi lub przyszłymi badaniami przesiewowymi przy użyciu tej samej biblioteki związków.

W niniejszym raporcie zwracamy uwagę na metodologię automatycznego obrazowania i analizy zarodków danio pręgowanego na płytkach wielodołkowych bez interwencji użytkownika. Zautomatyzowaliśmy przechwytywanie obrazu za pomocą laserowego skaningowego czytnika konfokalnego ImageXpress Ultra (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) w celu zobrazowania zarodków Tg(dusp6:d2EGFP)pt6 na 96-dołkowych płytkach i opracowaliśmy algorytm analizy obrazu oparty na technologii Cognition Network firmy Definiens, który określił ilościowo ekspresję GFP w głowach transgenicznych zarodków. Metoda dostarczyła stopniowanych odpowiedzi i określiła ilościowo aktywność in vivo małocząsteczkowego aktywatora sygnalizacji FGF. Podobne wyniki uzyskano za pomocą opartego na epifluorescencji skanera ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA), dokumentując, że możliwe jest wdrożenie automatycznego przechwytywania obrazu zarodków danio pręgowanego na różnych dostępnych na rynku czytnikach płytek 2. Opracowanie metodologii automatycznej analizy obrazów organizmów wielokomórkowych wyeliminowało potrzebę wizualnej oceny punktowej przez ludzkiego obserwatora oraz umożliwiło generowanie i archiwizację danych numerycznych i obrazów do analizy retrospektywnej i porównań z przyszłymi ekranami.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest finansowana przez NICHD/NIH (1R01HD053287) dla Hukriede, NCI/NIH (P01 CA78039) dla Vogta i NHLBI/NIH (1R01HL088016) dla Tsang.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tricaine (MS222)Sigma-AldrichKat.# A-5040

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).
  2. Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).
  3. Molina, G. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zarodki danio pr gowanegowysokoprzepustowe badania obrazowesygnalizacja FGFreporter GFPtechnologia Cognition NetworkImageXpress Ultrap ytki 96 do kowetraktowanie BCI

Powiązane artykuły