Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.
Artykuł metodologiczny
Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym filmie prezentujemy technikę mikroiniekcji do embrionów medaki w stadium jednokomórkowym. Medaka to mała, słodkowodna ryba składająca jaja, która umożliwia prowadzenie analiz genetycznych i embriologicznych i jest jednym z organizmów modelowych kręgowców, w których przeprowadzono badania przesiewowe mutantów w skali całego genomu w oparciu o fenotyp 1, podobnie jak u danio pręgowanego oraz myszy. Różnice w nakładaniu się funkcji pokrewnych genów u medaki i danio pręgowanego pozwalają na identyfikację nowych fenotypów, których nie można wykryć u jednego gatunku 2, dzięki czemu medaka i danio pręgowany są komplementarne w badaniach genetycznych funkcji genomu kręgowców.
Aby wykorzystać fakt, że embriony ryb medaka są przezroczyste i rozwijają się zewnętrznie, mikroiniekcja stanowi niezbędną technikę do wprowadzania znaczników komórkowych w celu etykietowania komórek, mRNA lub oligonukleotydów antysensownych w celu nadekspresji i wyciszania interesujących genów, a także DNA w celu tworzenia linii transgenicznych.
Protokół
1. Kojarzenie i zbieranie jaj
- Samicie i samce medaka można łatwo rozróżnić po rozmiarze i kształcie płetw odbytniczych oraz grzbietowych. Płetwy odbytnicze u samców są większe i mają kształt równoległoboku w porównaniu do płetw u samic. Płetwa odbytnicza samicy jest mniejsza i ma kształt trójkąta. Płetwa grzbietowa samca posiada wyraźnie widoczną głęboką wcięcie między dwoma ostatnimi promieniami.
- Medaka składają do 40 jaj każdego dnia; samice noszą jaja zgrupowane przy brzuchu za pomocą nici przylepnych przez kilka godzin, zanim zostaną one przyczepione do roślin w zbiorniku.
- Samicą można złapać w siatkę i delikatnie przytrzymać z obu stron jedną ręką. Następnie, palcem wskazującym drugiej ręki, można delikatnie oddzielić jaja od brzucha. Samicę można wówczas zwrócić do zbiornika. Jaja należy przenieść do szalki Petriego o średnicy 6 cm wypełnionej pożywką dla embrionów za pomocą pęsety tępej lub palca.
- Pary medaka rzadko walczą, gdy są trzymane w małym pojemniku do rozrodu. Dzięki temu mogą przebywać w jednym małym zbiorniku z przepływem wody, co umożliwia ich karmienie oraz codzienne zbieranie jaj od tej samej pary przez kilka miesięcy.
- Ważne jest, aby nie trzymać samic bez samców, ponieważ u samic medaka owulacja zachodzi codziennie. W przeciwnym razie samice nie mogą złożyć jaj i zapadają na choroby.
2. Oczyszczanie embrionów
- Przenieś niezgrupowane jaja za pomocą szklanej pipety na papier ścierny (gradacja p2000, wodoodporny) umieszczony w pokrywce płytki Petriego o średnicy 9 cm. Usuń nadmiar medium, upewniając się jednocześnie, że pozostała wystarczająca objętość, aby zapobiec wysuszeniu embrionów.
- Delikatnie tocz embriony po papierze ściernym za pomocą palca wskazującego, wywierając minimalny nacisk i trzymając palec równolegle do powierzchni papieru ściernego przez około 45-60 sekund, aby usunąć część włosków z zewnętrznej powierzchni chorionu. Nie tocz więcej niż 5-7 embrionów jednocześnie — ta ostrożność zminimalizuje ryzyko zmiażdżenia embrionów pod sobą.
- Przenieś oczyszczone embriony do nowej płytki z medium do embrionów.
3. Przygotowanie płytek agarozowych do unieruchomienia embrionów podczas mikroinkiekcji
Zarodki podczas iniekcji są utrzymywane w rynienkach wykonanych z formy z pleksiglasu w 1,5% agarozie (Rysunek 1). Stężenie agarozy jest kluczowe dla właściwego unieruchomienia zarodków.
- Najpierw należy przygotować ramkę z agarozy do utrzymania formy z pleksiglasu. Wlej 1,5% agarozę w wodzie do głębokości 0,5 cm do szalki Petriego o średnicy 9 cm i poczekaj, aż całkowicie stężeje. Wytnij w agarozie obszar nieco większy niż rozmiar formy.
- Wlej 1,5% agarozę, aby wypełnić wycięty obszar, a następnie umieść w niej formę w taki sposób, aby nie uwięziono pęcherzyków powietrza, i poczekaj, aż agaroza stężeje. Taka płytka agarozowa może być przechowywana w lodówce w celu przyspieszenia procesu stygnięcia.
- Usuń formę, aby stworzyć wgłębienia do utrzymania jaj. Dodaj wystarczającą ilość medium dla embrionów, aby zanurzyć formę, przykryj i przechowuj w temperaturze 4°C do momentu użycia.
Rysunek 1. Schemat wykonanej na zamówienie formy używanej do przygotowania wgłębień w płytkach agarozowych do mikroiniekcji.
4. Mikroiniekcja embrionów medaka
W przypadku medaki DNA, RNA, oligonukleotydy morfolinowe oraz barwniki śledzące są wstrzykiwane za pomocą mikroiniekcji przez chorion do cytoplazmy zarodka w stadium od 1 do 64 komórek, a nie do żółtka, jak ma to miejsce u danio pręgowanego. Ponieważ cytoplazma u medaki jest mniejsza i mniej widoczna, w celu opanowania tej techniki zaleca się ćwiczenia poprzez wstrzykiwanie barwników, takich jak rodamanina-dekstran. Zaleca się również dodanie czerwieni fenolowej jako znacznika, aby umożliwić potwierdzenie wykonania iniekcji.
Ponieważ chorion otaczający embriony medaki jest twardy, wymagana jest krótka, mocna i szeroka igła do iniekcji (Rysunek 2). Należy przygotować taką mocną i szeroką igłę do iniekcji z kapilary szklanej zawierającej włókno.
- Przygotować roztwór do iniekcji z czerwienią fenolową jako znacznikiem i załadować go do igły od tyłu za pomocą mikroładarki Eppendorf. Podłączyć igłę do wstrzykiwacza z pompką powietrzną.
- Jaja należy zebrać i rozdzielić jak najszybciej po zapłodnieniu, aby przeprowadzić iniekcję w stadium jednej komórki. Można zainiekować więcej embrionów, przechowując je na lodzie (nie dłużej niż 30 minut), aby zatrzymać podziały komórkowe.
Rysunek 2. Porównanie igieł do medaki i danio pręgowanego. Należy zauważyć, że końcówka igły MF (na górze) jest krótsza i szersza, a zatem mocniejsza, co ułatwia przebicie twardego chorionu otaczającego embriony medaki. - Przenieść jaja na płytkę z agarozą i ułożyć je w rowkach za pomocą pęsety. Tuż przed iniekcją pięć jaj należy obrócić tak, aby igła mogła uderzyć prostopadle w błonę komórkową cytoplazmy jednej komórki. Cytoplazmę jednej komórki można zidentyfikować, szukając obszaru pozbawionego małych kropelek tłuszczu, który znajduje się po przeciwnej stronie jaja niż miejsce z największym zagęszczeniem kropelek tłuszczu. Zidentyfikowany obszar można potwierdzić jako cytoplazmę, oglądając go z boku.
- Umieścić igłę blisko jaj. Otworzyć końcówkę igły, delikatnie dotykając jej chorionu lub używając mikropęsety (Rysunek 3). Powinien być widoczny wypływ niewielkiej ilości substancji do iniekcji.
- Przebić chorion, aby umieścić końcówkę igły w jego wnętrzu. Ustawić ciśnienie podtrzymujące wstrzykiwacza na stosunkowo wysoką wartość, aby zapobiec refluksowi wynikającemu z wysokiego ciśnienia podczas przebijania twardego chorionu (ustawienia 80-100hPA dla ciśnienia podtrzymującego i 500-700hPA dla ciśnienia iniekcji).
- Wprowadzić końcówkę igły do cytoplazmy, gwałtownie przebijając jej błonę.
Unikać wprowadzania końcówki igły do żółtka. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, materiał wstrzyknięty do żółtka nie zostanie przeniesiony do cytoplazmy. Płyny wstrzyknięte do żółtka mają wyraźną granicę, natomiast w cytoplazmie granica ta jest rozmyta (Rysunek 4).
Sporadycznie igła może zostać zablokowana przez agarozę lub zanieczyszczenia. Można użyć pęsety, aby dotknąć/ponownie rozbić koniec igły i usunąć blokadę. Jeśli igła pęknie w dowolnym momencie podczas iniekcji, w medium dla embrionów pojawią się pęcherzyki powietrza, a wstrzykiwana substancja zostanie utracona. Iniekcje należy przeprowadzać systematycznie od góry do dołu wzdłuż kanałów agarozy oraz od lewej do prawej strony formy. - Zainiekowane embriony należy przenieść do czystej szalki zawierającej medium dla embrionów i inkubować w odpowiedniej temperaturze.
Rysunek 3. Rozbijanie końcówki igły przed iniekcją. 1: Przesunięcie końcówki igły blisko chorionu embrionu; 2: Dotknięcie chorionu i delikatne poruszanie igłą w przód i w tył w celu rozbicia końcówki; 3: Wypływ niewielkiej ilości substancji do iniekcji z końca igły potwierdza rozbicie końcówki.
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 4. Reprezentatywne obrazy iniekcji zarodków medaki. Panel A przedstawia reprezentatywny obraz prawidłowej iniekcji rhodamine-dextranu do cytoplazmy zarodka medaki w stadium jednego komórki. Panel B przedstawia reprezentatywny obraz nieprawidłowej iniekcji rhodamine-dextranu do pęcherzyka żółtkowego zarodka medaki w stadium jednej komórki. Panele C i D przedstawiają zarodki z paneli A i B odpowiednio około 30 godzin po iniekcji. EM: zarodek; w panelach C i D góra to część przednia, widok od strony grzbietowej. Należy zauważyć, że ciało zarodka w panelu D nie jest czerwone, ponieważ barwnik został nieprawidłowo wstrzyknięty do pęcherzyka żółtkowego. Strzałki w panelach B i D wskazują rhodamine-dextran wstrzyknięty nieprawidłowo do pęcherzyka żółtkowego – zwróć uwagę na wyraźną kolistą granicę. Linie przerywane w panelach A i B wskazują obrys cytoplazmy w stadium jednej komórki, widok z boku.
Dyskusja
W tym filmie prezentujemy metodę wstrzykiwania markerów komórkowych, mRNA, DNA lub oligonukleotydów antysensownych do embrionów medaki w stadium jednego komórki. Technika ta pozwoliła nam badać różne procesy rozwojowe in-vivo w czasie rzeczywistym. Proces ten oraz umożliwiana przez niego szczegółowa analiza mają potencjał do znaczącego pogłębienia naszej wiedzy na temat organogenezy kręgowców i leżącej u jej podstaw biologii komórki. Wiedza ta może być istotna i przynieść zastosowania terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant z MRC.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Siatka o gęstym splotcie 4" | Narzędzia | J K Aquatics Ltd. | MD001 | Używana do odłowu ryb podczas pozyskiwania ikry. |
| Pożywka dla embrionów | Odczynnik | Własny wyrób | 200ml 50X roztwór zapasowy, 1ml 1% błękitu metylenowego w H2O/10 litrów wody RO (roztwór zapasowy 50X: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litr wody RO). | |
| Drobnoziarnisty wodoodporny papier ścierny - gradacja p2000 | Narzędzia | Hermes Abrasives Ltd. | Bardzo drobna gradacja do rolowania/czyszczenia embrionów z chorionami. | |
| Kapilary z borokrzemianowego szkła | Narzędzie | Harvard Apparatus | GC100-10F | Do wytwarzania igieł do mikroiniekcji. |
| Wytwornica mikropipet (puller) | Urządzenie | Narishige International | Model PP-830 | Do wytwarzania igieł do mikroiniekcji. |
| Mikronapełniacz Eppendorf | Narzędzie | Eppendorf | 5242956.003 | Do napełniania igieł do mikroiniekcji. |
| Aparat do mikroiniekcji | Urządzenie | Eppendorf | Model 5242. | |
| Mikromanipulator | Urządzenie | Narishige International | Model MN151. | |
| Agarozowa płytka do iniekcji | Narzędzia | Własny wyrób | Do unieruchamiania embrionów podczas iniekcji. |
Bibliografia
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).
Przedruki i uprawnienia
