Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Podsumowanie

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Streszczenie

Fotoaktywacja związków docelowych w żywym organizmie okazała się wartościowym podejściem do badania różnych procesów biologicznych, takich jak rozwój embrionalny, sygnalizacja komórkowa i fizjologia dorosłych osobników. W tym kontekście zastosowanie mikroskopii wielofotonowej umożliwia ilościową fotoaktywację danego czynnika światłoczułego w głębokich tkankach z rozdzielczością pojedynczej komórki. Ponieważ embriony rybek danio-pręgławka są optycznie przezroczyste, ich rozwój można monitorować in vivo. Cechy te sprawiają, że rybka danio-pręgławka jest idealnym organizmem modelowym do kontrolowania aktywności różnych czynników chemicznych i białek za pomocą skupionego światła. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do indukowania aktywacji chemicznie „zaklatkowanej” (caged) fluoresceiny, co z kolei pozwala nam śledzić losy komórek w żywych embrionach danio-pręgławka. Wykorzystujemy embriony wykazujące żywy znacznik genetyczny (GFP), aby zlokalizować i precyzyjnie wycelować w dowolne interesujące nas komórki. Procedura ta może być w podobny sposób wykorzystana do precyzyjnej aktywacji białek, hormonów, małych cząsteczek i innych związków „zaklatkowanych” za pomocą światła.

Protokół

Opisujemy protokół znakowania komórek z użyciem klatkowanej fluoresceiny, jednak w podobny sposób można wykorzystać inne barwniki i białka fotoaktywowalne.

1. Wtryskiwanie uwięzionej fluoresceiny

1. Przygotować 5% roztwór stokowy (5mg caged-fluorescein / 100 μL 0.2M KCl) fluoresceiny z klatką 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylową (DMNB) sprzężonej z dekstranem (10,000 MW dextran, anionic, Invitrogen, molecular probes, Carlsbad, CA, kat. nr D-3310). Rozdzielić na alykwoaty i przechowywać w -20°C. Należy pamiętać, że fluoresceina z klatką DMNB jest wrażliwa na światło i powinna być przechowywana w ciemności.
2. Przygotować korytko do iniekcji z 1% agarozy (Sigma, St. Louis, MO, kat. nr A9539) zgodnie z opisem w „The zebrafish book“¹.
3. Przygotować 2 litry pożywki E3 poprzez rozcieńczenie 100-krotnego roztworu stokowego E3.
4. Wieczorem przed iniekcją przygotować klatki do rozrodu, oddzielając samce od samic pożądanej linii transgenicznej wykazującej widoczny znacznik fluorescencyjny (GFP, RFP itp.), służący do lokalizacji komórek docelowych do fotoaktywacji.
5. Przygotować kapilary do iniekcji (Thin Wall Glass Capillaries with filament, World Precision Instruments, Sarasota, FL, kat. nr TW100F-6) przy użyciu wyciągacza mikrokapilar (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97).
6. Rozmrozić alykwoaty 5% caged fluorescein na lodzie.
7. Rozcieńczyć 5% roztwór stokowy caged fluorescein w 0.2M KCl do stężenia końcowego 1% i przechowywać na lodzie. Unikać ekspozycji na światło.
8. Ustawić krzyżówki rozrodcze przygotowane w kroku 4.
9. Zebrać zapłodnione jaja niezwłocznie po ich złożeniu. Ułożyć embriony w stadium jednego komórki w agarozowej formie do iniekcji przykrytej pożywką E3¹.
10. Za pomocą końcówki microloader (Eppendorf, Hamburg, Germany, kat. nr 5242 956.003) wypełnić igłę do iniekcji od tyłu ok. 1 μL 1% roztworu caged fluorescein.
11. Umieścić załadowaną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do pneumatycznego mikroinjektora (pneumatic picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820).
12. Ustawić objętość iniekcji na 2-3nl i wstrzyknąć caged-fluorescein bezpośrednio do cytoplazmy komórki. Wykonać iniekcję w minimum 50 embrionach na eksperyment.
13. Inkubować embriony w ciemności w temperaturze 28.5°C w pożywce E3 do pożądanego stadium rozwoju. Jeśli analizowane są embriony starsze niż 24 godziny po zapłodnieniu, dodać 0.1% fenylotiomocznika (PTU, Sigma, St. Louis, MO, kat. nr 22290-9), aby zahamować pigmentację.

2. Montowanie zarodków

1. Przygotuj świeży roztwór E2 (patrz sekcja roztwory; można przechowywać w temperaturze 4°C przez tydzień).
2. Pokryj szalki Petriego o średnicy 60 mm cienką warstwą 1% agarozy rozpuszczonej w medium E2.
3. Przygotuj 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (Ultra Pure LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, nr kat. 16520100) do zatapiania: rozpuść agarozę w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej, podgrzewając w mikrofalówce do wrzenia. Podczas podgrzewania pozostaw otwartą zakrętkę probówki. Odmierz alikwoty po 1 mL do probówek do mikrocentryfugi i przechowuj w bloku grzejnym w temperaturze 72°C.
4. Usuń choriony embrionów, delikatnie rozdzielając chorion ostrymi pęsetą (nr 5). Przechowuj embriony w roztworze E2 na szalce pokrytej agarozą (patrz krok 2). Dechorionowane embriony należy przenosić za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, ponieważ mogą one przyklejać się do pipet polipropylenowych. Unikaj wystawiania zdechorionowanego embrionu na działanie powietrza, gdyż mogą one zostać uszkodzone przez napięcie powierzchniowe cieczy.
5. Pobierz wybrany embrion w niewielkiej objętości E2 za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura i umieść go na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Obok embrionu nanieś kroplę (~150 μL) 2% agarozy (krok 3). Szybko wymieszaj obie krople, aby uzyskać jednorodną końcową mieszaninę ok. 1% agarozy, a następnie za pomocą mikroskopu sekcyjnego zorientuj embrion tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana w stronę obiektywu.
6. Odczekaj do stężenia agarozy i dodaj medium E2, aż zatopiony embrion zostanie całkowicie zanurzony w cieczy. Zaleca się umieszczanie jednego embrionu na szalce, ponieważ po procesie fotoaktywacji może on zostać uwolniony z agarozy.

3. Fotoaktywacja

1. Używamy dwufotonowego mikroskopu Zeiss LSM 510 META NLO wyposażonego w szerokopasmowy strojne (700-1020nm) femtosekundowy laser Mai Tai- HP firmy Spectraphysics.
2. Umieszczamy zamontowany embrion na uchwycie do płytek pod mikroskopem. Fluorescencyjny punkt orientacyjny w embrionie jest wizualizowany przy użyciu obiektywu Achroplan z zanurzeniem w wodzie 40x/0.8W. W kolejnych krokach wykorzystujemy detektor niedeskany (NDD) z filtrem pasmowym (BP) 500-550nm.
3. Jako warunek wstępny procesu fotoaktywacji, uzyskujemy przestrzenne informacje fluorescencyjne o obszarze zainteresowania poprzez akwizycję serii obrazów od najbardziej brzusznej do grzbietowej części wykrytego sygnału fluorescencyjnego przy długości fali lasera dwufotonowego 860nm (do detekcji GFP). W tym celu wystarczającą rozdzielczość można uzyskać stosując odstęp 6μm między każdą nabieraną płaszczyzną ogniskową.
4. Wybieramy docelową płaszczyznę z dla fotoaktywacji i ustawiamy ten obszar w ogniskowej. W zależności od celu eksperymentu, obszar zainteresowania może znajdować się w obrębie lub poza widocznym punktem orientacyjnym GFP. Wykonujemy pojedynczy obraz w tej płaszczyźnie z. Zapisujemy obraz i pozostawiamy go otwartego w osobnym oknie.
5. Ustawiamy długość fali lasera dwufotonowego na 720nm i po przejściu lasera w tryb mode-locked otwieramy menu „Edit bleach”. Definiujemy obszar zainteresowania (ROI) dla fotoaktywacji zgodnie z obrazem wykonanym przy 860nm (Krok 4), korzystając z menu „Define Region”. Kluczowe jest wybranie ROI na tym obrazie po zmianie długości fali lasera na 720nm, ponieważ ta operacja zmienia pozycje x,y obserwowanego pola.
6. W menu „Edit bleach” dostosowujemy następujące parametry fotoaktywacji (patrz krok 9): a) względną moc lasera; b) liczbę iteracji; c) prędkość skanowania.
7. Naciskamy przycisk „Bleach” w oknie „Edit bleach” i czekamy, aż laser przestanie pracować.
8. Przełączamy z powrotem na 860nm, wykonujemy obraz pojedynczej płaszczyzny, aby ocenić intensywność powstałego materiału fotoaktywnego, oraz drugą serię akwizycji obrazów, aby ocenić zakres Z (grubość) aktywowanej domeny.
9. Należy wziąć pod uwagę następujące parametry fotoaktywacji:
   1. Optymalne warunki fotoaktywacji należy wyznaczyć empirycznie, zmieniając dwa parametry: intensywność lasera oraz czas trwania fotoaktywacji. Względną moc lasera można kontrolować za pomocą transmisji modulatora akustyczno-optycznego (AOM). Czas trwania fotoaktywacji jest funkcją liczby iteracji i prędkości skanowania.
   2. Należy wyznaczyć liniowy zakres intensywności fluorescencji, aby uniknąć nasycenia fluorescencji po uwolnieniu (uncaged fluorescence).
   3. Istnieje liniowa korelacja między uzyskaną intensywnością fluorescencji uwolnionych cząsteczek a zakresem osi z fotoaktywnego klona².

4. Detekcja uwolnionej fluoresceiny

1. Po fotoaktywacji hodować zarodki w ciemności w temperaturze 28,5°C w medium E2 zawierającym 0,1% PTU, aby zapobiec pojawieniu się pigmentacji skóry.
2. W pożądanym stadium rozwoju usunąć zarodek z agarozy pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą ostrego skalpela wykonać w agarozie nacięcie w kształcie litery „V” w pobliżu zarodka, tak aby wierzchołek „V” był skierowany w stronę głowy zarodka. Umieścić zamkniętą pęsetę w wierzchołku „V” blisko głowy zarodka i delikatnie rozsunąć pęsetę, rozdzielając agarozę wzdłuż zarodka i uwalniając go do medium.
3. Zebrać zarodki za pomocą wypalonej pipety Pasteura i utrwalić w paraformaldehydzie (PFA; 4% w 1 x PBS, pH 7,2) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
4. Usunąć roztwór utrwalający i przepłukać 2–3 razy w PBST przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przemyć zarodki 100% metanolem przez 10 min, uzupełnić świeżym metanolem i inkubować w temperaturze -20°C przez co najmniej 2 h.
6. Rehydratować zarodki poprzez następujące po sobie inkubacje (po 5 min każda) w serii rozcieńczeń metanolu w PBSTr: 80%, 60%, 40% i 20%. Przemyć 2 x 10 minut w PBSTr.
7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 500 μL roztworu blokującego.
8. Dodać fragmenty Fab przeciwciał przeciw fluoresceinie z fosfatazą alkaliczną (AP) (Roche, Palo Alto, CA, nr kat. 11426338910), rozcieńczone 1:500 w roztworze blokującym, i inkubować przez noc w temperaturze 4°C (probówki do mikrocentryfugi należy położyć na boku).
9. Przemyć 5 x 15 minut w PBST.
10. Przemyć przez 5 minut w 0,2M NaCl w TNT.
11. Przemyć przez 5 minut w 0,4M NaCl w TNT.
12. Równoważyć 3 x 5 minut w świeżo przygotowanym roztworze Prestain.
13. Rozpuścić jedną tabletkę Fast Red (Roche, Palo Alto, CA, nr kat. 11496549001) w 2 mL roztworu Prestain. Zaleca się przefiltrowanie roztworu za pomocą papieru Whatman nr 2, aby usunąć nierozpuszczone cząsteczki. Alternatywnie można odwiruwać roztwór i użyć klarownego supernatantu.
14. Dodać 500 μL roztworu Fast Red do każdej probówki, inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej i monitorować rozwój barwy, aż do osiągnięcia pożądanego stosunku sygnału do tła (od 20 minut do kilku godzin). Jeśli pojawi się tło, przenieść do temperatury 4°C. Po godzinie inkubacji uzupełnić świeżym roztworem barwiącym Fast Red.
15. Zatrzymać reakcję barwienia poprzez 3 x 5 minutowe płukanie w PBST.
16. Utrwalić przez 20 minut w 4% PFA w temperaturze pokojowej.
17. Przemyć 2 x 5 minut w PBST.
18. Przejaśnić zarodki, przeprowadzając je przez serię rozcieńczeń glicerolu w PBS (25%, 50% i 75%), aż zarodki osiądą na dnie probówki. Zarodki można przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka dni.

5. Wizualizacja fluorescencyjna obszaru odblokowanego

1. Przygotuj szkiełko przedmiotowe do montażu: za pomocą strzykawki 1 mL nanieś na szkiełko cztery kropki przezroczystego smaru silikonowego, rozmieszczone w odległości ok. 15mm od siebie. Umieść zarodek w centrum w ok. 200 μL 75% glicerolu, nałóż na wierzch szkiełko nakrywkowe (nr 0; 18x18mm) i delikatnie dociśnij je do silikonu, aż roztwór glicerolu wypełni powierzchnię między szkiełkami.
2. Umieść zamontowany zarodek na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość, korzystając z obiektywu 40x. Wykonaj konfokalną serię obrazów Z-stack, wykorzystując lasery Argon 488nm oraz HeNe 543nm jako źródła wzbudzenia.
3. Zakres osi z domeny fotoaktywowanej można przeanalizować, wykonując rekonstrukcję 3D zarodka po procesie uncagingu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

6. Roztwory

100 x E3	174 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO44, 18 mM Ca(NO3)2, 15 mM HEPES, pH=7,4. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w 4°C
20 x E2	0,3 M NaCl, 10 mM KCl, 20 mM CaCl22*2HOH, 20 mM MgSO447HOH, 3mM KH2PO4, 0,8 mM Na2HPO4*2HOH, przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej
1 x E2	Rozcieńczyć 20 x E2 w wodzie dwukrotnie destylowanej i dodać świeżo przygotowany NaHCO33 (do stężenia końcowego 0,7 mM), penicylinę i streptomycynę (rozcieńczyć roztwór pen-strep do stężenia końcowego 1x, który zawiera 100 J penicyliny i 100 mg streptomycyny na ml (Invitrogen, Carlsbad, CA, nr kat. 15140-122))
PBST	0,1% TWEEN-20 w PBS
PBSTr	0,3% Triton w PBS
Roztwór blokujący	10% BSA, 0,3% Triton, 1% DMSO w PBS
TNT	100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% TWEEN-20 w wodzie dwukrotnie destylowanej
Roztwór do wstępnego barwienia	100 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,4 M NaCl, 0,1% TWEEN-20 w wodzie dwukrotnie destylowanej

7. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiono przykład wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do fotoaktywacji czynników w żywym embrionie danio pręgowanego. Stosując podobne podejście, śledziliśmy wcześniej linię fotoaktywowanych, znakowanych progenitorów neuronalnych w mózgu danio pręgowanego^2,3. Rycina 1 przedstawia fotoaktywację klatkowanego barwnika śledzącego sprzężonego z fluoresceiną w przedniej płytce nerwowej embrionów danio pręgowanego niosących transgen reporterowy neurog1::gfp, który służył jako żywy, wewnętrzny punkt orientacyjny.

Zarodki w stadium jednego komórki wstrzyknięto z uwięzioną fluoresceiną (caged fluorescein), a następnie osadzono w agarozie w stadium pączka. W stadium 3–5 somytów zmierzono współrzędne przestrzenne w zarodku transgenicznym neurog1::gfp, aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) dla procesu uwalniania fluoresceiny (rycina 1A, A'). Uwolniono znacznik linii fluoresceiny w konkretnej domenie płytki neuronalnej (rycina 1B, B'). Następnie, w stadium prim5 (24 godziny po zapłodnieniu), określono los tej konkretnej znakowanej poddomeny progenitorów neuronalnych poprzez immunobarwienie uwolnionej fluoresceiny (rycina 1C, C').

Zakres dwufotonowego uwalniania laserowego, tj. intensywność uwolnionej fluorescencji oraz grubość domeny fotoaktywowanej (z-span), można kontrolować poprzez regulację dwóch parametrów: natężenia oraz czasu trwania impulsu laserowego. Ten drugi można kontrolować poprzez dostosowanie liczby iteracji i prędkości skanowania (patrz część 3, krok 9; Russek-Blum, 2009). W przykładzie przedstawionym na Rysunku 1 zastosowano względną moc lasera wynoszącą 12% transmisji AOM, 20 iteracji oraz prędkość skanowania 25,6 μsec/ pixel. Przy tych ustawieniach oznakowano ROI zawierający 9-10 komórek, przy fotoaktywowanej wartości z-span wynoszącej 30μm (~1-2 rzędy komórek).

Rycina 1. Reprezentatywny wynik fotoaktywacji klatkowanej fluoresceiny w żywym embrionie danio pręgowanego z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Schematyczna ilustracja (A-C) i reprezentatywne obrazy (A'-C') procesu fotoaktywacji. Żywy embrion zebrafish (A, A') wykazujący ekspresję GFP pod kontrolą promotora neurogeniny-1 (neurog1::gfp), do którego w stadium 1 komórki wstrzyknięto uwięziony (caged) barwnik fluoresceinowy. W stadium 3-5 somitów fotoaktywowano niewielki obszar prymordium przedmózgowia (podwzgórza), po czym wykryto uwolniony barwnik fluoresceinowy (B, B'). Po procedurze fotoaktywacji embrion inkubowano w temperaturze 28,5°C, a komórki mózgu zawierające uwolnioną fluoresceinę śledzono za pomocą immunostynowania przeciwciałami anty-fluoresceinowymi w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf; C, C'). Dien., podwzgórze (diencephalon); Tel., koniec mózgu (telencephalon).

Dyskusja

Związki fotoaktywowalne to cząsteczki, których funkcja pozostaje zamaskowana do momentu naświetlenia ich falą o określonej długości (zazwyczaj UV), co indukuje reakcję fotochemiczną przekształcającą cząsteczki w stan aktywny biologicznie lub chemicznie. Sondy te stanowią potężne narzędzia w badaniach z zakresu biologii komórki, ponieważ aktywacja może być precyzyjnie kontrolowana w czasie i przestrzeni poprzez ograniczanie ich ekspozycji na światło.

Istotną zaletą mikroskopii wielofotonowej j...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluoresceina w klatce 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylowej (DMNB) sprzężona z dekstranem (dekstran 10 000 MW, anionowy)	Invitrogen	D-3310	sondy molekularne
Agaroza do rynien iniekcyjnych i płytek powlekanych	Sigma-Aldrich	A9539
Cienkościenne kapilary szklane z włóknem	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-6
Wytrawiarka mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-97
Końcówka do mikrodoładowywania	Eppendorf	5242 956.003
pneumatyczna pikopompka	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Fenylotiomocznik (PTU)	Sigma-Aldrich	22290-9
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia do montażu zarodków	Ultra Pure LMP agarose	16520100
Fragmenty Fab przeciw fluoresceinie z fosfatazą alkaliczną (AP)	Roche Group	11426338910
Fast Red	Roche Group	11496549001