Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Podsumowanie

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Streszczenie

Światło pośredniczy w szeregu procesów rozwojowych i adaptacyjnych w całym cyklu życia rośliny. Rośliny wykorzystują absorbujące światło cząsteczki zwane fotoreceptorami, aby wykrywać światło i do niego adaptować. Fotoreceptory fitochromowe absorbujące światło czerwone i dalekie czerwone były szeroko badane. Fitochromy występują jako rodzina białek o odrębnych i nakładających się funkcjach we wszystkich badanych systemach roślin wyższych.¹Reakcje na światło pośredniczone przez fitochromy, obejmujące procesy od kiełkowania nasion po kwitnienie i starzenie się, są często zlokalizowane w konkretnych tkankach lub organach roślinnych²Pomimo odkrycia i wyjaśnienia indywidualnych oraz redundantnych funkcji fitochromów za pomocą analiz mutacyjnych, doniesienia na temat odrębnych miejsc fotopercepcji oraz mechanizmów molekularnych zlokalizowanych pul fitochromów, które pośredniczą w przestrzennie specyficznych odpowiedziach fitochromowych, pozostają ograniczone. Zaprojektowaliśmy eksperymenty w oparciu o hipotezy, że specyficzne miejsca fotopercepcji fitochromów regulują tkankowe i organowe aspekty fotomorfogenezy, a zlokalizowane pule fitochromów angażują odrębne podzbiory genów docelowych w sygnalizacji międzykomórkowej. Opracowaliśmy podejście biochemiczne pozwalające na selektywne zmniejszenie ilości funkcjonalnych fitochromów w sposób specyficzny dla organu lub tkanki w roślinach transgenicznych. Nasze badania opierają się na dwuczęściowym podejściu typu „enhancer-trap”, które prowadzi do transaktywacji ekspresji genu pod kontrolą elementu Upstream Activation Sequence (UAS) przez aktywator transkrypcyjny GAL4³biliverdyn reduktaza (BVRgen pod kontrolą UAS pozostaje w stanie wyciszenia w przypadku braku transaktywacji przez GAL4 w linii rodzicielskiej UAS-BVR⁴Krzyżówki genetyczne między linią transgeniczną UAS-BVR a linią pułapki enhancerowej GAL4-GFP prowadzą do specyficznej ekspresjiBVRgen w komórkach oznakowanych przezGFPekspresja⁴Akumulacja BVR w roślinach Arabidopsis prowadzi do niedoboru chromoforu fitochromuin planta^5-7Zatem wytworzone przez nas rośliny transgeniczne wykazują zależną od GAL4 aktywacjęBVRgen, skutkujący biochemiczną inaktywacją fitochromu, a także zależne od GAL4GFPekspresja. Analizy fotobiologiczne i genetyczno-molekularneBVRlinie transgeniczne dostarczają wiedzy na temat specyficznych dla tkanek i organów odpowiedzi pośredniczonych przez fitochrom, które zostały powiązane z odpowiadającymi im miejscami fotopercepcji^{4, 7, 8}Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) komórek GFP-dodatnich, indukowanych pułapką enhancerowąBVRWykorzystanie protoplastów roślinnych wykazujących ekspresję wraz z profilowaniem ekspresji genów specyficznych dla typu komórek za pomocą analizy mikromacierzy służy do identyfikacji domniemanych genów docelowych w szlakach sygnałowych pośredniczących w specyficznych przestrzennie odpowiedziach fitochromowych. Badania te rozszerzają naszą wiedzę na temat miejsc percepcji światła, mechanizmów, dzięki którym różne tkanki lub organy współpracują w regulowanym światłem wzroście i rozwoju roślin, oraz przyczyniają się do zaawansowanej analizy molekularnej złożonych kaskad sygnalizacji międzykomórkowej pośredniczonej przez fitCHROMY.

Protokół

1. Wzrost roślin

1. Potwierdzoną linię pułapki enhancera UAS-BVR X GAL4-GFP, wyizolowaną zgodnie z opisem⁴ (podsumowanie przedstawiono na Ryc. 1), a także linie dzikie lub rodzicielskie, wysiewa się do gleby, tj. ok. 2000 sterylnych nasion na każdą linię.
2. Rośliny hoduje się przez 5 tygodni w glebie pod białym oświetleniem o natężeniu 100 μmolm^-2s^-1 w temperaturze 22 °C i przy 70% wilgotności.

2. Izolacja protoplastów liściowych (na podstawie Denecke i Vitale⁹)

1. W celu izolacji protoplastów należy przygotować bufor TEX. Aby sporządzić 1 litr buforu TEX, odważ następujące składniki: 3,1 g soli Gamborg's B5, 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES, 2,56 mM), 0,75 g chlorku wapnia dwuwodnego (CaCl₂.2H₂O, 6,75 mM), 0,25 g azotanu amonu (NH₄NO₃, 3,12 mM) oraz 136,9 g sacharozy (0,4M). Składniki należy całkowicie rozpuścić w ok. 900 ml zdejonizowanej wody destylowanej (ddH₂O), a następnie dostosować pH do 5,7 za pomocą 1 M KOH. Doprowadzić objętość końcową do 1 litra i wysterylizować przez filtrację za pomocą filtra nakręcanego 0,2 μm podłączonego do pompy próżniowej.
2. Zebrać zielone, zdrowe liście z roślin (ok. 250 ml liści luźno upakowanych w zlewce) i wypłukać je ok. 4 razy w 40 ml ddH₂O, a następnie dwukrotnie wypłukać w sterylnej ddH₂O. Za pomocą skalpela nr 20 pociąć liście na cienkie paski i podzielić tkankę równo pomiędzy dwie sterylne plastikowe probówki o pojemności 50 ml. Przygotować 1x mieszaninę do trawienia liści, dodając 5 ml alikwoty 10x roztworu zapasu do trawienia liści (10x roztwór zapasu do trawienia liści: rozpuścić 2% w/v Macerozyme R-10 oraz 4% w/v Celulazy „Onozuka” R-10 w buforze TEX, wysterylizować przez filtr 0,2 μm i zamrozić alikwoty 5 ml w temperaturze -80 °C) do 45 ml świeżego buforu TEX. Dodać ok. 25 ml 1x mieszaniny do trawienia liści na każdą probówkę 50 ml, aby pokryć całą tkankę liściastą.
3. Przeprowadzić infiltrację próżniową tkanki liściowej w mieszaninie trawiącej w otwartych probówkach przez 1 h w temperaturze pokojowej, używając desykatora próżniowego podłączonego do pompy wodnej, a następnie inkubować przez 3 h w temperaturze pokojowej na wstrząsarce z delikatnym mieszaniem. Zakorkowane probówki z tkanką liściową w 1x mieszaninie do trawienia liści należy trzymać owinięte w folię aluminiową podczas tego procesu, aby zapobiec ekspozycji na światło.
4. Po 3 godzinach zwiększyć prędkość wstrząsania przez ok. 2 minuty, aby uwolnić protoplasty. Przefiltrować surową zawiesinę protoplastów przez dwie warstwy sterylnej gazy, aby usunąć zanieczyszczenia, i zebrać filtrat do sterylnej szklanej zlewki. Przefiltrować filtrat przez sterylną siatkę nylonową o oczkach 100 μm do sterylnej płytki Petriego. Zebrać przelew i przenieść go do nowej sterylnej probówki 50 ml. Użyć około 15-20 ml świeżego buforu TEX do przemycia sterylnej płytki Petriego i zebrania wszystkich protoplastów przylegających do powierzchni.
5. Odwirować przelew za pomocą rotora z koszykami przy 100xg w temperaturze 10 °C przez 15 min (przyspieszenie 6, hamowanie 0).
6. Usunąć ok. 25 - 30 ml cieczy znajdującej się poniżej pływającej warstwy protoplastów, która zawiera resztkowe zanieczyszczenia i osad, używając sterylnej 9-calowej szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy perystaltycznej, nie naruszając pływającej warstwy protoplastów i pozostawiając objętość ok. 10 - 15 ml.
7. Dodać świeży bufor TEX do końcowej objętości 40 ml, delikatnie resuspendując protoplasty.
8. Powtórzyć kroki od 2.5 do 2.7 dwukrotnie, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń komórkowych. Czas wirowania należy skrócić do 10 minut podczas pierwszego powtórzenia oraz do 5 minut podczas ostatniego powtórzenia.
9. Odpisać pływające protoplasty za pomocą przyciętej, sterylnej pipety transferowej 1 ml do nowej probówki 15 ml. Przejść bezpośrednio do sortowania lub przechowywać w ciemności do 2 godzin w temperaturze 4 °C do czasu sortowania.

3. Sortowanie protoplastów za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

1. Przed sortowaniem należy zbadać protoplasty za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM), używając lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia, aby potwierdzić integralność protoplastów oraz obecność fluorescencji GFP w puli protoplastów. Niezbędne jest zminimalizowanie ilości zanieczyszczeń, aby uniknąć zapchania dyszy sortującej FACS.
2. Odizolowane protoplasty w buforze TEX należy posortować za pomocą FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences), używając dyszy 200-μm na głowicy do makrosortowania, przy szybkości zdarzeń od 6 000 do 15 000 i ciśnieniu systemu około 9 p.s.i., zgodnie z zaadaptowanym protokołem¹⁰.
3. Do wyznaczenia progów autofluorescencji wykorzystuje się protoplasty typu dzikiego niewykazujące GFP.
4. W celu zebrania protoplastów GFP-dodatnich, należy sortować komórki przy użyciu chłodzonego powietrzem lasera argonowego (Spectra Physics Model 177, Newport Corporation, Irvine, CA) pracującego z mocą 100 mW na linii argonowej 488 nm, aby zidentyfikować fluorescencję GFP przy użyciu filtra przepustowego 530/30.
5. Po zebraniu protoplastów GFP-dodatnich należy zbadać posortowane protoplasty za pomocą CLSM, zgodnie z opisem w kroku 3.1.
6. Całkowite RNA z posortowanych protoplastów należy wyekstrahować przy użyciu zestawu Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. Następnie można przygotować cDNA do hybrydyzacji, zgodnie z opisem w instrukcji Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manual, a następnie przeprowadzić hybrydyzację z macierzami całego genomu Arabidopsis AtH1 firmy Affymetrix.

Reprezentatywne wyniki

Za pomocą metody FACS wykryliśmy znaczną liczbę komórek GFP-dodatnich w kanale GFP (Rys. 2). W testach optymalizacyjnych z wykorzystaniem linii rodzicielskich typu enhancer-trap dla GFP, linia J0571 o konstytutywnej ekspresji GFP wykazała od ~ 17% do 24% protoplastów GFP-dodatnich, natomiast linia J1071 z ekspresją w tkankach naczyniowych i skórnych miała ~ 1,4% protoplastów GFP-dodatnich (Tabela 1). Sortowanie 3 x 500 μl (~ 1,5 ml całkowitej zawiesiny protoplastów) linii J0571 przez 1 h pozwoliło uzyskać ~ 100 000 protoplastów GFP-dodatnich. Sortowanie 3 x 500 μl (~ 1,5 ml całkowitej zawiesiny protoplastów) linii J1071 przez 1,5 h pozwoliło uzyskać ~ 3 000 protoplastów GFP-dodatnich. Obrazy konfokalne wskazały na bardzo wysoką wydajność otrzymywania protoplastów dla obu próbek, J0571 i J1071, przed przeprowadzeniem sortowania (Rys. 3C i 3E), a posortowane frakcje zawierały wyłącznie jasno fluorescencyjne pod względem GFP protoplasty (Rys. 3G oraz dane niepokazane). Wynik ten potwierdza, że nienaruszone protoplasty GFP-dodatnie można sortować za pomocą FACS. Protoplasty nie-GFP mogą być również sortowane i zbierane w osobnym kanale. Protoplasty nie-GFP służą jako idealna kontrola negatywna dla późniejszych analiz mikromacierzy w celu wykrycia specyficznych zmian w ekspresji genów po obniżeniu poziomu holofitochromu. Ekstrakcja RNA z wyizolowanych protoplastów (1 ml) pozwala uzyskać RNA w ilości wystarczającej do detekcji metodą fluorospektrometrii (Rys. 4). Wyizolowane RNA oceniono za pomocą urządzenia NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) i ilościowo określono przy użyciu oprogramowania do kwantyfikacji RNA NanoDrop 3.7.1. Wydajność RNA z niesortowanych protoplastów typu dzikiego C24 lub posortowanych metodą FACS protoplastów typu enhancer trap GFP-dodatnich przekroczyła minimum 20 ng wymagane do zastosowania w testach znakowania RNA dla mikromacierzy (Tabela 2).

Linia pułapki enhancerów	% protoplastów wykazujących ekspresję GFP	Liczba posortowanych protoplastów GFP
J0571	17.18 % ~ 24.06 %	26,400 ~ 36,000
J1071	~ 1.43 %	1,000 ~ 1,300

Tabela 1. Procent protoplastów GFP-dodatnich z dwóch linii pułapki wzmacniacza przed sortowaniem oraz liczba zebranych protoplastów GFP-dodatnich po przepuszczeniu 500 μL zawiesiny protoplastów przez sorter komórek aktywowany fluorescencją (FACSVantage, BD).

Linia rośliny	Wydajność RNA (ng)
C24 WT	12486.5
J0571	60
J1071	71.5

Tabela 2. Wydajność izolacji RNA z protoplastów. RNA wyizolowano z wcześniej posortowanych protoplastów typu dzikiego C24 lub posortowanych protoplastów GFP-dodatnich z dwóch linii pułapki wzmacniacza (enhancer trap), a następnie określono jego ilość.

Rycina 1. Indukcja ekspresji Biliverdin Reductase (BVR) oparta na pułapce wzmacniacza GAL4 w transgenicznych roślinach Arabidopsis thaliana. (A). Pojedynczą roślinę wybraną z biblioteki linii pułapek wzmacniacza opartych na GAL4, zawierających gen markerowy GFP reagujący na GAL4, można skrzyżować z linią zawierającą gen docelowy reagujący na GAL4, aby zindukować ekspresję genu docelowego w komórkach zawierających GAL4, znakowanych fluorescencją GFP. Na podstawie ryciny dr Jima Haseloffa (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Produkcja chromoforu fitochromu, fitochromobiliny (PΦB) oraz holofitochromu w liniach rodzicielskich. (C) Po lewej: redukcja biliverdyny IXα (BV IXα) i PΦB przez aktywność reduktazy biliverdyny (BVR) odpowiednio do BR i PΦR. Aktywność BVR skutkuje wyczerpaniem PΦB i prowadzi do zmniejszenia produkcji fotoaktywnego holofitochromu. Po prawej: przedstawiono reakcję katalizowaną przez BVR.

Rysunek 2. Wykresy kropkowe z akwizycji FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją). Porównanie sortowania protoplastów dla typu dzikiego C24 (A), J0571 (B) i J1071 (C). (A) Wykres kropkowy akwizycji protoplastów typu dzikiego C24 nie wykazujących fluorescencji GFP, wzbudzonych laserem argonowym o długości fali 488 nm i wykorzystanych do wyznaczenia progu autofluorescencji. (B) i (C) Wykresy kropkowe akwizycji pokazujące proporcje protoplastów wykazujących pozytywną fluorescencję GFP w odpowiedzi na wzbudzenie laserem 488 nm. Bramki sortowania R3 w panelach B i C wyznaczają cele GFP-pozytywne, które zostały posortowane za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACSVantage, BD) i zebrane. Kanał czerwony wskazuje wartości autofluorescencji chlorofilu z protoplastów, a kanał zielony wskazuje wartości fluorescencji GFP.

Rysunek 3. Mikroskopia konfokalna protoplastów roślinnych wykorzystanych do sortowania komórek. Obrazy z konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego protoplastów przed (A, C, E) i po (G) sortowaniu za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). B, D, F i H to obrazy DIC. Przedstawiono protoplasty typu dzikiego C24 (A, B), J1071 (C, D) oraz J0571 (E, F, G, H). Obrazy C, E i G są obrazami scalonymi z fluorescencji GFP (BP 505 nm - 575 nm) oraz autofluorescencji (LP 650 nm) uzyskanych przy wzbudzeniu laserem o długości fali 488 nm. Zdjęcia od A do H stanowią średnią z 4 skanów przy użyciu obiektywu olejowego 63x. Pasek skali = 10 μm.

Rycina 4. Ilościowe oznaczenie RNA wyizolowanego z protoplastów metodą fluorospektrometrii. RNA wyekstrahowane z (A) typu dzikiego C24, (B) J0571 oraz (C) J1071. Litera A oznacza RNA z nieposortowanych protoplastów typu dzikiego. Litery B i C oznaczają RNA z protoplastów GFP-dodatnich posortowanych za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Oprogramowanie do ilościowego oznaczania RNA, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

Dyskusja

Profilowanie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy (1) wskazało, że ponad 30% genów w siewkach Arabidopsis jest regulowanych przez światło¹¹, a także (2) pozwoliło zidentyfikować obszerną grupę genów kodujących białka transdukcji sygnałów świetlnych zaangażowane w kaskadę sygnalizacyjną fitochromów^{12, 13}. Takie eksperymenty sugerują, że światło indukuje szybkie i długotrwałe zmiany w ekspresji genów. Każda pula fitochromów może kontrolować jedynie podzbiór odpowiedzi rozwojowych i adaptacyjnych. C...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-BVR	QED Bioscience Inc.	56257-100
Celulaza “Onozuka” R-10	SERVA Electrophoresis	MSPC 0930
Podstawowa mieszanina soli B5 Gamborg’a	Sigma-Aldrich	G5768
Macerozyme R-10	SERVA Electrophoresis	PTC 001
MES, o niskiej zawartości wody	Sigma-Aldrich	M3671
Sole Murashige i Skooga	Caisson Laboratories	74904
Phytablend	Caisson Laboratories	28302
RNeasy Plant Minikit	Qiagen	16419