Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Światło pośredniczy w szeregu procesów rozwojowych i adaptacyjnych w całym cyklu życia rośliny. Rośliny wykorzystują absorbujące światło cząsteczki zwane fotoreceptorami, aby wykrywać światło i do niego adaptować. Fotoreceptory fitochromowe absorbujące światło czerwone i dalekie czerwone były szeroko badane. Fitochromy występują jako rodzina białek o odrębnych i nakładających się funkcjach we wszystkich badanych systemach roślin wyższych.1Reakcje na światło pośredniczone przez fitochromy, obejmujące procesy od kiełkowania nasion po kwitnienie i starzenie się, są często zlokalizowane w konkretnych tkankach lub organach roślinnych2Pomimo odkrycia i wyjaśnienia indywidualnych oraz redundantnych funkcji fitochromów za pomocą analiz mutacyjnych, doniesienia na temat odrębnych miejsc fotopercepcji oraz mechanizmów molekularnych zlokalizowanych pul fitochromów, które pośredniczą w przestrzennie specyficznych odpowiedziach fitochromowych, pozostają ograniczone. Zaprojektowaliśmy eksperymenty w oparciu o hipotezy, że specyficzne miejsca fotopercepcji fitochromów regulują tkankowe i organowe aspekty fotomorfogenezy, a zlokalizowane pule fitochromów angażują odrębne podzbiory genów docelowych w sygnalizacji międzykomórkowej. Opracowaliśmy podejście biochemiczne pozwalające na selektywne zmniejszenie ilości funkcjonalnych fitochromów w sposób specyficzny dla organu lub tkanki w roślinach transgenicznych. Nasze badania opierają się na dwuczęściowym podejściu typu „enhancer-trap”, które prowadzi do transaktywacji ekspresji genu pod kontrolą elementu Upstream Activation Sequence (UAS) przez aktywator transkrypcyjny GAL43biliverdyn reduktaza (BVRgen pod kontrolą UAS pozostaje w stanie wyciszenia w przypadku braku transaktywacji przez GAL4 w linii rodzicielskiej UAS-BVR4Krzyżówki genetyczne między linią transgeniczną UAS-BVR a linią pułapki enhancerowej GAL4-GFP prowadzą do specyficznej ekspresjiBVRgen w komórkach oznakowanych przezGFPekspresja4Akumulacja BVR w roślinach Arabidopsis prowadzi do niedoboru chromoforu fitochromuin planta5-7Zatem wytworzone przez nas rośliny transgeniczne wykazują zależną od GAL4 aktywacjęBVRgen, skutkujący biochemiczną inaktywacją fitochromu, a także zależne od GAL4GFPekspresja. Analizy fotobiologiczne i genetyczno-molekularneBVRlinie transgeniczne dostarczają wiedzy na temat specyficznych dla tkanek i organów odpowiedzi pośredniczonych przez fitochrom, które zostały powiązane z odpowiadającymi im miejscami fotopercepcji4, 7, 8Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) komórek GFP-dodatnich, indukowanych pułapką enhancerowąBVRWykorzystanie protoplastów roślinnych wykazujących ekspresję wraz z profilowaniem ekspresji genów specyficznych dla typu komórek za pomocą analizy mikromacierzy służy do identyfikacji domniemanych genów docelowych w szlakach sygnałowych pośredniczących w specyficznych przestrzennie odpowiedziach fitochromowych. Badania te rozszerzają naszą wiedzę na temat miejsc percepcji światła, mechanizmów, dzięki którym różne tkanki lub organy współpracują w regulowanym światłem wzroście i rozwoju roślin, oraz przyczyniają się do zaawansowanej analizy molekularnej złożonych kaskad sygnalizacji międzykomórkowej pośredniczonej przez fitCHROMY.
Protokół
1. Wzrost roślin
- Potwierdzoną linię pułapki enhancerowej UAS-BVR X GAL4-GFP, wyizolowaną zgodnie z opisem4 (podsumowanie przedstawiono na Ryc. 1), a także linie typu dzikiego lub linie rodzicielskie, wysiewa się do gleby, tj. ok. 2000 wysterylizowanych nasion na linię.
- Rośliny hoduje się przez 5 tygodni w glebie pod białym oświetleniem o natężeniu 100 μmolm-2s-1 w temperaturze 22 °C i przy 70% wilgotności.
2. Izolacja protoplastów liściowych (adaptowano z Denecke i Vitale9)
- Aby wyizolować protoplasty, należy przygotować bufor TEX. Na 1 litr buforu TEX odważyć następujące składniki: 3,1 g soli Gamborg's B5, 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES, 2,56 mM), 0,75 g dichlorku wapnia dwuwodnika (CaCl2.2H2O, 6,75 mM), 0,25 g azotanu amonu (NH4NO3, 3,12 mM) oraz 136,9 g sacharozy (0,4M). Składniki całkowicie rozpuścić w ok. 900 ml dejonizowanej wody destylowanej (ddH2O) i dostosować pH do 5,7 za pomocą 1 M KOH. Doprowadzić do końcowej objętości 1 litra i wysterylizować przez filtrację za pomocą filtra nakrętkowego 0,2 μm podłączonego do pompy próżniowej.
- Zebrać zielone, zdrowe liście z roślin (ok. 250 ml liści luźno upakowanych w zlewce) i przepłukać je ok. 40 ml ddH2O czterokrotnie, a następnie dwukrotnie płukać sterylną ddH2O. Za pomocą skalpela nr 20 pociąć liście na cienkie paski i podzielić tkankę równo do dwóch sterylnych probówek plastikowych o pojemności 50 ml. Przygotować 1-krotną mieszaninę do trawienia liści, dodając 5 ml alikwoty 10-krotnego roztworu zapasu do trawienia liści (10-krotny roztwór zapasu do trawienia liści: rozpuścić 2% w/v Macerozyme R-10 i 4% w/v Cellulase „Onozuka” R-10 w buforze TEX, wysterylizować przez filtr 0,2 μm i zamrozić alikwoty po 5 ml w temperaturze -80 °C) do 45 ml świeżego buforu TEX. Dodać ok. 25 ml 1-krotnej mieszaniny do trawienia liści do każdej probówki 50 ml, aby przykryć całą tkankę liściową.
- Tkaninę liściową w mieszaninie trawiącej poddać infiltracji próżniowej w otwartych probówkach przez 1 h w temperaturze pokojowej przy użyciu desksykatora próżniowego podłączonego do pompy wodnej, a następnie inkubować przez 3 h w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z łagodnym kołysaniem. Zakręcone probówki z tkanką liściową w 1-krotnej mieszaninie do trawienia liści należy przechowywać owinięte w folię aluminiową podczas tego procesu, aby zapobiec ekspozycji na światło.
- Po 3 godzinach zwiększyć prędkość wytrząsarki na ok. 2 minuty, aby uwolnić protoplasty. Surową zawiesinę protoplastów przefiltrować przez dwie warstwy sterylnej gazy w celu usunięcia zanieczyszczeń i zebrać filtrat do sterylnej zlewki szklanej. Filtrat przefiltrować przez sterylną siatkę nylonową 100 μm do sterylnej szalki Petriego. Zebrać przefiltrat i przenieść go do nowej sterylnej probówki 50 ml. Użyć około 15-20 ml świeżego buforu TEX do wypłukania sterylnej szalki Petriego i zebrania protoplastów przylegających do powierzchni.
- Przefiltrat wirować w wirówce z rotorem z koszyczkami przy 100xg w temperaturze 10 °C przez 15 min (przyspieszenie 6, hamowanie 0).
- Za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura 9" podłączonej do pompy perystaltycznej usunąć ok. 25-30 ml cieczy znajdującej się poniżej pływającej warstwy protoplastów, która zawiera resztki i osad zanieczyszczeń, nie naruszając warstwy protoplastów i pozostawiając objętość ok. 10-15 ml.
- Dodać świeży bufor TEX do końcowej objętości 40 ml, jednocześnie delikatnie resuspendując protoplasty.
- Powtórzyć kroki od 2.5 do 2.7 dwukrotnie, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń komórkowych. Czas wirowania należy skrócić do 10 minut w pierwszym powtórzeniu i do 5 minut w ostatnim powtórzeniu.
- Pływające protoplasty odessać za pomocą przyciętej, sterylnej pipety transferowej 1 ml do nowej probówki 15 ml. Przejść bezpośrednio do sortowania lub przechowywać w ciemności do 2 godzin w temperaturze 4 °C do czasu sortowania.
3. Sortowanie protoplastów za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)
- Przed sortowaniem należy zbadać protoplasty za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej (CLSM), używając lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia, aby potwierdzić integralność protoplastów oraz obecność fluorescencji GFP w puli protoplastów. Minimalna ilość zanieczyszczeń jest niezbędna, aby uniknąć zapchania dyszy sortownika FACS.
- Wyizolowane protoplasty w buforze TEX należy posortować metodą FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences), używając dyszy 200-μm na głowicy do sortowania makro przy szybkości zdarzeń od 6 000 do 15 000, z ciśnieniem systemowym około 9 p.s.i., zgodnie z adaptowanym protokołem10.
- Do wyznaczenia progów autofluorescencji wykorzystuje się protoplasty typu dzikiego pozbawione GFP.
- W celu zebrania protoplastów GFP-dodatnich należy sortować komórki przy użyciu chłodzonego powietrzem lasera argonowego (Spectra Physics Model 177, Newport Corporation, Irvine, CA) pracującego z mocą 100 mW na linii argonowej 488 nm, aby zidentyfikować fluorescencję GFP przy użyciu filtra pasmowoprzepustowego 530/30.
- Po zebraniu protoplastów GFP-dodatnich należy zbadać posortowane protoplasty za pomocą CLSM, zgodnie ze szczegółami opisanymi w kroku 3.1.
- Całkowite RNA z posortowanych protoplastów należy wyekstrahować za pomocą zestawu Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. Następnie można przygotować cDNA do hybrydyzacji zgodnie z opisem w Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manual, a następnie przeprowadzić hybrydyzację z macierzami całego genomu Arabidopsis AtH1 Affymetrix.
Reprezentatywne wyniki
Za pomocą FACS w kanale GFP wykryto znaczną liczbę komórek GFP-dodatnich (Rys. 2). W testach optymalizacyjnych z wykorzystaniem roślin rodzicielskich z pułapką wzmacniającą GFP, linia konstytutywnie wyrażająca GFP, J0571, wykazała od ~ 17% do 24% protoplastów GFP-dodatnich, natomiast linia z ekspresją naczyniową i dermalną, J1071, miała ~ 1,4% protoplastów GFP-dodatnich (Tabela 1). Sortowanie 3 x 500 μl (~ 1,5 ml całkowitej zawiesiny protoplastów) protoplastów J0571 przez 1 h pozwoliło na uzyskanie ~ 100 000 protoplastów GFP-dodatnich. Sortowanie 3 x 500 μl (~ 1,5 ml całkowitej zawiesiny protoplastów) protoplastów J1071 przez 1,5 h pozwoliło na uzyskanie ~ 3 000 protoplastów GFP-dodatnich. Obrazy konfokalne wskazały na bardzo wysoką wydajność otrzymywania protoplastów dla obu próbek, J0571 i J1071, przed przeprowadzeniem sortowania (Rys. 3C i 3E), a posortowane frakcje zawierały wyłącznie jasno fluorescencyjne w GFP protoplasty (Rys. 3G i dane niepokazane). Wynik ten potwierdza, że nienaruszone protoplasty GFP-dodatnie mogą być sortowane za pomocą FACS. Protoplasty niewyrażające GFP mogą być również sortowane i zbierane w osobnym kanale. Protoplasty nie-GFP służą jako idealna kontrola negatywna dla późniejszych analiz mikromacierzy w celu wykrycia specyficznych zmian w ekspresji genów po obniżeniu poziomu holofitochromu. Ekstrakcja RNA z izolowanych protoplastów (1 ml) zapewnia ilość RNA wystarczającą do detekcji metodą fluorospektrometrii (Rys. 4). Izolowane RNA oceniono przy użyciu urządzenia NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) i ilościowo określono za pomocą oprogramowania NanoDrop 3.7.1 RNA quantification software. Wydajność RNA z niesortowanych protoplastów typu dzikiego C24 lub posortowanych za pomocą FACS protoplastów GFP-dodatnich z pułapką wzmacniającą przekroczyła minimum 20 ng niezbędnych do zastosowania w testach znakowania RNA dla mikromacierzy (Tabela 2).
| Linia pułapki enhancerowej | % protoplastów wykazujących ekspresję GFP | Liczba posortowanych protoplastów GFP |
| J0571 | 17.18 % ~ 24.06 % | 26,400 ~ 36,000 |
| J1071 | ~ 1.43 % | 1,000 ~ 1,300 |
Tabela 1. Procent protoplastów pozytywnych pod kątem GFP z dwóch linii pułapek enhansera przed sortowaniem oraz liczba protoplastów pozytywnych pod kątem GFP zebranych poprzez przepuszczenie 500 μL zawiesiny protoplastów przez sorter komórek aktywowany fluorescencją (FACSVantage, BD).
| Linia roślinna | Wydajność RNA (ng) |
| C24 WT | 12486.5 |
| J0571 | 60 |
| J1071 | 71.5 |
Tabela 2. Wydajność izolacji RNA z protoplastów. RNA zostało wyizolowane z nieposortowanych protoplastów typu dzikiego C24 lub posortowanych protoplastów GFP-dodatnich z dwóch linii enhancer trap, a następnie poddane kwantyfikacji.
Rysunek 1. Indukcja ekspresji Biliverdin Reductase (BVR) oparta na pułapce enhancerowej GAL4 w transgenicznych roślinach Arabidopsis thaliana. (A). Linia wybrana z biblioteki linii pułapek enhancerowych opartych na GAL4, zawierających gen markerowy GFP reagujący na GAL4, może być krzyżowana z linią zawierającą gen docelowy reagujący na GAL4 w celu indukcji ekspresji genu docelowego w komórkach zawierających GAL4, znakowanych fluorescencją GFP. Na podstawie rysunku dr. Jima Haseloffa (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Produkcja chromoforu fitochromu, fitokromobiliny (PΦB) i holofitochromu w liniach rodzicielskich. (C) Po lewej: Redukcja biliverdyny IXα (BV IXα) i PΦB przez aktywność reduktazy biliverdyny (BVR) odpowiednio do BR i PΦR. Aktywność BVR prowadzi do wyczerpania PΦB i skutkuje zmniejszeniem produkcji fotoaktywnego holofitochromu. Po prawej: przedstawiono reakcję katalizowaną przez BVR.
Rycina 2. Wykresy kropkowe z akwizycji FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). Porównanie sortowania protoplastów dla typu dzikiego C24 (A), J0571 (B) oraz J1071 (C). (A) Wykres kropkowy z akwizycji protoplastów typu dzikiego C24 nie wykazujących fluorescencji GFP, pobudzonych laserem argonowym o długości fali 488 nm, użyty do wyznaczenia progu autofluorescencji. (B) i (C) Wykresy kropkowe z akwizycji pokazujące proporcje protoplastów wykazujących dodatni sygnał GFP w odpowiedzi na pobudzenie laserem 488 nm. Bramki sortowania R3 na wykresach B i C wyznaczają cele GFP-dodatnie, które zostały posortowane za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACSVantage, BD) i zebrane. Kanał czerwony wskazuje wartości autofluorescencji chlorofilu z protoplastów, a kanał zielony wskazuje wartości fluorescencji GFP.
Rycina 3. Mikroskopia konfokalna protoplastów roślinnych wykorzystanych do sortowania komórek. Obrazy z konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego protoplastów przed (A, C, E) i po (G) sortowaniu za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). B, D, F i H to obrazy DIC. Przedstawiono protoplasty typu dzikiego C24 (A, B), J1071 (C, D) oraz J0571 (E, F, G, H). Obrazy C, E i G są obrazami złożonymi fluorescencji GFP (BP 505 nm - 575 nm) i autofluorescencji (LP 650 nm) uzyskanych po wzbudzeniu laserem 488-nm. Panele od A do H stanowią średnią z 4 skanów przy użyciu obiektywu olejowego 63x. Pasek skali = 10 μm.
Rysunek 4. Ilościowe oznaczenie RNA wyizolowanego z protoplastów metodą fluorospektrometrii. RNA wyekstrahowane z (A) typu dzikiego C24, (B) J0571 oraz (C) J1071. A oznacza RNA z niesortowanych protoplastów typu dzikiego. B i C oznaczają RNA z protoplastów GFP-dodatnich wyselekcjonowanych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Oprogramowanie do kwantyfikacji RNA, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Profilowanie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy (1) wskazało, że ponad 30% genów w siewkach Arabidopsis jest regulowanych przez światło11, a także (2) pozwoliło zidentyfikować obszerną grupę genów kodujących białka transdukcji sygnałów świetlnych zaangażowane w kaskadę sygnalizacyjną fitochromów12, 13. Takie eksperymenty sugerują, że światło indukuje szybkie i długotrwałe zmiany w ekspresji genów. Każda pula fitochromów może kontrolować jedynie podzbiór odpowiedzi rozwojowych i adaptacyjnych. C...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Prace prowadzone w laboratorium Montgomery nad odpowiedziami fitochromowymi u roślin są wspierane przez National Science Foundation (grant nr MCB-0919100 dla B.L.M.) oraz Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, Departament Energii USA (grant nr DE FG02 91ER20021 dla B.L.M.). Dziękujemy Melissie Whitaker za pomoc techniczną podczas filmowania oraz krytyczne przeczytanie manuskryptu, Stephanie Costigan za pomoc eksperymentalną, dr. Louisa Kinga za pomoc w opracowaniu i optymalizacji protokołów sortowania protoplastów Arabidopsis metodą Fluorescence-Activated Cell Sorting oraz dr Melindzie Frame za pomoc w zakresie mikroskopii konfokalnej. Dziękujemy Marlene Cameron za pomoc w projektowaniu graficznym oraz Karen Bird za pomoc redakcyjną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało anty-BVR | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | |
| Celulaza “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis | MSPC 0930 | |
| Podstawowa mieszanina soli B5 Gamborg’a | Sigma-Aldrich | G5768 | |
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis | PTC 001 | |
| MES, o niskiej zawartości wody | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Sole Murashige i Skooga | Caisson Laboratories | 74904 | |
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | |
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
Bibliografia
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. agy, F, Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. hory, J, Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
