Artykuł metodologiczny

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/1902

⸱

24 grudnia 2010

 ,  , 
1Molecular Cell Biology, Weizmann Institute of Science

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoaktywacja związków docelowych w żywym organizmie okazała się wartościowym podejściem do badania różnych procesów biologicznych, takich jak rozwój embrionalny, sygnalizacja komórkowa i fizjologia dorosłych osobników. W tym kontekście zastosowanie mikroskopii wielofotonowej umożliwia ilościową fotoaktywację danego czynnika światłoczułego w głębokich tkankach z rozdzielczością pojedynczej komórki. Ponieważ embriony rybek danio-pręgławka są optycznie przezroczyste, ich rozwój można monitorować in vivo. Cechy te sprawiają, że rybka danio-pręgławka jest idealnym organizmem modelowym do kontrolowania aktywności różnych czynników chemicznych i białek za pomocą skupionego światła. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do indukowania aktywacji chemicznie „zaklatkowanej” (caged) fluoresceiny, co z kolei pozwala nam śledzić losy komórek w żywych embrionach danio-pręgławka. Wykorzystujemy embriony wykazujące żywy znacznik genetyczny (GFP), aby zlokalizować i precyzyjnie wycelować w dowolne interesujące nas komórki. Procedura ta może być w podobny sposób wykorzystana do precyzyjnej aktywacji białek, hormonów, małych cząsteczek i innych związków „zaklatkowanych” za pomocą światła.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół znakowania komórek z użyciem klatkowanej fluoresceiny, jednak w podobny sposób można wykorzystać inne barwniki i białka fotoaktywowalne.

1. Iniekcja uwięzionej fluoresceiny

  1. Przygotować 5% roztwór zapasowy (5mg klatkowanej fluoresceiny / 100 μL 0.2M KCl) klatkowanej 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylem (DMNB) fluoresceiny sprzężonej z dekstranem (dekstran 10,000 MW, anionowy, Invitrogen, molecular probes, Carlsbad, CA, kat. nr D-3310). Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w -20°C. Należy pamiętać, że klatkowana DMNB fluoresceina jest wrażliwa na światło i powinna być przechowywana w ciemności.
  2. Przygotować rynienkę do iniekcji z 1% agarozy (Sigma, St. Louis, MO, kat. nr A9539) zgodnie z opisem w „The zebrafish book“1.
  3. Przygotować 2 litry pożywki E3 poprzez rozcieńczenie 100-krotnego roztworu zapasowego E3.
  4. Wieczorem w dniu poprzedzającym iniekcję przygotować klatki do rozrodu, oddzielając samce od samic pożądanej linii transgenicznej wykazującej widoczny marker fluorescencyjny (GFP, RFP itd.), służący do lokalizacji komórek docelowych do fotoaktywacji.
  5. Przygotować kapilarne igły do iniekcji (cienkościenne kapilary szklane z włóknem, World Precision Instruments, Sarasota, FL, kat. nr TW100F-6) za pomocą wyciągarki do mikropipet (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97).
  6. Rozmrozić alikwot 5% klatkowanej fluoresceiny na lodzie.
  7. Rozcieńczyć 5% roztwór zapasowy klatkowanej fluoresceiny w 0.2M KCl do stężenia końcowego 1% i przechowywać na lodzie. Unikać ekspozycji na światło.
  8. Ustawić pary do rozrodu przygotowane w kroku 4.
  9. Zebrać zapłodnione jaja natychmiast po ich złożeniu. Ułożyć embriony w stadium jednego komórki w agarozowej formie do iniekcji przykrytej pożywką E31.
  10. Używając końcówki mikroładownika (Eppendorf, Hamburg, Niemcy, kat. nr 5242 956.003), napełnić igłę do iniekcji od tyłu ok. 1 μL 1% roztworu klatkowanej fluoresceiny.
  11. Umieścić napełnioną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza pneumatycznego (pneumatic picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820).
  12. Ustawić objętość iniekcji na 2-3nl i wstrzyknąć klatkowaną fluoresceinę bezpośrednio do cytoplazmy komórki. Wstrzyknąć roztwór do minimum 50 embrionów na eksperyment.
  13. Inkubować embriony w ciemności w temperaturze 28.5°C w pożywce E3 do pożądanego stopnia rozwoju. Jeśli analizowane są embriony starsze niż 24 godziny po zapłodnieniu, dodać 0.1% fenylotiomocznika (PTU, Sigma, St. Louis, MO, kat. nr 22290-9) w celu zahamowania pigmentacji.

2. Mocowanie zarodka

  1. Przygotować świeży roztwór E2 (patrz sekcja roztwory; można przechowywać w temperaturze 4°C przez tydzień).
  2. Pokryć szalki Petriego o średnicy 60 mm cienką warstwą 1% agarozy rozpuszczonej w medium E2.
  3. Przygotować 2% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (Ultra Pure LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, nr kat. 16520100) do zatapiania: rozpuścić agarozę w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej poprzez podgrzewanie w kuchence mikrofalowej do wrzenia. Podczas podgrzewania pozostawić zakrętkę probówki otwartą. Rozdzielić po 1 mL do probówek do mikrocentryfugi i przechowywać w bloku grzejnym w temperaturze 72°C.
  4. Usunąć choriony zarodków, delikatnie rozdzielając chorion ostrymi pincetą (nr 5). Zarodki przechowywać w roztworze E2 na szalce pokrytej agarozą (patrz krok 2). Zarodkami zdechorionowanymi należy manipulować za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, ponieważ mogą one przyklejać się do pipet polipropylenowych. Unikać wystawiania zdechorionowanego zarodka na działanie powietrza, gdyż zarodki te mogą zostać uszkodzone przez napięcie powierzchniowe cieczy.
  5. Pobrać wybrany zarodek w małej objętości E2 za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura i umieścić go na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Obok zarodka nanieść kroplę (~150 μL) 2% agarozy (krok 3). Szybko zmieszać obie krople, aby uzyskać jednorodną końcową mieszaninę ok. 1% agarozy, a następnie za pomocą mikroskopu sekcyjnego zorientować zarodek stroną grzbietową w stronę obiektywu.
  6. Odczekać do stężenia agarozy i dodać medium E2, aż zatopiony zarodek zostanie całkowicie przykryty cieczą. Zaleca się umieszczenie jednego zarodka na szalce, ponieważ po procesie fotoaktywacji może on zostać uwolniony z agarozy.

3. Fotoaktywacja

  1. Używamy dwufotonowego mikroskopu Zeiss LSM 510 META NLO wyposażonego w szerokopasmowy laser femtosekundowy Mai Tai- HP o regulowanej długości fali (700-1020nm) firmy Spectraphysics.
  2. Umieszczamy zamontowany embrion na uchwycie do płytek pod mikroskopem. Fluorescencyjny punkt orientacyjny w embrionie jest wizualizowany przy użyciu obiektywu Achroplan z imersją wodną 40x/0.8W. W kolejnych krokach używamy detektora niedeskanowanego (NDD) z filtrem pasmowym (BP) 500-550nm.
  3. Jako warunek wstępny procesu fotoaktywacji, uzyskujemy przestrzenne informacje fluorescencyjne z obszaru zainteresowania poprzez akwizycję serii obrazów od najbardziej brzusznej do grzbietowej części wykrytego sygnału fluorescencyjnego przy długości fali lasera dwufotonowego 860nm (do detekcji GFP). W tym celu wystarczającą rozdzielczość można uzyskać, stosując odstęp 6μm między każdą akwizycją płaszczyzny ogniskowej.
  4. Wybieramy docelową płaszczyznę z dla fotoaktywacji i ustawiamy ten obszar w ostrości. W zależności od celu eksperymentu, obszar zainteresowania może znajdować się w obrębie lub poza widocznym punktem orientacyjnym GFP. Wykonujemy pojedynczy obraz w tej płaszczyźnie z. Zapisujemy obraz i pozostawiamy go otwartego w osobnym oknie.
  5. Ustawiamy długość fali lasera dwufotonowego na 720nm i po przejściu lasera w tryb mode-locked otwieramy menu „Edit bleach”. Definiujemy obszar zainteresowania (ROI) dla fotoaktywacji zgodnie z obrazem wykonanym przy 860nm (Krok 4), korzystając z menu „Define Region”. Kluczowe jest zaznaczenie ROI na tym obrazie po zmianie długości fali lasera na 720nm, ponieważ ta ostatnia czynność zmienia pozycje x,y obserwowanego pola.
  6. W menu „Edit bleach” dostosowujemy następujące parametry fotoaktywacji (patrz krok 9): a) względną moc lasera; b) liczbę iteracji; c) prędkość skanowania.
  7. Naciskamy „Bleach” w oknie „Edit bleach” i czekamy, aż laser przestanie pracować.
  8. Przełączamy z powrotem na 860nm, wykonujemy obraz pojedynczej płaszczyzny, aby ocenić intensywność powstałego materiału fotoaktywnego, oraz drugą serię akwizycji obrazów, aby ocenić zakres Z (grubość) aktywowanej domeny.
  9. Należy wziąć pod uwagę następujące parametry fotoaktywacji:
    1. Optymalne warunki fotoaktywacji należy wyznaczyć empirycznie, zmieniając dwa parametry: intensywność lasera oraz czas trwania fotoaktywacji. Względną moc lasera można kontrolować za pomocą transmisji modulatora akustyczno-optycznego (AOM). Czas trwania fotoaktywacji jest funkcją liczby iteracji i prędkości skanowania.
    2. Należy wyznaczyć liniowy zakres intensywności fluorescencji, aby uniknąć nasycenia fluorescencji po uwolnieniu z klatki (uncaged).
    3. Istnieje liniowa korelacja między uzyskaną intensywnością fluorescencji uwolnionych cząsteczek a zakresem osi z fotoaktywnego klonu2.

4. Detekcja uwolnionej fluoresceiny

  1. Po fotoaktywacji hodować embriony w ciemności w temperaturze 28.5°C w medium E2 zawierającym 0.1% PTU, aby zapobiec pojawieniu się pigmentacji skóry.
  2. Na pożądanym etapie rozwoju usunąć embrion z agarozy pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą ostrego skalpela wykonać w agarozie nacięcie w kształcie litery „V” w pobliżu embrionu, tak aby wierzchołek „V” był skierowany w stronę głowy embrionu. Umieścić zamkniętą pęsetę w wierzchołku „V” przy głowie embrionu i delikatnie rozsunąć pęsetę, oddzielając agarozę wzdłuż ciała embrionu i uwalniając go do medium.
  3. Zebrać embriony za pomocą wypalanej pipety Pasteura i utrwalić w paraformaldehydzie (PFA; 4% w 1 x PBS, pH 7.2) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
  4. Usunąć roztwór utrwalający i przepłukać 2-3 razy w PBST przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć embriony 100% metanolem przez 10 min, uzupełnić świeżym metanolem i inkubować w temperaturze -20°C przez co najmniej 2 hr.
  6. Rehydratyzować embriony poprzez następujące po sobie inkubacje (po 5 min każda) w serii rozcieńczeń metanolu w PBSTr: 80%, 60%, 40% i 20%. Przemyć 2 x 10 minut w PBSTr.
  7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 500 μL roztworu blokującego.
  8. Dodać fragmenty Fab przeciwciał przeciwko fluoresceinie z alkaliczną fosfatazą (AP) (Roche, Palo Alto, CA, nr kat. 11426338910), rozcieńczone 1:500 w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4°C (umieścić probówki do mikrocentryfugi poziomo).
  9. Przemyć 5 x 15 minut w PBST.
  10. Przemyć przez 5 minut w 0.2M NaCl w TNT.
  11. Przemyć przez 5 minut w 0.4M NaCl w TNT.
  12. Równoważyć 3 x 5 minut w świeżo przygotowanym roztworze Prestain.
  13. Rozpuścić jedną tabletkę Fast Red (Roche, Palo Alto, CA, nr kat. 11496549001) w 2 mL roztworu Prestain. Zaleca się przefiltrowanie roztworu za pomocą papieru Whatman nr 2, aby usunąć nierozpuszczone cząsteczki. Alternatywnie można odwirować roztwór i użyć klarownego supernatantu.
  14. Dodać 500 μL roztworu Fast Red do każdej probówki, inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej i monitorować rozwój barwy, aż do uzyskania pożądanego stosunku sygnału do tła (od 20 minut do kilku godzin). Jeśli pojawi się tło, przenieść do temperatury 4°C. Po godzinie inkubacji uzupełnić nowym roztworem barwiącym Fast Red.
  15. Zatrzymać reakcję barwienia poprzez przemycie 3 x 5 minut w PBST.
  16. Utrwalić przez 20 minut w 4% PFA w temperaturze pokojowej.
  17. Przemyć 2 x 5 minut w PBST.
  18. Przejaśnić embriony w serii roztworów glicerolu w PBS o stężeniach 25%, 50% i 75%, aż embriony osiądą na dnie probówki. Embriony można przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka dni.

5. Wizualizacja fluorescencyjna obszaru odblokowanego

  1. Przygotować szkiełko przedmiotowe do montażu: za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL nanieść na szkiełko cztery kropki przezroczystego smaru silikonowego, rozmieszczone w odstępach około 15mm od siebie. Umieścić embrion w centrum w ~200 μL 75% glicerolu, nałożyć na wierzch szkiełko nakrywkowe (nr 0; 18x18mm) i delikatnie docisnąć je do silikonu, aż roztwór glicerolu wypełni powierzchnię między szkiełkami.
  2. Umieścić zamontowany embrion na stoliku mikroskopu i ustawić ostrość za pomocą obiektywu 40x. Wykonać konfokalną serię obrazów Z-stack, wykorzystując lasery Argon 488nm oraz HeNe 543nm jako źródła wzbudzenia.
  3. Zakres osi z obszaru fotoaktywowanego można przeanalizować za pomocą rekonstrukcji 3D embrionu po procesie uncagingu, korzystając z oprogramowania do analizy obrazu.

6. Roztwory

100 x E3174mM NaCl, 21mM KCl, 12mM MgSO4, 18mM Ca(NO3), 15mM HEPES, pH=7.4. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w 4°C
20 x E20.3M NaCl, 10mM KCl, 20mM CaCl2*2HOH, 20mM MgSO4*7HOH, 3mM KH2PO4, 0.8mM Na2HPO4*2HOH, przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej
1 x E2Rozcieńczyć 20 x E2 w wodzie podwójnie destylowanej i dodać świeżo przygotowany NaHCO3 (do stężenia końcowego 0.7mM), penicylinę i streptomycynę (rozcieńczyć roztwór pen-strep do stężenia końcowego 1 x, który zawiera 100U penicyliny i 100mg streptomycyny na mL (Invitrogen, Carlsbad, CA, nr kat. 15140-122))
PBST0.1% TWEEN-20 w PBS
PBSTr0.3% Triton w PBS
Roztwór blokujący10% BSA, 0.3% Triton, 1% DMSO w PBS
TNT100mM Tris-HCl pH-7.5, 150mM NaCl, 0.5% TWEEN-20 w wodzie podwójnie destylowanej
Roztwór do wstępnego barwienia100mM Tris-HCl pH-8.2, 0.4M NaCl, 0.1% TWEEN-20 w wodzie podwójnie destylowanej

7. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiono przykład wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do fotoaktywacji czynników w żywym embrionie danio pręgowanego. Stosując podobne podejście, śledziliśmy wcześniej linię fotoaktywowanych, znakowanych progenitorów neuronalnych w mózgu danio pręgowanego2,3. Rycina 1 przedstawia fotoaktywację klatkowanego fluoresceiny koniugatu barwnika śledzącego w przedniej płytce neuronalnej embrionów danio pręgowanego niosących transgen reporterowy neurog1::gfp, który służył jako żywy, wewnętrzny punkt orientacyjny.

Zarodki w stadium jednego komórki wstrzyknięto klatkowaną fluoresceinę, a następnie w stadium pąka osadzono w agarozie. W stadium 3-5 somytów zmierzono współrzędne przestrzenne w zarodku transgenicznym neurog1::gfp, aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) dla procesu uwalniania (odklatkowania) (Rysunek 1A, A'). Uwolniono fluoresceinę jako marker linii komórkowej w konkretnej domenie płytki neuralnej (Rysunek 1B, B'). Następnie, w stadium prim5 (24 godziny po zapłodnieniu), określono los tej konkretnej znakowanej poddomeny progenitorów neuralnych za pomocą immunobarwienia uwolnionej fluoresceiny (Rysunek 1C, C').

Zakres dwufotonowego uwalniania laserowego, tj. intensywność uwolnionej fluorescencji oraz grubość domeny fotoaktywowanej (z-span), można kontrolować poprzez regulację dwóch parametrów: intensywności i czasu trwania impulsu lasera. Ten drugi parametr można kontrolować poprzez dostosowanie liczby iteracji oraz prędkości skanowania (patrz część 3, krok 9; Russek-Blum, 2009). W przykładzie przedstawionym na Rysunku 1 zastosowano względną moc lasera na poziomie 12% transmisji AOM, 20 iteracji oraz prędkość skanowania 25.6 μsec/ pixel. Przy tych ustawieniach oznaczono ROI zawierający 9-10 komórek z fotoaktywowanym z-span o szerokości 30μm (~1-2 rzędy komórek).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Reprezentatywny wynik fotoaktywacji klatkowanej fluoresceiny w żywym embrionie danio pręgowanego z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Schematyczny rysunek (A-C) i reprezentatywne obrazy (A'-C') procesu fotoaktywacji. Żywy embrion danio pręgowanego (A, A') wykazujący ekspresję GFP pod kontrolą promotora neurogeniny-1 (neurog1::gfp), który został wstrzyknięty z klatkowanym barwnikiem fluoresceinowym w stadium 1 komórki. W stadium 3-5 somytów fotoaktywowano dyskretny obszar prymordium przedmózgowia (diencephalon), co pozwoliło na wykrycie uwolnionego barwnika fluoresceinowego (B, B'). Po procedurze fotoaktywacji embrion inkubowano w temperaturze 28.5°C, a komórki mózgu zawierające uwolnioną fluoresceinę śledzono za pomocą immunobarwienia przeciwciałami anty-fluoresceinowymi 24 godziny po zapłodnieniu (hpf; C, C'). Dien., Diencephalon (śródmózgowie); Tel., Telencephalon (przedmózgowie).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Związki fotoaktywowalne to cząsteczki, których funkcja pozostaje zamaskowana do momentu naświetlenia ich falą o określonej długości (zazwyczaj UV), co indukuje reakcję fotochemiczną przekształcającą cząsteczki w stan aktywny biologicznie lub chemicznie. Sondy te stanowią potężne narzędzia w badaniach z zakresu biologii komórki, ponieważ aktywacja może być precyzyjnie kontrolowana w czasie i przestrzeni poprzez ograniczanie ich ekspozycji na światło.

Istotną zaletą mikroskopii wielofotonowej j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podziękowania kierujemy do Genii Brodsky za grafikę figur; Vyacheslava Kalchenka, Douglasa Lutza oraz Leonida Roitmana za porady techniczne i pomoc w dwufotonowym uwalnianiu z klatek (uncaging); Maayan Tahor i Sulimana Elsadina za pomoc techniczną; Uwe Strahle za uprzejme udostępnienie linii reporterowej neurogenin1 oraz Amosa Gutnicka za uwagi do niniejszego manuskryptu. Badania w laboratorium Levkowitza są wspierane przez niemiecko-izraelską fundację (grant nr 183/2007), Izraelską Fundację Naukową (grant nr 928/08) oraz Fundację Harriet&Marcel Dekker. G.L. piastuje stanowisko Tauro Career Development Chair in Biomedical Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fluoresceina w klatce 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylowej (DMNB) sprzężona z dekstranem (dekstran 10 000 MW, anionowy)InvitrogenD-3310sondy molekularne
Agaroza do rynien iniekcyjnych i płytek powlekanychSigma-AldrichA9539
Cienkościenne kapilary szklane z włóknemWorld Precision Instruments, Inc.TW100F-6
Wytrawiarka mikropipetSutter Instrument Co.P-97
Końcówka do mikrodoładowywaniaEppendorf5242 956.003
pneumatyczna pikopompkaWorld Precision Instruments, Inc.PV820
Fenylotiomocznik (PTU)Sigma-Aldrich22290-9
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia do montażu zarodkówUltra Pure LMP agarose16520100
Fragmenty Fab przeciw fluoresceinie z fosfatazą alkaliczną (AP)Roche Group11426338910
Fast RedRoche Group11496549001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).
  2. Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
  3. Russek-Blum, N. Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning. Development. 135, 3401-3413 (2008).
  4. Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
  5. Staudt, N., Houart, C. The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization. PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).
  6. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
  7. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).
  8. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  9. Bulina, M. E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).
  10. Adams, S. R., Tsien, R. Y. Controlling cell chemistry with caged compounds. Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).
  11. Wieboldt, R. Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).
  12. Marque, J. J. Using caged neurotransmitters. Nature. 337, 583-584 (1989).
  13. Zucker, R. Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2. Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).
  14. Neveu, P. A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos. Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).
  15. Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos. Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).
  16. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nat Genet. 28, 317-325 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia dwufotonowatechnika fotoaktywacjiklatkowana fluoresceinarozdzielczo pojedynczej kom rkiznacznik GFPagaroza o niskiej temperaturze topnieniamikroskopia konfokalnabarwienie anty fluoresceinimonta zarodka

Powiązane artykuły