Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

Podsumowanie

W niniejszym filmie prezentujemy izolację blastocyst myszy oraz wyprowadzenie komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Opisujemy również warunki utrzymania właściwości macierzystych komórek, a także indukcję ich różnicowania w hodowli.

Streszczenie

Specyfikacja trofektodermy jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń różnicowania w rozwoju ssaków. Linia trofoblastyczna pochodząca z trofektodermy pośredniczy w implantacji i generuje płodową część łożyska. W związku z tym rozwój tej linii jest niezbędny dla przeżycia zarodka. Izolacja komórek macierzystych trofoblastu (TS) z blastocyst myszy została po raz pierwszy opisana przez Tanakęet al.1998. Zdolność komórek TS do zachowania właściwości specyficznych dla trofoblastu oraz ekspresja markerów specyficznych dla stadium i typu komórek po odpowiedniej stymulacji stanowi cenny system modelowy do badania rozwoju linii trofoblastycznej poprzez odtworzenie wczesnych zdarzeń placentacji. Co więcej, komórki trofoblastu są jednym z niewielu typów komórek somatycznych podlegających naturalnej amplifikacji genomu. Chociaż molekularne ścieżki leżące u podstaw poliploidyzacji trofoblastu zaczynają być odkrywane, rola fizjologiczna i korzyść płynąca z amplifikacji genomu trofoblastu pozostają w dużej mierze nieznane. Rozwój diploidalnych komórek macierzystych w poliploidalne komórki trofoblastu w hodowli sprawia, że tenex vivosystem stanowi doskonałe narzędzie do wyjaśniania mechanizmów regulacyjnych replikacji genomu i niestabilności w zdrowiu i chorobie. W niniejszej pracy opisujemy protokół oparty na wcześniejszych doniesieniach, z modyfikacjami opublikowanymi przez Chiuet al.2008.

Protokół

W niniejszym protokole opisujemy przygotowanie blastocyst myszy oraz ustanowienie linii komórek TS. Ogólne manipulacje z myszami przed pobraniem blastocyst, w tym przygotowanie do kojenia naturalnego i indukcję superowulacji, opierają się w zasadzie na standardowym protokole opisanym przez Nagy et al. 203 (str. 146-150).

Wytwarzanie i utrzymanie komórek TS

1. Przygotuj krzyżówkę hodowlana wybranych myszy.
2. Przygotuj embrionalne fibroblasty mysie (MEF) jako komórki odżywcze. Na dwa dni przed pobraniem blastocyst, MEF (2 x 10⁶ komórek) wysiewamy do szalek 10 mm. Następnego dnia komórki te traktujemy 10 ml pożywki TS zawierającej mitomycynę C (20 mg/ml) podczas 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C, 5% CO₂. Następnie komórki płuczemy dwukrotnie roztworem PBS. Komórki potraktowane mitomycyną C wysiewamy do płytek 12-dołkowych (1 x 10⁵ komórek/dołek).
3. W dniu pobierania blastocyst (3,5 dpc, określonym jako dzień pierwszy), pożywkę hodowlaną MEF zastępujemy pożywką TS z dodatkiem 1x FGF4/Heparin (0,5 ml/dołek).
4. Przygotowanie do pobrania macicy: uśmierć mysz i zlokalizuj macicę (Rysunek 1A).
5. Usuń macicę, chwytając ją pęsetą w obrębie szyjki (znajdującej się za pęcherzem moczowym) i przetnij w miejscu połączenia macicy z szyjką (Rysunek 1B). Wyciągnij macicę, odetnij błony oraz tkanki tłuszczowe i przetnij macicę poniżej miejsca połączenia z jajowodem (Rysunek 1C). Umieść macice (Rysunek 1D) w niewielkiej objętości (0,2 ml) pożywki TS w szalce 60 mm.
6. Wypłucz każdy róg macicy 1 ml pożywki TS, używając strzykawki 1-ml z igłą 26G. Wprowadź igłę do podstawy macicy i powoli wypłukuj zawartość do nowej szalki 60 mm z 1 ml pożywki TS. Podczas płukania macica powinna być w pełni nadmuchana i rozciągnięta.
7. Ostrożnie zbierz i przenieś blastocysty do czystej płytki 12-dołkowej zawierającej pożywkę TS, używając pipety ustnej. Płucz blastocysty trzykrotnie poprzez seryjne przenoszenie w pożywce TS w płytkach 12-dołkowych. Umieść jedną blastocystę na dołek (Rysunek 2A) w płytce 12-dołkowej zawierającej odżywcze MEF potraktowane mitomycyną C i inkubuj w temperaturze 37°C, 5% CO₂.
8. Blastocysty wyjdą z błony przejrzystej (zona pellucida) i przywrą do dołków w ciągu 24 do 36 godzin. Mały przyrost będzie łatwo widoczny w 3. dniu. Dokarmiaj hodowle 50 μl świeżej pożywki TS z dodatkiem 1x FGF4/Heparin.
9. W 4. lub 5. dniu przyrost blastocysty powinien być gotowy do dysagregacji, zależnie od jego wielkości. Idealny rozmiar do dysagregacji komórek TS przedstawiono na Rysunku 3B. Płucz hodowle raz 0,5 ml PBS. Dodaj 100 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37°C, 5% CO₂. Rozbij przyrost na małe skupki, energicznie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P10. Przerwij trypsynizację, dodając dołka TS-70CM-1.5F4H (30% pożywki TS, 70% MEF-CM plus 1,5x FGF4/Heparin). Wymień pożywkę 8 godzin po dysagregacji i kontynuuj dokarmianie komórek co 2 dni.
10. Między 6. a 10. dniem (zależnie od przypadku) można zaobserwować kolonie komórek TS. Mają one płaską morfologię przypominającą arkusz nabłonkowy z wyraźną granicą kolonii (Rysunek 2C). Kontynuuj dokarmianie hodowli co 2 dni.
11. Gdy komórki TS osiągną 50% konfluencji (zazwyczaj między 15. a 20. dniem), wypłucz je raz roztworem PBS i dodaj 10 ml 0,25% trypsyny/EDTA. Podczas trypsynizacji pipetuj w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę bliską pojedynczym komórkom. Przerwij trypsynizację, dodając TS-70CM-1.5F4H i przenieś komórki do nowych płytek 6-dołkowych lub szalek 60 mm zawierających odżywcze MEF potraktowane mitomycyną C (2,5 x 10⁵ komórek/dołek 6-dołkowy lub 5 x 10⁵ komórek/szalka 60 mm).
12. Wymień pożywkę 8 godzin po pasażowaniu i kontynuuj dokarmianie hodowli co 2 dni.
13. Po jednym lub dwóch kolejnych pasażach (odstęp 3-5 dni między pasażami) na odżywczych MEF, komórki TS można hodować bez nich. Ponieważ MEF przywierają do płytki hodowlanej znacznie szybciej niż komórki TS po trypsynizacji, różnicę w szybkości adhezji można wykorzystać do oddzielenia komórek TS odżywczych MEF. Po pasażowaniu hodowlanych komórek inkubuj je w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 30 min. Większość MEF przywrze do płytki, a populacja TS pozostanie w zawiesinie. Przenieś supernatant do nowej płytki. Powtarzaj ten proces przez kilka pasaży, aby uzyskać czystą populację TS.
14. Utrzymuj komórki TS w pożywce TS-70CM-1.5F4H i pasażuj je co 4 dni (rozcieńczenie 1:10 do 1:20) lub gdy hodowla osiągnie 70% konfluencji. Pasażowanie komórek przy wysokiej gęstości (wyższej niż rozcieńczenie 1:5) lub hodowanie ich przy zbyt wysokiej konfluencji może spowodować ich różnicowanie.
15. Tożsamość komórek TS można potwierdzić poprzez immunostaining markera komórkowego Cdx2 (Rysunek 3).

Mrożenie komórek TS

1. Przygotować 2x medium do mrożenia (50% FBS, 30% medium TS i 20% DMSO).
2. Zebrać komórki TS poprzez trypsynizację, a następnie odwirować przy 450g przez 6 min. Resuspendować je w medium TS z równą objętością 2x medium do mrożenia.
3. Mrozić komórki powoli, używając komory z alkoholem izopropylowym w temperaturze -70°C, a po 24-48 godzinach przenieść do ciekłego azotu.
4. Zazwyczaj płytkę 60 mm (z 70% konfluencją) przechowuje się w 2 fiolkach.

Rozmrażanie komórek TS

1. Szybko rozmrozić fiolkę w temperaturze 37°C, zebrać komórki w 10 ml pożywki TS poprzez wirowanie (450g, 6 min), a następnie resuspendować w 30% pożywki TS, 70CM-1.5F4H.
2. Zawartość jednej fiolki z komórkami wysiać na płytkę 60 mm.

Różnicowanie komórek TS w TGC

Różnicowanie komórek TS w olbrzymie trofoblastowe (TGCs) można indukować poprzez usunięcie MEF-CM, FGF4 i heparyny. Fenotyp TGC (duże jądra komórkowe) można wykryć cztery dni po indukcji (Tanaka et al., 198 oraz Chiu et al. 208). Immunobarwienie p450scc pozwala wykryć ekspresję tego markera TGC w zróżnicowanej hodowli (Rysunek 4A). Analiza cytometryczna komórek barwionych PI (jodkiem propidyny) dodatkowo wykazuje obecność zróżnicowanych komórek o wyższej zawartości DNA (Rysunek 4B). Wyniki te sugerują, że komórki TS przechodzą endoreduplikację, stając się poliploidalnymi TGCs.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Disekcja macic myszy. (A) Położenie macic zaznaczono strzałkami. (B) Przecięcie w miejscu połączenia macicy z szyjką macicy, zgodnie z rysunkiem. (C) Przecięcie macicy tuż poniżej jajowodu (OD), pod jajnikiem (OV). (D) Obraz macic.

Rysunek 2. Reprezentatywne zdjęcia przedstawiają blastocystę myszy, wypustkę blastocysty oraz kolonię trofoblastu. (A) Przedstawiono blastocystę myszy pobraną w dniu E3.5. ICM, masa komórek wewnętrznych; MT, ścienny trofektoderm; PT, polarny trofektoderm. (B) Przedstawiono wypustkę trofoblastu na komórkach zasilających MEF. TS, komórka macierzysta trofoblastu. (C) Kolonia komórek macierzystych trofoblastu wykazuje wyraźną krawędź na komórkach zasilających MEF. Strzałki wskazują granicę komórkową.

Rysunek 3. Identyfikacja komórek TS za pomocą analizy immunobarwienia. Poddano identyfikacji markerów w komórkach TS (A-D) oraz ES (kontrolnych, E-H). Komórki poddano immunobarwieniu przeciwciałami rozpoznającymi Oct4 (A, E) lub Cdx2 (B, F) oraz przeciwbarwieniu DAPI (C, G), przedstawionym na obrazach scalonych (D, H). Pasek skali, 50 μm.

Rysunek 4. Różnicowanie komórek TS in vitro. (A) Niezróżnicowane (Undiff) lub zróżnicowane (Diff) komórki w hodowli poddano analizie pod kątem ekspresji markeru TGC, p450scc (zielony), z przeciwbarwieniem DAPI (czerwony). (B) Analiza cytometryczna przepływowa zróżnicowanych komórek, zabarwionych jodożymidyną (PI), mierzy zawartość DNA (M1, od dwóch do czterech kopii; M2, ponad cztery kopie). Populacja M2 reprezentuje poliploidalne komórki trofoblastu.

Dyskusja

W tym filmie prezentujemy proces pobierania blastocyst w stadium E3.5 z macic oraz procedury eksperymentalne służące do ustanowienia linii komórek TS. Opisujemy również warunki utrzymania pluripotencji komórek TS oraz indukcję ich różnicowania w komórki wyspecjalizowane. Dwoma krytycznymi krokami w celu uzyskania czystych linii komórek TS są czas dysagregacji wypustek (krok 9) oraz proces pierwszego pasażowania (krok 11). Wykazano, że w kulturze mogą pojawić się komórki pochodzące z pierwotnej endodermy po zbyt rozległym...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
pożywka TS: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM pirogronian sodu, 100 mM beta-merkaptoetanolu–etanol i 100 mg/ml penicyliny-streptomycyny.
Mitomycyna C: Rozpuścić 2 mg mitomycyny C (Sigma M-0503) w 2 ml PBS, a następnie dodać tę 2-ml mieszaninę do 200 ml pożywki TS (10 ng/ml). Przygotować 20 alikwotów (po 10 ml) i przechowywać w temperaturze -20°C.°w temperaturze -20°C do momentu użycia. Należy dodać jedną porcję na płytkę 100 mm.
Pożywka warunkowana embrionalnymi fibroblastami myszy (MEF-CM): Wysiać MEF na płytki 100 mm (1 x 106/płytkę). Następnego dnia dodać 10 ml pożywki TS na każdą płytkę i kontynuować hodowlę przez 48 godzin. Zebrać pożywkę hodowlaną, przefiltrować ją (0,45 mm) i przechowywać w temperaturze -20°C w aliquotach po 35 ml. Każdą aliquotkę rozmrażać w razie potrzeby; można je przechowywać w temperaturze 4°C. MEF można wykorzystać do przygotowania jeszcze dwóch partii pożywki warunkowej (CM) przed osiągnięciem przez nie pełnej konfluencji.
PBS/BSA: Rozpuścić BSA, frakcja V (Sigma A3311, 0,1% (m/v)) w PBS (10 ml), przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 mm i przygotować alikwoty po 1 ml w probówkach 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -70°C.°odwirować i rozmrażać jedną probówkę w razie potrzeby, aby przygotować FGF4.
FGF4 (1000x): Resuspend liofilizowany FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) w 1 ml roztworu PBS/BSA. Dokładnie wymieszać i rozdzielić na 10 alikwotów (100 µl) do probówek 1,5 ml, a następnie przechowywać w temperaturze -70°C.°C. Rozmrażaj każdą probówkę w miarę potrzeb, a pozostałe przechowuj w temperaturze 4°C°C, nie zamrażać ponownie. Rozcieńczyć 1000-krotnie w medium TS, aby uzyskać 1x FGF4 (25 ng/ml).
Heparyna (1000x): Resuspender heparynę (Sigma H3149, 10 000 jednostek) w PBS do stężenia końcowego 1 mg/ml (1000x). Przygotować aliquoty po 100 µl w probówkach 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -70°C.°C. rozmrażać alikwoty w razie potrzeby i przechowywać pozostałe w temperaturze 4°C°C, nie zamrażać ponownie. Rozcieńczyć 1000-krotnie w pożywce dla komórek TS, aby uzyskać stężenie 1x heparyny (1 ng/ml).