Jednoczesne badanie fMRI i elektrofizjologii w mózgu gryzoni

Podsumowanie

Opracowaliśmy metodę jednoczesnego wykonywania funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym oraz rejestracji elektrofizjologicznej w mózgu gryzoni, co stanowi platformę do badania zależności między aktywnością neuronalną a sygnałem fMRI zależnym od poziomu utlenowania krwi (BOLD).

Streszczenie

Aby zbadać neuronalne podstawy sygnału obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) zależnego od poziomu utlenowania krwi (BOLD), opracowaliśmy model gryzoni, w którym dane funkcjonalnego MRI iin vivomożna jednocześnie przeprowadzić rejestrację wewnątrzkorową. Połączenie MRI i rejestracji elektrycznej jest technicznie trudne, ponieważ elektrody używane do rejestracji zniekształcają obrazy MRI, a akwizycja MRI indukuje szum w rejestracji elektrycznej. Aby zminimalizować wzajemne zakłócenia obu modalności, zamiast metalowych zastosowano szklane mikroelektrody oraz zaimplementowano algorytm usuwania szumów dla danych elektrofizjologicznych. W naszych badaniach dwie mikroelektrody zostały oddzielnie implantowane w obustronnych pierwotnych korach somatosensorycznych (SI) szczura i unieruchomione. Do funkcjonalnego MRI wybrano jeden przekrój wieńcowy obejmujący końcówki elektrod. Trzony elektrod oraz miejsca ich mocowania nie zostały uwzględnione w przekroju obrazu, aby uniknąć artefaktów obrazowania. Usunięty skalp zastąpiono pastą do zębów w celu zmniejszenia niedopasowania podatności magnetycznej i zapobiegania artefaktom Gibbsa w obrazach. Strukturę artefaktu indukowaną w rejestracjach elektrycznych przez szybko przełączane pola magnetyczne podczas akwizycji obrazu określono poprzez uśrednienie wszystkich cykli skanowania dla każdego przebiegu. Strukturę szumu podczas obrazowania odjęto następnie od oryginalnych rejestracji. Odszumione przebiegi czasowe wykorzystano później do dalszych analiz w połączeniu z danymi fMRI. Przykładowo, jednoczesna akwizycja została wykorzystana do określenia zależności między spontanicznymi sygnałami fMRI BOLD a ograniczoną pasmem aktywnością elektryczną wewnątrzkorową. Jednoczesna rejestracja fMRI i elektrofizjologiczna u gryzoni zapewni platformę dla wielu ekscytujących zastosowań w neuronauce, poza wyjaśnianiem zależności między sygnałem fMRI BOLD a aktywnością neuronalną.

Protokół

1. Jest to operacja nietrwała (non-survival). Pierwszym krokiem jest implantacja elektrod. W tym przykładzie elektrody zostaną zaimplantowane w obszarach przedniej łapy pierwotnej kory somatosensorycznej w obu półkulach.

1. Zanurz szczura (samiec szczura SD, 200-300 g) w anestezji z użyciem 2% izofluranu i unieruchom w systemie chirurgii stereotaktycznej. Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że zwierzę jest dobrze znieczulone i nie wykazuje reakcji na uciśnięcie palca u nogi. Usuń futro przed otwarciem skóry głowy. Oddziel mięśnie i inne tkanki nad czaszką i zahamuj wszelkie krwawienia na powierzchni kości za pomocą kauteryzatora.
2. Przygotuj na powierzchni czaszki (w pobliżu linii środkowej w przednim złączeniu w kształcie litery V) wspornik z cementu dentystycznego, który posłuży jako punkt mocowania trzpienia wszczepionej elektrody. Osadzenie małej nylonowej śruby w kości przed nałożeniem cementu dentystycznego może zwiększyć stabilność. Wspornik uformowany z cementu powinien mieć wysokość około 5 mm i powierzchnię podstawy 3 x 5 mm² (patrz Rysunek 1).
3. Używając wiertarki elektrycznej z cienkim wiertłem, ostrożnie otwórz czaszkę i odsłoń oponę twardą nad reprezentacją przedniej łapy w pierwotnej korze somatosensorycznej każdej półkuli. Średnica każdego otworu powinna wynosić około 1 mm, z lokalizacją 1 mm przed i 4 mm bocznie od bregmy. Pod mikroskopem wykonaj niewielki otwór w oponie twardej za pomocą końcówki igły strzykawki, uważając, aby nie uszkodzić naczyń.
4. Przed wprowadzeniem każdej elektrody upewnij się, że w pobliżu nacięć nie występuje krwawienie ani wysięk. Szklane mikroelektrody powinny zostać przygotowane przed operacją z długością trzpienia około 3~4 cm i impedancją 1~5 Mω. Wypełnij kapilarę elektrody sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF) i wprowadź każdą elektrodę ukośnie (~45°, od tyłu do przodu) do mózgu w odległości ~0.4 mm od otwartej opony twardej, korzystając z ramienia stereotaktycznego. Przed unieruchomieniem sprawdź sygnał elektryczny. Jeden koniec chlorkowanego drutu srebrnego należy zanurzyć w ACSF, a drugi podłączyć do przewodów wejściowych wzmacniacza. Drut srebrny, przymocowany podskórnie z tyłu otwartej skóry, służy jako elektroda referencyjna.
5. Przed utrwaleniem elektrod ponownie sprawdź obszar operacyjny, aby upewnić się, że nie występuje krwawienie ani wysięk, a następnie nałóż pastę do zębów w miejsce usuniętej skóry i mięśni na czaszce. Zastosowanie pasty do zębów poprawia jakość obrazu MR poprzez zmniejszenie niedopasowania podatności na granicy czaszka/powietrze. Przymocuj trzpień elektrody do przygotowanego wspornika za pomocą cementu dentystycznego (patrz Rysunek 1).
6. Po utwardzeniu cementu dentystycznego przenieś zwierzę do uchwytu MRI i unieruchom. Monitoruj stan fizjologiczny szczura przez resztę badania, w tym temperaturę ciała, częstość oddechów, SPO₂ oraz częstość akcji serca.
7. Umieść cewkę powierzchniową (nadawczo-odbiorczą) nad głową, tak aby elektrody wystawały ze środka cewki. Dodatkowa łukowata twarda osłona znajdująca się nad uchwytem służy jako podpora do mocowania przewodów elektrod, aby uniknąć ruchów spowodowanych oddychaniem zwierzęcia. Przewody używane do jednoczesnego obrazowania i rejestracji mają długość do ~5 m (wzmacniacz znajduje się tuż poza pomieszczeniem z magnesem) i są pokryte przewodzącym plastikiem, który służy jako ekran pasywny.
8. Jeśli jest to pożądane, można zmienić znieczulenie z izofluranu na medetomidynę, aby zmniejszyć tłumienie aktywności neuronalnej. Przed przeniesieniem zwierzęcia do magnesu sprawdź sygnał elektryczny po raz ostatni. W naszych badaniach parametry rejestracji były następujące: wzmocnienie x 1000, filtr pasmowo-przepustowy 0.1 Hz~5 kHz, filtr notch 60 Hz, częstotliwość próbkowania 12 kHz dla konwersji analogowo-cyfrowej.

2. Na tym etapie zwierzę zostaje umieszczone w skanerze MRI w celu jednoczesnego obrazowania i rejestracji. Zwierzęta pozostają pod narkozą przez cały czas trwania procedury obrazowania.

1. W naszych badaniach wykorzystano system MRI dla małych zwierząt o indukcji 9.4 T (Bruker, Niemcy). Przed rozpoczęciem rejestracji należy ustalić parametry obrazowania. Do pozycjonowania skanów fMRI wykorzystuje się obraz zwiadowczy w trzech płaszczyznach. Aby poprawić jednorodność pola magnetycznego, obszar zainteresowania jest korygowany (shimmed) za pomocą FASTMAP¹. Do badań fMRI wybrano czołowy przekrój obrazowania, który obejmował obustronne pierwotne obszary somatosensoryczne przedniej łapy, w których implantowano elektrody. Parametry obrazowania EPI wynosiły: FOV, 1.92 x 1.92 cm²; rozmiar macierzy, 64 x 64; rozdzielczość w płaszczyźnie, 0.3 x 0.3 mm²; grubość warstwy, 2 mm; TR/TE, 500/15 ms.
2. Po zakończeniu konfiguracji obrazowania można rozpocząć jednoczesną rejestrację i fMRI. Rycina 2 przedstawia reprezentatywny obraz EPI oraz surowe zapisy podczas obrazowania. Szybka zmiana gradientów podczas akwizycji obrazu prowadzi do nasycenia zapisów, które utrzymuje się jedynie przez niewielką część każdego cyklu skanowania (22/500 ms). Po akwizycji obrazu sygnał elektryczny powraca do linii bazowej w formie nienasyconej oscylacji (patrz Rycina 3). Połączone fMRI i rejestrację można przeprowadzać w stanie spoczynku (jak pokazano w niniejszym badaniu) lub podczas stymulacji. W badaniach nad bodźcami parametry obrazowania są takie same jak w badaniu stanu spoczynku, przy czym stymulacja elektryczna przedniej łapy jest realizowana za pomocą prądu o częstotliwości 9 Hz i natężeniu 1~4 mA. Szczur zostaje poddany eutanazji po ostatnim skanie.

3. Po jednoczesnym obrazowaniu i rejestracji dane muszą zostać poddane wstępnemu przetwarzaniu przed końcową analizą.

1. Zaczynamy od usunięcia artefaktów gradientowych z zapisów elektrofizjologicznych (patrz Rysunek 3).
   1. Strukturę szumu wynikającą ze skanowania można wyekstrahować poprzez uśrednienie wszystkich sekcji o długości ~500 ms (TR), z których każda odpowiada odstępowi między dwoma kolejnymi obrazami fMRI.
   2. Od oryginalnych zapisów należy odjąć uśrednioną strukturę szumu. Metoda ta koryguje wyłącznie nienasycone segmenty zapisu.
   3. Każdy nasycony segment odpowiadający zmianie gradientu podczas akwizycji obrazu zostaje zastąpiony linią łączącą punkt czasowy przed nasyceniem indukowanym gradientem z punktem czasowym po nim.
2. Odszumione zapisy potencjałów lokalnych (LFP) są następnie przekształcane w przebiegi czasowe mocy, które będą miały tę samą rozdzielczość czasową co przebieg czasowy fMRI. Do obliczenia najniższych częstotliwości (pasmo delta, 1~4 Hz) wykorzystuje się średnią moc w binie 2-sekundowym, dla częstotliwości pasma theta (4~8 Hz) bin 1-sekundowy, a dla częstotliwości wyższych (> 8 Hz, pasma od alfa do gamma) bin o długości ~0,5 s między sąsiednimi sygnałami nasyconymi. Przesuwne okno dla wszystkich pasm częstotliwości było przemieszczane w interwałach 0,5 s, zgodnie z TR danych fMRI.
3. W przypadku danych obrazowych wykonuje się standardowe przetwarzanie wstępne fMRI, obejmujące korekcję ruchów głowy, wygładzanie obrazu z FWHM 0,5 mm oraz usuwanie dryftu liniowego.
4. Przeprowadza się analizę korelacji krzyżowej między przebiegami czasowymi mocy LFP a przebiegiem czasowym z każdego woksela danych obrazowych. Zmienne opóźnienia czasowe umożliwiają badanie korelacji zależnej od czasu (patrz Rysunek 4).

Reprezentatywne wyniki:

Przykładowo, technikę tę można wykorzystać do zbadania związku między spontaniczną aktywnością neuronalną a fluktuacjami BOLD. Rycina 4 przedstawia mapy korelacji między mocą LFP a sygnałem BOLD przy opóźnieniach czasowych od -2,5 do 9,5 s u jednego szczura. Niskoczęstotliwościowe fluktuacje BOLD (< 0,1 Hz) z obszarów kory w pobliżu końcówki elektrody korelują ze zmianami mocy LFP (< 0,1 Hz) z opóźnieniem 2~6 s.

Rysunek 1. Schematyczna konfiguracja implantacji elektrody i obszaru obrazowania z wykorzystaniem cewki powierzchniowej.

Rycina 2. Na lewym panelu przedstawiono reprezentatywny obraz EPI w płaszczyźnie czołowej, obejmujący końcówki elektrod. Prawy panel przedstawia surowe zapisy elektrofizjologiczne przed i w trakcie obrazowania.

Rycina 3. Po powiększeniu jednego cyklu skanowania widać, że artefakt (zielony) podczas obrazowania może zostać usunięty z oryginalnych zapisów (niebieski). Odszumione przebiegi czasowe (czerwony) zostały wykorzystane do dalszej analizy.

Rycina 4. Mapy koronalne (pochodzące od jednego typowego szczura) korelacji między mocą spontanicznej aktywności w pasmie delta z jednej elektrody a sygnałem BOLD w stanie spoczynku przy opóźnieniach czasowych od -2,5 do 9,5 s. Maksymalna korelacja jest obserwowana obustronnie w SI przy około 4~5 s u szczura pod narkozą izofluranową. Pasek kolorów przedstawia współczynnik korelacji Pearsona r.

Dyskusja

Zarówno rejestracja elektrofizjologiczna, jak i funkcjonalny rezonans magnetyczny (fMRI) w trybie BOLD są osobno dobrze rozwiniętymi technikami. Jednakże jednoczesna rejestracja i obrazowanie stanowią wyzwanie ze względu na wzajemne zakłócenia² obu modalności. Przedstawiamy tutaj możliwe rozwiązanie dla eksperymentów łączonych u gryzoni. Zmodyfikowana metoda implantacji elektrod minimalizuje wpływ na jakość obrazu, natomiast usuwanie artefaktów z zapisów elektrycznych jest niezbędne w celu wyeliminowania szumó...