In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Podsumowanie

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

Streszczenie

Odszyfrowywanie sieci oddziaływań cząsteczekin vivojest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów regulujących funkcje i metabolizm komórek. Opracowano wiele opcji metodologicznych do badania oddziaływań molekularnych w komórkach, jednak większość z tych metod jest dość pośrednia, a w związku z tym trudno mierzalna ilościowo. W przeciwieństwie do nich, wprowadzono kilka zaawansowanych podejść ilościowych, które jednak trudno jest rozszerzyć na analizy wysokoprzepustowe. Aby połączyć możliwości wysokoprzepustowe z możliwością wyodrębnienia informacji ilościowych, opracowaliśmy niedawno nową koncepcję identyfikacji oddziaływań białko-białko (Schwarzenbacheret al.., 2008). W niniejszej pracy opisujemy szczegółowy protokół projektowania i konstrukcji tego systemu, który umożliwia analizę oddziaływań pomiędzy białkiem znakowanym fluoroforem („ofiarą”) a białkiem błonowym („przynętą”)in vivoKomórki wysiewa się na mikrowzorowane powierzchnie funkcjonalizowane przeciwciałami przeciwko egzoplazmatycznej domenie białka przynęty. Interakcje przynęta-ofiara analizuje się poprzez redystrybucję fluorescencyjnej ofiary. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością, sięgającą poziomu pojedynczych cząsteczek, zdolnością do wykrywania słabych interakcji oraz wysoką przepustowością, co sprawia, że nadaje się ona jako narzędzie przesiewowe.

Protokół

Drukowanie mikrokontaktowe:

1. Wyciąć obszar mikrowzorca ze stempla PDMS za pomocą skalpela
2. Przemyć obszar zawierający mikrowzorzec, płukąc go etanolem (100%) oraz wodą destylowaną.
3. Osuszyć stempel PDMS strumieniem azotu lub argonu.
4. Nanieść pipetą 50 μl roztworu roboczego BSA-Cy5 (0.67 mg/ml) na stempel PDMS w taki sposób, aby cały obszar mikrowzorca został pokryty roztworem. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
5. Przemyć obszar mikrowzorca, płukąc go solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) oraz wodą destylowaną.
6. Osuszyć PDMS strumieniem azotu lub argonu.
7. Położyć stempel PDMS pod własnym ciężarem na środku jednej laminki pokrywowej powlekanej epoksydem i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w szalce Petriego.
8. Zaznaczyć położenie stempla PDMS na tylnej stronie laminki i zdjąć stempel z laminki za pomocą pęsety.
9. Przykleić komorę hybrydyzacyjną Secure Seal nad obszarem naniesionym metodą mikrodo druku kontaktowego na lamince. Zaznaczenie pomaga zlokalizować środek obszaru.
10. Nanieść pipetą 60 μl roztworu roboczego streptawidyny (50 μg/ml) do komory reakcyjnej i inkubować próbkę przez 60 min w temperaturze pokojowej.
11. Przemyć próbkę 1 ml PBS, dodając bufor do jednego otworu komory i jednocześnie usuwając go drugim otworem za pomocą pompy.
12. Nanieść pipetą 60 μl roztworu roboczego biotynilowanego przeciwciała (10 μg/ml w PBS z dodatkiem 0.1% Tween 20; „PBST”) do komory reakcyjnej i inkubować przez 60 min w temperaturze pokojowej.
13. Przemyć próbkę 1 ml PBST, a następnie 1 ml PBS, dodając bufor do jednego otworu komory i ponownie usuwając go drugim otworem za pomocą pompy.
14. Przechowywać powierzchnie z mikrowzorcami w PBS w ciemności w temperaturze pokojowej do momentu przygotowania komórek do wysiewu.

Inkubacja komórek na powierzchni z mikrowzorcem:

1. Hodować komórki adherentne do uzyskania 50% konfluencji w 3 cm płytce do hodowli tkanek.
2. Odczepić komórki ekspresyjne badanych białek przynęty (bait) i ofiary (prey) za pomocą roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i wirować przez 5 min przy 1 000 rpm.
3. Odlać supernatant i zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej pożywce wzrostowej.
4. Wirować przez 5 min przy 1 000 rpm.
5. Odlać supernatant i zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej pożywce wzrostowej.
6. Wymienić PBS z komory reakcyjnej na mikrowzorcowanym szkiełku podstawnym na 60 μl zawiesiny komórkowej.
7. Stworzyć komorę nawilżaną, nasączając sterylną wacikową podkładkę wodą destylowaną i umieszczając ją w szalce Petriego, aby zapobiec wysychaniu próbki.
8. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ na powierzchniach mikrowzorcowych.
9. Przed analizą komórek pod mikroskopem wymienić pożywkę na zbuforowany roztwór soli Hank'a zawierający Ca²⁺ i Mg²⁺.

Mikroskopia:

1. deactivate laska pokrywkę na odpowiednim uchwycie i sprawdzono morfologię komórek w świetle białym.
2. Jakość wzorów BSA-Cy5 sprawdzono poprzez wzbudzenie przy 647 nm.
3. Mikrowzory fluorescencyjnego białka ofiary (GFP lub YFP) zarejestrowano przy 488 lub 514 nm przy zastosowaniu wzbudzenia w całkowitym wewnętrznym odbiciu (TIR).

Reprezentatywne wyniki:

Jeśli między białkami docelowymi w komórkach hodowanych na powierzchni z mikrowzorami zachodzi oddziaływanie, białko prey będzie podążać za redystrybucją białka bait. Powstały mikrowzór można zwizualizować za pomocą znacznika fluorescencyjnego białka prey. Co istotne, uzyskany kontrast stanowi bezpośrednią miarę siły oddziaływania (patrz Rysunek 1). Dzięki temu możliwa jest prosta ocena oddziaływania dwóch białek – bez konieczności dalszego przetwarzania zmierzonych danych pierwotnych.

Rysunek 1. Przemeblowanie przynęty w błonie plazmatycznej żywej komórki przy różnych siłach oddziaływania. Przedstawiono obrazy TIR komórek T24 przetransfekowanych na mikrochipach biologicznych z (a) CD71-GFP na przeciwciałach anty-CD71, (b) CD4 i cytozolowym YFP na przeciwciałach anty-CD4 oraz (c) GPI-GFP-DAF na przeciwciałach anty-CD59. Dane są charakterystyczne dla silnego (a), braku (b) lub słabego oddziaływania (c). (a) reprodukowano z (Weghuber et al., w druku), (b) z (Schwarzenbacher et al., 2008).

Dyskusja

Towarzyszące wideo demonstruje metodę wykrywania oddziaływań białko-białko w błonie plazmatycznej żywych komórek (Schwarzenbacher et al., 2008; Brameshuber et al., 2009; Weghuber et al., in press). W zasadzie każda platforma mikroskopowa oparta na TIRF może być wykorzystana jako system odczytu. Zaawansowane mikroskopy będą wymagane jedynie w przypadku potrzeby uzyskania wysokiej czułości (np. do detekcji pojedynczych cząsteczek). Aby osiągnąć najlepsze wyniki, podczas procesu przygotowania szczególną uwagę należy zwrócić na następujące krytyczne punkty:

1. Roztwór zapasowy Cy5 należy przechowywać w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu, a roztwór roboczy BSA-Cy5 przygotować bezpośrednio przed drukiem mikrokontaktowym.
2. Należy uważać, aby nie porysować końcówką pipety mikrowzorca na PDMS i inkubować próbkę w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu.
3. Przykrywo szkiełko należy położyć na sterylnym podkładzie, aby zapobiec przyklejeniu się szkiełka do szalki Petriego. Po przylegnięciu stempla PDMS do szkiełka nie wolno go przesuwać.
4. Należy unikać pęcherzyków powietrza w komorze reakcyjnej i inkubować próbkę w ciemności, aby uniknąć blaknięcia fluoroforu.
5. Nie należy dopuścić do wysychania próbki przez więcej niż 2 minuty, aby uniknąć tworzenia się kryształów soli.
6. Do odrywania komórek nie należy używać trypsyny, ponieważ spowoduje ona rozcięcie domeny zewnątrzkomórkowej wcześniej wyekspresowanych białek błonowych. Unikanie trypsyny będzie pomocne w przypadku białek o niskim współczynniku obrotu w celu utworzenia mikrowzorców bezpośrednio po przyкрепieniu komórek do powierzchni.
7. Liczbę inkubowanych komórek należy kontrolować pod mikroskopem i upewnić się, że konfluencja komórek nie przekracza 30-50%. Należy zadbać o natychmiastowe usunięcie nadmiaru komórek ze względu na ich szybkie przywieranie do powierzchni pokrytej przeciwciałami.
8. Do dalszych analiz można wykorzystać wyłącznie szkiełka z wysokiej jakości wzorami BSA-Cy5.
9. Preferowana jest stabilna ekspresja fluorescencyjnego białka prey ze względu na większą liczbę komórek, które można przeanalizować podczas jednego skanowania.
10. Odpowiednie dostrojenie TIRF jest niezbędne do wizualizacji wzorów ze względu na tło cytozolowe.

Technika mikro-wzorowania oferuje kilka możliwości analizy oddziaływań białko-białko. Po pierwsze, obok ilościowego oznaczenia lokalnych, rozdzielonych przestrzennie oddziaływań białko-białko, możliwe jest również wykrywanie oddziaływań słabych lub pośrednich, bez ryzyka uzyskania dużej liczby wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Po drugie, metoda ta umożliwia badaczowi analizę oddziaływań białko-białko w błonie plazmatycznej żywych komórek, co jest trudne do osiągnięcia za pomocą metod biochemicznych, takich jak test dwuhybrydowy. Po trzecie, podejście to pozwala na wykrywanie oddziaływań typu bait-prey, które są modulowane przez zmiany środowiskowe, takie jak temperatura, obecność różnych białek lub innych cząsteczek, a także modyfikacje potranslacyjne. W ten sposób test umożliwia przesiewanie modulatorów danej pary oddziaływań w kontekście żywych komórek. Ponadto, poprzez zmniejszenie gęstości powierzchniowej ligandu wychwytującego lub zastosowanie ligandów monowalentnych, możliwa staje się analiza stanu spoczynkowego. Wreszcie, przy zastosowaniu odpowiednich platform skanujących, liczba analizowanych komórek jest wystarczająco wysoka, aby sprostać wymogom wysokoprzepustowości stawianym przez firmy farmaceutyczne w procesie przesiewania leków (Ramm, 2005).