In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Podsumowanie

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

Streszczenie

Odszyfrowywanie sieci oddziaływań cząsteczekin vivojest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów regulujących funkcje i metabolizm komórek. Opracowano wiele opcji metodologicznych do badania oddziaływań molekularnych w komórkach, jednak większość z tych metod jest dość pośrednia, a w związku z tym trudno mierzalna ilościowo. W przeciwieństwie do nich, wprowadzono kilka zaawansowanych podejść ilościowych, które jednak trudno jest rozszerzyć na analizy wysokoprzepustowe. Aby połączyć możliwości wysokoprzepustowe z możliwością wyodrębnienia informacji ilościowych, opracowaliśmy niedawno nową koncepcję identyfikacji oddziaływań białko-białko (Schwarzenbacheret al.., 2008). W niniejszej pracy opisujemy szczegółowy protokół projektowania i konstrukcji tego systemu, który umożliwia analizę oddziaływań pomiędzy białkiem znakowanym fluoroforem („ofiarą”) a białkiem błonowym („przynętą”)in vivoKomórki wysiewa się na mikrowzorowane powierzchnie funkcjonalizowane przeciwciałami przeciwko egzoplazmatycznej domenie białka przynęty. Interakcje przynęta-ofiara analizuje się poprzez redystrybucję fluorescencyjnej ofiary. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością, sięgającą poziomu pojedynczych cząsteczek, zdolnością do wykrywania słabych interakcji oraz wysoką przepustowością, co sprawia, że nadaje się ona jako narzędzie przesiewowe.

Protokół

Drukowanie mikrokontaktowe:

1. Wytnij obszar mikrowzoru ze stempla PDMS za pomocą skalpela.
2. Przemyj obszar zawierający mikrowzór, płucząc go etanolem (100%) i wodą destylowaną.
3. Osusz stempel PDMS strumieniem azotu lub argonu.
4. Nanieś pipetą 50 μl roztworu roboczego BSA-Cy5 (0,67 mg/ml) na stempel PDMS w taki sposób, aby cały obszar mikrowzoru został pokryty roztworem. Inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
5. Przemyj obszar mikrowzoru, płucząc go roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i wodą destylowaną.
6. Osusz PDMS strumieniem azotu lub argonu.
7. Połóż stempel PDMS pod własnym ciężarem na środku jednej laminki pokrywowej powlekanej epoksydem i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej w szalce Petriego.
8. Oznacz pozycję stempla PDMS na tylnej stronie laminki i usuń stempel z laminki za pomocą pęsety.
9. Przyklej komorę hybrydyzacyjną Secure Seal nad obszarem naniesionym metodą mikrodościsku na lamince. Oznaczenie pomaga zlokalizować środek obszaru.
10. Nanieś pipetą 60 μl roztworu roboczego streptawidyny (50 μg/ml) do komory reakcyjnej i inkubuj próbkę przez 60 min w temperaturze pokojowej.
11. Przemyj próbkę 1 ml PBS, wprowadzając bufor przez jeden otwór komory i jednocześnie usuwając go z drugiego otworu za pomocą pompy.
12. Nanieś pipetą 60 μl roztworu roboczego biotynilowanego przeciwciała (10 μg/ml w PBS uzupełnionym o 0,1% Tween 20; „PBST”) do komory reakcyjnej i inkubuj przez 60 min w temperaturze pokojowej.
13. Przemyj próbkę 1 ml PBST, a następnie 1 ml PBS, wprowadzając bufor przez jeden otwór komory i ponownie usuwając go z drugiego otworu za pomocą pompy.
14. Przechowuj powierzchnie z mikrowzorami w PBS w ciemności w temperaturze pokojowej do momentu przygotowania komórek do wysiewu.

Inkubacja komórek na powierzchni z mikrowzorami:

1. Hodować komórki adherentne do osiągnięcia 50% konfluencji w płytce do hodowli tkanek o średnicy 3 cm.
2. Odjąć komórki wykazujące ekspresję białek przynęty (bait) i ofiary (prey) za pomocą roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), a następnie wirować przez 5 min przy 1 000 rpm.
3. Odlać nadsącz i rozpuścić osad komórkowy w odpowiedniej pożywce wzrostowej.
4. Wirować przez 5 min przy 1 000 rpm.
5. Odlać nadsącz i rozpuścić osad komórkowy w odpowiedniej pożywce wzrostowej.
6. Wymienić PBS w komorze reakcyjnej na mikrowzorcowanym szkiełku podstawowym na 60 μl zawiesiny komórkowej.
7. Utworzyć komorę wilgotną, nasączając sterylną gąbkę wodą destylowaną i umieszczając ją w szalce Petriego, aby zapobiec wysychaniu próbki.
8. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ na powierzchniach mikrowzorcowanych.
9. Przed analizą komórek pod mikroskopem wymienić pożywkę na zbuforowany roztwór soli Hanksa zawierający Ca²⁺ i Mg²⁺.

Mikroskopia:

1. Okładkę szkiełkiem umieszcza się na odpowiednim uchwycie i sprawdza morfologię komórek w świetle białym.
2. Jakość wzorów BSA-Cy5 jest sprawdzana poprzez wzbudzenie przy 647 nm.
3. Mikrowzory fluorescencyjnego białka ofiary (GFP lub YFP) są rejestrowane przy 488 lub 514 nm przy zastosowaniu wzbudzenia w całkowitym wewnętrznym odbiciu (TIR).

Reprezentatywne wyniki:

Jeśli między białkami docelowymi w komórkach hodowanych na powierzchni mikrowzorowanej zachodzi interakcja, białko prey będzie podążać za redystrybucją białka bait. Powstały mikrowzór można zwizualizować za pomocą znacznika fluorescencyjnego białka prey. Co ważne, uzyskany kontrast stanowi bezpośrednią miarę siły interakcji (patrz Rysunek 1). Dzięki temu możliwa jest prosta ocena interakcji dwóch białek – bez konieczności dalszego przetwarzania zmierzonych danych pierwotnych.

Rysunek 1. Przegrupowanie przynęty w błonie plazmatycznej żywej komórki przy różnych siłach oddziaływania. Przedstawiono obrazy TIR komórek T24 transfekowanych (a) CD71-GFP na mikrobioczipach z przeciwciałem anty-CD71, (b) CD4 i cytozolowym YFP na mikrobioczipach z przeciwciałem anty-CD4 oraz (c) GPI-GFP-DAF na mikrobioczipach z przeciwciałem anty-CD59. Dane są charakterystyczne dla silnego (a), braku (b) lub słabego (c) oddziaływania. Obraz (a) został powielony z (Weghuber et al., w druku), (b) z (Schwarzenbacher et al., 2008).

Dyskusja

Towarzyszące wideo demonstruje metodę wykrywania oddziaływań białko-białko w błonie plazmatycznej żywych komórek (Schwarzenbacher et al., 2008; Brameshuber et al., 2009; Weghuber et al., in press). W zasadzie każda platforma mikroskopowa oparta na TIRF może być wykorzystana jako system odczytu. Zaawansowane mikroskopy będą wymagane jedynie w przypadku potrzeby uzyskania wysokiej czułości (np. do detekcji pojedynczych cząsteczek). Aby osiągnąć najlepsze wyniki, podczas procesu przygotowania szczególną uwagę należy zwrócić na następujące krytyczne punkty:

1. Roztwór zapasowy Cy5 należy przechowywać w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu, a roztwór roboczy BSA-Cy5 przygotować bezpośrednio przed drukiem mikrokontaktowym.
2. Należy uważać, aby nie porysować końcówką pipety mikrowzorca na PDMS i inkubować próbkę w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu.
3. Przykrywo szkiełko należy położyć na sterylnym podkładzie, aby zapobiec przyklejeniu się szkiełka do szalki Petriego. Po przylegnięciu stempla PDMS do szkiełka nie wolno go przesuwać.
4. Należy unikać pęcherzyków powietrza w komorze reakcyjnej i inkubować próbkę w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu.
5. Nie należy dopuścić do wysychania próbki przez więcej niż 2 minuty, aby uniknąć tworzenia się kryształów soli.
6. Do odrywania komórek nie należy używać trypsyny, ponieważ spowoduje ona rozcięcie domeny zewnątrzkomórkowej wcześniej wyekspresowanych białek błonowych. Unikanie trypsyny będzie pomocne w przypadku białek o niskim współczynniku obrotu w celu utworzenia mikrowzorców bezpośrednio po przyкрепieniu komórek do powierzchni.
7. Liczbę inkubowanych komórek należy kontrolować pod mikroskopem i upewnić się, że konfluencja komórek nie przekracza 30-50%. Należy zadbać o natychmiastowe usunięcie nadmiaru komórek ze względu na ich szybkie przywieranie do powierzchni pokrytej przeciwciałami.
8. Do dalszych analiz można wykorzystać wyłącznie szkiełka z wysokiej jakości wzorami BSA-Cy5.
9. Preferowana jest stabilna ekspresja fluorescencyjnego białka prey ze względu na większą liczbę komórek, które można przeanalizować podczas jednego skanowania.
10. Odpowiednie dostrojenie TIRF jest niezbędne do wizualizacji wzorów ze względu na tło cytozolowe.

Technika mikro-wzorowania oferuje kilka możliwości analizy oddziaływań białko-białko. Po pierwsze, obok ilościowego oznaczenia lokalnych, rozdzielonych przestrzennie oddziaływań białko-białko, możliwe jest również wykrywanie oddziaływań słabych lub pośrednich, bez ryzyka uzyskania dużej liczby wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Po drugie, metoda ta umożliwia badaczowi analizę oddziaływań białko-białko w błonie plazmatycznej żywych komórek, co jest trudne do osiągnięcia za pomocą metod biochemicznych, takich jak test dwuhybrydowy. Po trzecie, podejście to pozwala na wykrywanie oddziaływań typu bait-prey, które są modulowane przez zmiany środowiskowe, takie jak temperatura, obecność różnych białek lub innych cząsteczek, a także modyfikacje potranslacyjne. W ten sposób test umożliwia przesiewanie modulatorów danej pary oddziaływań w kontekście żywych komórek. Ponadto, poprzez zmniejszenie gęstości powierzchniowej ligandu wychwytującego lub zastosowanie ligandów monowalentnych, możliwa staje się analiza stanu spoczynkowego. Wreszcie, przy zastosowaniu odpowiednich platform skanujących, liczba analizowanych komórek jest wystarczająco wysoka, aby sprostać wymogom wysokoprzepustowości stawianym przez firmy farmaceutyczne w procesie przesiewania leków (Ramm, 2005).