Pomiar 50% aktywności hemolitycznej dopełniacza (CH50) w surowicy

Podsumowanie

Droga klasyczna jest aktywowana przez przeciwciała i kończy się lizą komórki docelowej. Test CH₅₀ pozwala na pomiar aktywności dopełniacza w próbce surowicy. Niniejsze wideo przedstawia etapy wyznaczania wartości CH₅₀ w próbce surowicy, sposób obliczeń oraz interpretację wyników.

Streszczenie

Układ dopełniacza to grupa białek, których aktywacja prowadzi do lizy komórki docelowej i wspomaga fagocytozę poprzez opsonizację. Można ilościowo określić poszczególne składniki dopełniacza, jednak nie dostarcza to żadnych informacji na temat aktywności tej ścieżki. CH₅₀jest testem przesiewowym służącym do oceny aktywacji klasycznej drogi dopełniacza (Rys. 1) i jest on czuły na redukcję, brak i/lub nieaktywność każdego z elementów tej drogi. CH₅₀badanie sprawdza zdolność funkcjonalną komponentów układu dopełniacza surowiczego drogi klasycznej do lizy owczych erytrocytów (SRBC) uprzednio opasowanych przeciwciałami królika przeciwko owczym erytrocytom (hemolizyną). Gdy opasane przeciwciałami SRBC są inkubowane z badaną surowicą, dochodzi do aktywacji klasycznej drogi dopełniacza i w konsekwencji do hemolizy. Jeśli brak jest komponentu dopełniacza, CH₅₀poziom będzie wynosić zero; jeśli jeden lub więcej komponentów drogi klasycznej jest zmniejszonych, poziom CH₅₀zostanie zmniejszone. Stała objętość optymalnie uczulonych SRBC jest dodawana do każdego rozcieńczenia surowicy. Po inkubacji mieszaninę wiruje się, a stopień hemolizy określa się poprzez pomiar absorbancji hemoglobiny uwolnionej do nadosadu przy 540nm. Ilość aktywności dopełniacza wyznacza się, badając zdolność różnych rozcieńczeń badanego surowiczy do lizy SRBC pokrytych przeciwciałami. Niniejszy film przedstawia etapy eksperymentalne analizy poziomu aktywności klasycznej drogi aktywacji dopełniacza.

Protokół

Przygotowanie 5x roztworu soli w buforze weronalowym (VBS)

1. W celu przygotowania soli fizjologicznej buforowanej weronalem (VBS) należy przygotować trzy osobne roztwory.
2. Roztwór 1 przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 21.25gm NaCl i 0.94gm barbitonu sodowego w 350ml wody destylowanej. Końcowe stężenia NaCl i barbitonu sodowego wynoszą odpowiednio 1.02M i 13mM.
3. Roztwór 2 przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 1.44gm barbitonu w 125ml gorącej wody destylowanej. Końcowe stężenie barbitonu wynosi 62.5mM.
4. Roztwór 3 przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 20.33gm MgCl₂ i 4.41gm CaCl₂ w 100ml wody destylowanej. Końcowe stężenia MgCl₂ i CaCl₂ wynoszą odpowiednio 2.18M i 440mM.
5. Należy zmieszać roztwory 1 i 2, a następnie schłodzić je do temperatury pokojowej.
6. Po ochłodzeniu połączonego roztworu należy dodać 1.25ml roztworu 3 i dostosować pH do wartości 7.3-7.5 za pomocą 1M HCl.
7. Należy uzupełnić końcową objętość do 500ml wodą destylowaną, aby przygotować 5-krotny roztwór zapasowy.
8. Aby przygotować 1-krotny roztwór roboczy, należy rozcieńczyć roztwór zapasowy w stosunku 1:5 wodą destylowaną.

Sensybilizacja owczych erytrocytów hemolizyną

1. Przygotować hemolizynę, rozcieńczając ją najpierw w stosunku 1:50 w VBS
2. Do 4ml SRBC dodać 6ml VBS i delikatnie wymieszać przez odwracanie
3. Wirować przy 600g przez 5 minut
4. Odlać nadsącz i wyprać komórki jeszcze 2 razy
5. Po ostatnim przemyciu wirować komórki przy 900g przez 5 minut w celu ich osadzenia
6. Odlać nadsącz i resuspendować komórki w odpowiedniej ilości VBS, aby przygotować 10% roztwór, tj. 0,5ml osadu komórkowego resuspendować w 5 ml buforu
7. Kroplami dodać do komórek równą objętość hemolizyny (przeciwciała królika przeciwko erytrocytom owiec), stale delikatnie mieszając
8. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 30°C przez 30 minut
9. Delikatnie mieszać komórki co 15 minut
10. Uczulone SRBC można przechowywać przez noc w temperaturze 4°C

Analiza CH₅₀

1. Oznakuj serię probówek w dwóch powtórzeniach jako 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 i 1:128.
2. Przygotuj serię dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych surowicy kontrolnej i badawczej w VBS, każdą w dwóch powtórzeniach.
3. Zacznij od 1:4 (100ml surowicy + 300ml VBS) i przenieś 200ml próbki do następnej oznakowanej probówki.
4. Mieszaj dokładnie pomiędzy rozcieńczeniami i przenieś 200ml do następnego rozcieńczenia za pomocą nowej końcówki pipety.
5. Powtarzaj czynność, aż zostaną przygotowane wszystkie pięć rozcieńczeń.
6. Odrzuć 200ml z końcowego rozcieńczenia 1:128.
7. Dodaj 200ml zawiesiny uczulonych SRBC do wszystkich probówek.
8. Oznakuj dwie oddzielne probówki jako BLANK (próba ślepa) i dodaj 200ml uczulonych SRBC + 200ml VBS. Probówki te posłużą do pomiaru spontanicznej lizy SRBC w VBS.
9. Oznakuj kolejne dwie oddzielne probówki jako TOTAL LYSIS (liza całkowita) i dodaj 200ml uczulonych SRBC + 200ml wody destylowanej.
10. Delikatnie wymieszaj zawartość wszystkich probówek.
11. Inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 30 minut, mieszając po 15 minutach.
12. Odwiruj próbki z prędkością 1,500g przez 5 minut, aby osadzić RBC.
13. Przenieś 100ml supernatantu z każdej probówki do dołka w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
14. Dodaj 100ml wody destylowanej do każdego dołka.
15. Zmierz absorbancję próbek przy 540nm przy użyciu spektrofotometru do płytek.

Obliczenia

1. Obliczyć średnią absorbancję dla każdej próbki
2. Odjąć absorbancję PRÓBY BIAŁEJ (lizy spontanicznej) od wszystkich próbek
3. Obliczyć % lizy dla każdego rozcieńczenia, korzystając z następującego wzoru:
   
4. Nanieść procent lizy (oś pionowa) w funkcji rozcieńczenia surowicy na osi poziomej.
5. Obliczyć rozcieńczenie wymagane do uzyskania 50% hemolizy dla surowicy kontrolnej i badanej (Rys. 2).

Reprezentatywne wyniki:

Wideo zawiera przykład reprezentatywnych wyników. W praktyce, równolegle z surowicą badaną przeprowadza się analizę surowicy kontrolnej, traktując ją w ten sam sposób. Poniżej (Tabela 1) przedstawiono przykładowe dane z przetestowanej próbki surowicy. Dane są przetwarzane zgodnie z równaniem przedstawionym w punkcie 5.3.

Próbka	OD540	Średnia
Ślepa próba	0.042, 0.044	0.043
Całkowita liza	0.183, 0.183	0.183
Rozcieńczenie	OD540	Średnia	Średnia-Ślepa próba	% lizy
1:8	0.200, 0.219	0.210	0.168	116
1:16	0.179, 0.173	0.176	0.134	93
1:32	0.134, 0.110	0.122	0.08	55
1:64	0.053, 0.066	0.059	0.017	12
1:128	0.044, 0.045	0.045	0.003	2

Rycina 1. Aktywacja klasycznej drogi dopełniacza. Droga klasyczna jest aktywowana poprzez wiązanie immunoglobuliny M (IgM) lub immunoglobuliny G (IgG) na powierzchni komórki docelowej. Fragment Fc przeciwciała wiąże się z C1q, co prowadzi do aktywacji C1r, która z kolei aktywuje kolejną cząsteczkę C1r; wspólnie aktywują one dwie cząsteczki C1s. C1s rozszczepia następnie C4, co odsłania miejsce wiązania dla C2, które również zostaje rozszczepione. Wiązanie C4b i C2a prowadzi do powstania kompleksu zwanego konwertazą C3. Kompleks ten rozszczepia C3, tworząc C3a i C3b, z których część łączy się z konwertazą C3, tworząc konwertazę C5. Kompleks ten oddziałuje teraz na C5, a powstały fragment C5b wiąże się z C6, inicjując tworzenie kompleksu atakującego błonę (MAC). C5b6 oddziałuje na C7, który z kolei oddziałuje na C8 i ostatecznie na C9, co prowadzi do powstania końcowego MAC. (Goldsby et al, 2003).

Rysunek 2. Wykreślanie danych z próbek i obliczanie CH50 dla kontrolnej i badanej próbki surowicy. (A), Obliczony procent (%) lizy dla próbek surowicy kontrolnej (•) i badanej () został naniesiony w zależności od czynnika rozcieńczenia. (B) Aby obliczyć 50% lizy, z wartości 50% prowadzi się linię do punktu przecięcia z liniami wykresu, a następnie prowadzi się linię pionową w dół do wartości rozcieńczenia. W tym przykładzie do osiągnięcia 50% lizy wymagane jest 35-krotne rozcieńczenie kontroli oraz 21,6-krotne rozcieńczenie surowicy badanej. Dane te wskazują, że w surowicy badanej znajduje się mniej dopełniacza w porównaniu z kontrolą, ponieważ wymagane było mniejsze rozcieńczenie przed osiągnięciem 50% lizy. Próbka kontrolna wykazuje również > 100% lizy przy rozcieńczeniu 1:8. Jest to najprawdopodobniej spowodowane niepełną lizą SRBC przez wodę destylowaną i bardziej efektywną lizą przez komponenty dopełniacza.

Dyskusja

Analiza CH₅₀ jest podatna na wiele zakłóceń. Niektóre SRBC są bardziej kruche od innych, co prowadzi do spontanicznej hemolizy niezwiązanej z aktywnością dopełniacza. Powinowactwo przeciwciał króliczych różni się w zależności od serii i producenta, co wpływa na ilość przeciwciał wiążących się z SRBC. Ponadto proces uczulania SRBC przeciwciałami skutkuje powstaniem komórek z różną ilością przeciwciał pokrywających SRBC. Pobieranie i przechowywanie próbek stanowią istotne potencjalne źródło błędów. Składniki dop...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Owcze erytrocyty	CSL	2490201	Stosować w stężeniu końcowym 1%
Surowica			Surowica ludzka
Królicze serum anty-owcze hemolityczne (RBC), niekonjugowane	AbD Serotec	C12HSB
Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem	Sarstedt Ltd	83.1839
Saloina buforowana weronalem			Stosować w stężeniu końcowym 1x
Kąpiel wodna
Czytnik płytek
Pomieszczenie/inkubator o temperaturze 37°C