Pomiar 50% aktywności hemolitycznej dopełniacza (CH50) w surowicy

Podsumowanie

Droga klasyczna jest aktywowana przez przeciwciała i kończy się lizą komórki docelowej. Test CH₅₀ pozwala na pomiar aktywności dopełniacza w próbce surowicy. Niniejsze wideo przedstawia etapy wyznaczania wartości CH₅₀ w próbce surowicy, sposób obliczeń oraz interpretację wyników.

Streszczenie

Układ dopełniacza to grupa białek, których aktywacja prowadzi do lizy komórki docelowej i wspomaga fagocytozę poprzez opsonizację. Można ilościowo określić poszczególne składniki dopełniacza, jednak nie dostarcza to żadnych informacji na temat aktywności tej ścieżki. CH₅₀jest testem przesiewowym służącym do oceny aktywacji klasycznej drogi dopełniacza (Rys. 1) i jest on czuły na redukcję, brak i/lub nieaktywność każdego z elementów tej drogi. CH₅₀badanie sprawdza zdolność funkcjonalną komponentów układu dopełniacza surowiczego drogi klasycznej do lizy owczych erytrocytów (SRBC) uprzednio opasowanych przeciwciałami królika przeciwko owczym erytrocytom (hemolizyną). Gdy opasane przeciwciałami SRBC są inkubowane z badaną surowicą, dochodzi do aktywacji klasycznej drogi dopełniacza i w konsekwencji do hemolizy. Jeśli brak jest komponentu dopełniacza, CH₅₀poziom będzie wynosić zero; jeśli jeden lub więcej komponentów drogi klasycznej jest zmniejszonych, poziom CH₅₀zostanie zmniejszone. Stała objętość optymalnie uczulonych SRBC jest dodawana do każdego rozcieńczenia surowicy. Po inkubacji mieszaninę wiruje się, a stopień hemolizy określa się poprzez pomiar absorbancji hemoglobiny uwolnionej do nadosadu przy 540nm. Ilość aktywności dopełniacza wyznacza się, badając zdolność różnych rozcieńczeń badanego surowiczy do lizy SRBC pokrytych przeciwciałami. Niniejszy film przedstawia etapy eksperymentalne analizy poziomu aktywności klasycznej drogi aktywacji dopełniacza.

Protokół

Przygotowanie 5x roztworu buforu Veronal Buffered Saline (VBS)

1. Aby przygotować bufor solny Veronala (VBS), należy przygotować trzy oddzielne roztwory.
2. Przygotować roztwór 1, rozpuszczając 21,25gm NaCl oraz 0,94gm barbitonu sodowego w 350ml wody destylowanej. Końcowe stężenia NaCl i barbitonu sodowego wynoszą odpowiednio 1,02M i 13mM.
3. Przygotować roztwór 2, rozpuszczając 1,44gm barbitonu w 125ml gorącej wody destylowanej. Końcowe stężenie barbitonu wynosi 62,5mM.
4. Przygotować roztwór 3, rozpuszczając 20,33gm MgCl₂ oraz 4,41gm CaCl₂ w 100ml wody destylowanej. Końcowe stężenia MgCl₂ i CaCl₂ wynoszą odpowiednio 2,18M i 440mM.
5. Wymieszać roztwory 1 i 2, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
6. Po ochłodzeniu połączonego roztworu dodać 1,25ml roztworu 3 i dostosować pH do poziomu 7,3-7,5 przy użyciu 1M HCl.
7. Uzupełnić końcową objętość do 500ml wodą destylowaną, aby przygotować 5-krotny roztwór zapasowy.
8. Aby przygotować 1-krotny roztwór roboczy, rozcieńczyć roztwór zapasowy w stosunku 1:5 wodą destylowaną.

Sensybilizacja owczych erytrocytów hemolizyną

1. Przygotować hemolizynę, rozcieńczając ją najpierw w stosunku 1:50 w VBS
2. Do 4ml SRBC dodać 6ml VBS i delikatnie wymieszać poprzez odwracanie probówki
3. Wirować przy 600g przez 5minutes
4. Odpiąć nadosad i przemyć komórki jeszcze 2 razy
5. Po ostatnim przemyciu wirować komórki przy 900g przez 5minutes w celu ich osadzenia
6. Odpiąć nadosad i resuspender komórki w odpowiedniej ilości VBS, aby przygotować 10% roztwór, tj. 0,5ml osadzonych komórek resuspender w 5 ml buforu
7. Kroplowo dodawać równą objętość hemolizyny (przeciwciała królika przeciwko owczym czerwonym krwinkom krwi) do komórek, stale delikatnie mieszając
8. Inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 30°C przez 30 minutes
9. Delikatnie mieszać komórki co 15minutes
10. Uczulone SRBC można przechowywać przez noc w temperaturze 4°C

Analiza CH₅₀

1. Oznacz serię probówek w dwóch powtórzeniach jako 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 i 1:128.
2. Przygotuj serię dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych surowicy kontrolnej i badanej w VBS, każdą w dwóch powtórzeniach.
3. Zacznij od rozcieńczenia 1:4 (100ml surowicy + 300ml VBS) i przenieś 200ml próbki do kolejnej oznaczonej probówki.
4. Mieszaj dokładnie pomiędzy rozcieńczeniami i przenieś 200ml do kolejnego rozcieńczenia, używając nowej końcówki pipety.
5. Powtarzaj czynność, aż przygotowane zostaną wszystkie pięć rozcieńczeń.
6. Odrzuć 200ml z ostatniego rozcieńczenia 1:128.
7. Dodaj 200ml zawiesiny uczulonych SRBC do wszystkich probówek.
8. Oznacz dwie oddzielne probówki jako BLANK (próba ślepa) i dodaj 200ml uczulonych SRBC + 200ml VBS. Probówki te posłużą do pomiaru spontanicznej lizy SRBC w VBS.
9. Oznacz kolejne dwie oddzielne probówki jako TOTAL LYSIS (pełna liza) i dodaj 200ml uczulonych SRBC + 200ml wody destylowanej.
10. Delikatnie wymieszaj zawartość wszystkich probówek.
11. Inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 30 minut, mieszając po 15 minutach.
12. Odwiruj próbki przy 1,500g przez 5 minut, aby sedymentować RBC.
13. Przenieś 100ml supernatantu z każdej probówki do dołka w 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
14. Dodaj 100ml wody destylowanej do każdego dołka.
15. Odczytaj absorbancję próbek przy 540nm za pomocą spektrofotometru do płytek.

Obliczenia

1. Oblicz średnią absorbancję dla każdej próbki
2. Odejmij absorbancję PRÓBY ŚLEPEJ (lizy spontanicznej) od wszystkich próbek
3. Oblicz % lizy dla każdego rozcieńczenia, korzystając z poniższego wzoru:
   
4. Nanieś procent lizy (oś pionowa) w funkcji rozcieńczenia surowicy na osi poziomej.
5. Oblicz rozcieńczenie wymagane do uzyskania 50% hemolizy dla surowicy kontrolnej i badanej (Rys. 2).

Reprezentatywne wyniki:

Film zawiera przykład reprezentatywnych wyników. W praktyce, równolegle z serum testowym przeprowadza się analizę serum kontrolnego, poddając je takiej samej procedurze. Poniżej (Tabela 1) przedstawiono przykładowe dane z przebadanej próbki serum. Dane są przetwarzane zgodnie z równaniem przedstawionym w punkcie 5.3.

Próbka	OD540	Średnia
Puste pole	0.042, 0.044	0.043
Lizą całkowita	0.183, 0.183	0.183
Rozcieńczanie	OD540	Średnia	Średnia wartość tła	% lizy
1:8	0.200, 0.219	0.210	0.168	116
1:16	0.179, 0.173	0.176	0.134	93
1:32	0.134, 0.110	0.122	0.08	55
1:64	0.053, 0.066	0.059	0.017	12
1:128	0.044, 0.045	0.045	0.003	2

Rysunek 1. Aktywacja klasycznej drogi dopełniacza. Droga klasyczna jest aktywowana poprzez wiązanie immunoglobuliny M (IgM) lub immunoglobuliny G (IgG) na powierzchni komórki docelowej. Fragment Fc przeciwciała wiąże się z C1q, co aktywuje C1r, a ten z kolei aktywuje kolejną cząsteczkę C1r, które wspólnie aktywują dwie cząsteczki C1s. C1s rozszczepia następnie C4, co odsłania miejsce wiązania dla C2, który również zostaje rozszczepiony. Wiązanie C4b i C2a prowadzi do powstania kompleksu nazywanego konwertazą C3. Kompleks ten rozszczepia teraz C3, tworząc C3a i C3b, z których część łączy się z konwertazą C3, tworząc konwertazę C5. Kompleks ten oddziałuje teraz na C5, a powstałe C5b wiąże się z C6, inicjując tworzenie kompleksu atakującego błonę (MAC). C5b6 oddziałuje na C7, który z kolei oddziałuje na C8, a ostatecznie na C9, co prowadzi do powstania końcowego kompleksu MAC. (Goldsby et al, 2003).

Rysunek 2. Wykreślanie danych z próbek i obliczanie CH50 dla próbki surowicy kontrolnej i badawczej. (A) Wykreślono obliczony procent (%) lizy dla obu próbek surowicy: kontrolnej (•) i badawczej () w funkcji czynnika rozcieńczenia. (B) Aby obliczyć 50% lizy, z wartości 50% prowadzi się linię aż do przecięcia z liniami wykresu, a następnie prowadzi się linię pionową w dół do wartości rozcieńczenia. W tym przykładzie do osiągnięcia 50% lizy wymagane jest 35-krotne rozcieńczenie surowicy kontrolnej i 21,6-krotne rozcieńczenie surowicy badawczej. Dane te wskazują na mniejszą ilość dopełniacza w surowicy badawczej w porównaniu z kontrolną, ponieważ wymagane było mniejsze rozcieńczenie przed osiągnięciem 50% lizy. Próbka kontrolna wykazuje również > 100% lizy przy rozcieńczeniu 1:8. Jest to najprawdopodobniej spowodowane niepełną lizą SRBC przez wodę destylowaną i bardziej efektywną lizą wywołaną przez składniki dopełniacza.

Dyskusja

Analiza CH₅₀ jest podatna na wiele zakłóceń. Niektóre SRBC są bardziej kruche od innych, co prowadzi do spontanicznej hemolizy niezwiązanej z aktywnością dopełniacza. Powinowactwo przeciwciał króliczych różni się w zależności od serii i producenta, co wpływa na ilość przeciwciał wiążących się z SRBC. Ponadto proces uczulania SRBC przeciwciałami skutkuje powstaniem komórek z różną ilością przeciwciał pokrywających SRBC. Pobieranie i przechowywanie próbek stanowią istotne potencjalne źródło błędów. Składniki dop...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Owcze erytrocyty	CSL	2490201	Stosować w stężeniu końcowym 1%
Surowica			Surowica ludzka
Królicze serum anty-owcze hemolityczne (RBC), niekonjugowane	AbD Serotec	C12HSB
Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem	Sarstedt Ltd	83.1839
Saloina buforowana weronalem			Stosować w stężeniu końcowym 1x
Kąpiel wodna
Czytnik płytek
Pomieszczenie/inkubator o temperaturze 37°C