Chirurgiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u szczura jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad udarem. W niniejszej pracy demonstrujemy indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono również wizualizację powstałego zawału za pomocą barwienia histologicznego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym.
Artykuł metodologiczny
Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Udar mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów u dorosłych na całym świecie1. W przypadku udaru u ludzi występuje wysoce zróżnicowany stan kliniczny; jednak przy opracowywaniu modeli zwierzęcych niedokrwienia ogniskowego kluczowe jest osiągnięcie powtarzalności objętości eksperymentalnie wywołanego zawału. Szczur jest powszechnie stosowanym modelem zwierzęcym w badaniach nad udarem ze względu na stosunkowo niskie koszty utrzymania oraz podobieństwo krążenia w obrębie czaszki do krążenia u ludzi2,3. U ludzi w zespołach udarowych najczęściej zajęta jest środkowa tętnica mózgowa (MCA), dlatego w modelach zwierzęcych opisano wiele metod okluzji środkowej tętnicy mózgowej (MCAO), aby odwzorować ten zespół kliniczny. Ponieważ po ostrym udarze u ludzi często dochodzi do rekanalizacji, w wielu z tych modeli uwzględniono reperfuzję po okresie okluzji. W niniejszym filmie prezentujemy model przejściowej endowaskularnej okluzji MCAO z użyciem szwu u szczura spontanicznie nadciśnieniowego (SHR). Filament z silikonową powłoką na końcówce jest wprowadzany do światła naczynia u ujścia MCA na 60 minut, po czym następuje reperfuzja. Należy zauważyć, że optymalny czas okluzji może być inny w przypadku innych szczepów szczurów, takich jak Wistar czy Sprague-Dawley. Przedstawiono kilka behawioralnych wskaźników udaru u szczura. Niedokrwienie ogniskowe potwierdzono za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym w obrazach T2-zależnych oraz poprzez barwienie przekrojów mózgu chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliu (TTC) 24 godziny po MCAO.
Protokół
Szczurzy model MCAO
Przygotowania przedoperacyjne
Podczas wszystkich chirurgicznych procedur przeżyciowych należy stosować technikę aseptyczną. Powierzchnię roboczą należy zdezynfekować komercyjnym środkiem dezynfekującym, a sterylizować w autoklawie zestawy chirurgiczne zawierające instrumenty, draperie, gazę, tampony, nici chirurgiczne oraz ostrza skalpela. Należy stosować maskę chirurgiczną, czepka oraz sterylne rękawiczki. W przypadku wykonywania wielu operacji na szczurach podczas jednej sesji, do ponownej sterylizacji instrumentów chirurgicznych pomiędzy zabiegami stosuje się sterylizator kuleczkowy Germinator. Przed operacją należy rozgrzać homeotermiczny koc z płaszczem wodnym i umieścić go pod chłonną podkładką, aby zapobiec hipotermii szczura podczas zabiegu.
- Umieść szczura nadciśnieniowego (lub inny wybrany szczep szczura) w komorze indukcyjnej i wprowadź w stan znieczulenia przy użyciu 5% izofluranu (aparatura do znieczulania powinna być ustawiona na 1,0 L/min O2 oraz 1,0 L/min N2O). Obniż stężenie izofluranu do 1-2%, aby podtrzymać znieczulenie.
- Nałóż maść sztucznych łez do obu oczu.
- Wygol gardło i lewy obszar szyi poza planowanym miejscem nacięcia, używając trymera (Oster A5 z ostrzem nr 10).
- Nanieś Betadynę na gazik i zdezynfekuj skórę, zaczynając od centrum obszaru chirurgicznego i poruszając się spiralnie na zewnątrz. Przemyj sterylnym gazikiem nasączonym 70% etanolem, przesuwając go w podobny sposób. Powtórz oba kroki łącznie trzy razy.
- Wstrzyknij podskórnie 0,2 mL 0,5% bupiwakainy wzdłuż planowanego miejsca nacięcia.
- Umieść szczura w sterylnym rękawie tekstylnym lub przykryj sterylną ściereczką chirurgiczną.
Przejściowa okluzja MCA
- Pod mikroskopem operacyjnym wykonuje się nacięcie w linii środkowej strony brzusznej i przeprowadza preparację powięzi powierzchownej.
- Pod powięzią powierzchowną znajduje się tkanka gruczołowa po lewej stronie oraz trzy mięśnie tworzące trójkąt: mięsień mostkowo-tarczycowy, który znajduje się w linii środkowej nad tchawicą; mięsień dwbrzuszkowy (łatwo rozpoznawalny dzięki błyszczącym, białym częściom ścięgnistym) oraz mięsień mostkowo-obojczykowo-mostkowy.
- W obrębie trójkąta przeprowadza się ostrożną preparację ostrą i tępą w celu zidentyfikowania tętnicy szyjnej (niektórzy mogą preferować wyłącznie preparację tępą, aby zminimalizować przypadkowe uszkodzenia tkanek). Odsłania się tętnice szyjne zewnętrzne, wewnętrzne i wspólne (ECA, ICA, CCA). Tętnica szyjna jest duża i widocznie pulsuje. Widoczny jest nerw błędny przebiegający wzdłuż bocznej strony zarówno tętnicy szyjnej wspólnej, jak i wewnętrznej; zostaje on ostro odseparowany od tych naczyń.
- Następnie ostro preparuje się dwie gałęzie ECA: pierwsza biegnie przyśrodkowo, a druga bocznie. Obie gałęzie zostają koagulowane i przecięte, co ułatwia mobilizację większych naczyń.
- Tętnicę ECA preparuje się dalej w kierunku rostralnym. Może napotkać się kość hyoidalną, co ograniczy zakres preparacji rostralnej. Tętnicę szyjną zewnętrzną podwiązuje się tak dystalnie, jak to możliwe, za pomocą szwu jedwabnego 6-0.
- Kolejny szew jedwabny 6-0 umieszcza się luźno wokół ECA w pobliżu rozwidlenia z ICA. Należy upewnić się, że naczynie nie jest zamknięte, ponieważ w późniejszym kroku przez to miejsce zostanie przerowadzony szew intraluminalny służący do okluzji.
- Mikrochirurgiczne klipsy zostają umieszczone na tętnicach szyjnych wspólnych i wewnętrznych w pobliżu rozwidlenia.
- W tętnicy szyjnej zewnętrznej, pomiędzy dwoma podwiązaniami z jedwabiu, wykonuje się wstępną częściową arteriotomię.
- Do światła ECA, w kierunku CCA, gdzie znajduje się klips mikrochirurgiczny, wprowadza się odcinek nici nylonowej monofilamentowej 4-0 o długości 2,2-3,0 cm, z zagięciem 2,0 cm od zaokrąglonego końca pokrytego silikonem. Szwy te są dostępne w sprzedaży (Doccol Corp., Redlands, CA, USA). Odcina się pozostałą część ECA (w miejscu częściowej arteriotomii), aby uwolnić kikut i ustawić go poniżej rozwidlenia ECA i ICA; ułatwi to przesunięcie szwu intraluminalnego do ICA.
- Zaciska się szew jedwabny wokół kikuta ECA, aby zabezpieczyć intraluminalny szew nylonowy i zapobiec krwawieniu, a następnie usuwa się klips naczyniowy z ICA. Przed zdjęciem należy powoli otworzyć klips, aby sprawdzić, czy nie występuje krwawienie.
- Kontynuuje się wprowadzanie szwu nylonowego ze światła ECA do ICA, a następnie do tętnicy środkowej mózgu (MCA). Odcinek ten ma zazwyczaj 18-20 mm, co jest powodem wykonania zagięcia w szwie przed wprowadzeniem. Po wprowadzeniu zmiennej długości szwu nylonowego może pojawić się opór. Jeśli nastąpi to, gdy znaczna część nici wciąż znajduje się poza naczyniem, wskazuje to na prawdopodobne wejście szwu do tętnicy skrzydłopodniebiennej (patrz uwaga poniżej). Należy cofnąć szew i lekko go wygiąć, aby kontynuować przejście wzdłuż ICA, która biegnie bardziej przyśrodkowo. Dodatkowo można przeprowadzić preparację odejścia PPA, aby lepiej zwizualizować drogę filamentu intraluminalnego. Wprowadzanie szwu nylonowego kontynuuje się do momentu poczucia oporu w pozycji zagięcia 2 cm lub za nią. W tym punkcie szew intraluminalny zablokował ujście MCA. Okluzję MCA można potwierdzić, monitorując spadek regionalnego przepływu krwi mózgowej za pomocą laserowego flowmetru Dopplera (źródło sprzętu podano w tabeli z materiałami). Należy również zauważyć, że ujście tętnicy skrzydłopodniebiennej z ICA można bezpośrednio podwiązać, jeśli jest to preferowane, aby uniknąć przypadkowej intubacji tego naczynia szwem intraluminalnym.
- Uruchamia się stoper i zapisuje czas rozpoczęcia okluzji.
- Usuwa się mikroklips z CCA.
- Nacięcie (skórę, panniculus carnosus, warstwy tkanki podskórnej) zamyka się szybko szwem jedwabnym 3-0 (prosty szew ciągły ułatwi ponowne otwarcie w celu reperfuzji), a szczura ostrożnie umieszcza się w klatce regeneracyjnej. Należy sprawdzić, czy dno klatki wokół nosa i pyszczka jest wolne od ściółki, oraz monitorować wybudzanie z narkozy.
Przywrócenie przepływu krwi w MCA (reperfuzja)
- Krótko przed zakończeniem okresu okluzji ponownie podaj szczurowi środek znieczulający, zdezynfekuj miejsce nacięcia Betadyną i 70% etanolem (3 cykle, jak wcześniej) i otwórz nacięcie, usuwając szwy zamykające.
- Umieść mikroklips na CCA, jak wcześniej.
- Wycofaj część szwu okluzyjnego z ICA, aż koniec szwu stanie się widoczny przez ICA. NIE usuwaj całkowicie szwu z ICA/ECA!
- Umieść mikroklips na ICA powyżej końca szwu wewnątrz światła naczynia.
- Całkowicie usuń szew okluzyjny i ściśle podwiąż kikut ECA. Zapisz czas zakończenia okluzji (początek reperfuzji).
- Usuń mikroklips z ICA.
- Usuń mikroklips z CCA.
- Zwilż obszar kilkoma kroplami jałowej soli fizjologicznej i zamknij warstwy nacięcia (skórę właściwą, mięsień skórny, tkankę podskórną) szwem jedwabnym 3-0, stosując szwy pojedyncze przerywane.
- Podaj do jamy otrzewnowej 0,05 mg/kg buprenorfiny (lub innego odpowiedniego przeciwbólowego środka pooperacyjnego zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji).
- Wstrzyknij doprzewniecznie 5cc podgrzanej soli fizjologicznej. Zapewni to nawodnienie w fazie rekonwalescencji.
- Monitoruj wybudzanie się szczura z narkozy.
- Po wybudzeniu szczura sprawdź behawioralne oznaki zawału, trzymając szczura za ogon i obserwując, czy zwierzę może obracać się na obie strony. Oczekuje się zwijania tylko w jedną stronę. Do zapisu początkowej funkcji behawioralnej po zawale można użyć prostych skal punktowych (patrz: Dyskusja).
- Dodatkowe dawki buprenorfiny (w tej samej dawce co powyżej) należy podawać co 6 do 8 godzin przez 24 godziny w celu uśmierzenia bólu. Przedłuż analgezję, jeśli zwierzę wykazuje oznaki dyskomfortu.
Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Zamknięcie tętnicy środkowej mózgu za pomocą szwu wewnątrznaczyniowego. Przedstawiono uproszczony schemat układu krwionośnego czaszki szczura, na którym widoczny jest pokryty silikonem szew wewnątrznaczyniowy zamykający ujście MCA. Gałęzie OA i ST lewej ECA zostały podwiązane, a węzeł szewny wokół kikutu ECA utrzymuje szew wewnątrznaczyniowy na miejscu. ACA, tętnica przednia mózgu; BA, tętnica podstawna; CCA, tętnica szyjna wspólna; ECA, tętnica szyjna zewnętrzna; ICA, tętnica szyjna wewnętrzna; MCA, tętnica środkowa mózgu; OA, tętnica potyliczna; PCA, tętnica tylna mózgu; PComA, tętnica łącząca tylna; PPA, tętnica skrzydłowopodniebna; ST, tętnica tarczowa górna. Rycina zaadaptowana z Sasaki et al.4 oraz Lee3.
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy rezonansu magnetycznego przekrojów czołowych mózgu szczura 24 godziny po 1-godzinnym przejściowym MCAO. Obrzęk mózgu towarzyszący niedokrwieniu ogniskowemu jest widoczny na obrazach MRI ważonych w czasie T2. Strefa zawału wykazuje hiperintensywność (jest jasna) na obrazach T2. Podobne wzorce zawału można zaobserwować przy zastosowaniu bardziej zaawansowanych technik MRI, takich jak obrazowanie dyfuzyjne i mapowanie pozornego współczynnika dyfuzji5.
Rysunek 3. Reprezentatywne przekroje czołowe mózgu szczura barwione TTC 24 godziny po 1-godzinnej przejściowej MCAO. Barwienie TTC ujawnia białe (niezabarwione) obszary zawału kory mózgowej i prążkowia u tego samego szczura, który został przedstawiony na Rysunku 2. Należy zauważyć, że ogólny wzorzec ogniskowych zmian niedokrwiennych jest podobny do tego widocznego na obrazach MRI ważonych T2, choć ostateczny obszar zawału określony histologicznie może być nieco mniejszy niż zmiana w obrazowaniu T2.
Dyskusja
Modele niedokrwienia mózgu u gryzoni można klasyfikować jako globalne lub ogniskowe oraz odwracalne lub nieodwracalne. Stosujemy model odwracalnego niedokrwienia ogniskowego, aby naśladować uszkodzenie reperfuzyjne, które może wystąpić po rekanalizacji u pacjentów z udarem mózgu. Chociaż szczury mają tę zaletę, że ich krążenie w obrębie czaszki jest podobne do ludzkiego, rozległy wewnątrzczaszkowy krążenie oboczne, wynikające z obecności koła Willisa i anastomoz oponowych, prowadzi do niespójnych objętości zawałów6. Wykorzystujemy szczep szczurów spontanicznie nadciśnieniowych (SHR), ponieważ wielkość zawału jest większa u szczurów SHR poddanych ogniskowemu niedokrwieniu mózgu w porównaniu do szczurów normotensyjnych7-10. Indukcja udaru u szczurów SHR jest również bardziej powtarzalna i może wiązać się z mniejszą śmiertelnością niż w przypadku innych powszechnie stosowanych szczepów11. Ponadto podczas operacji należy monitorować parametry fizjologiczne, ponieważ ich wahania mogą zwiększać zmienność objętości zawałów; parametry te obejmują ciśnienie krwi, poziomy tętniczego O2 i CO2, hipotermię oraz hiperglikemię, które mogą pogorszyć uszkodzenie niedokrwienne2,12. Szczególną uwagę należy zwrócić na hipotermię, ponieważ może ona zmniejszyć stopień niedokrwiennego uszkodzenia neuronów, dlatego podczas operacji niezbędne jest umieszczenie szczura na termoregulatorcyjnej podkładce grzewczej.
W niniejszej procedurze stosujemy komercyjnie przygotowane szwy powlekane silikonem w celu zwiększenia spójności wielkości obszaru zawału13-15. Tradycyjnie szwy wewnątrzluminalne używane do zamykania tętnicy środkowej mózgu (MCA) przygotowywano poprzez zaokrąglanie końcówki szwu nylonowego 3-0 nad płomieniem lub za pomocą pistoletu z klejem na gorąco, aby pokryć końcówkę szwu małą kropelką kleju16. Procedury te prowadzą do powstania szwów o zróżnicowanych średnicach końcówek, co może wymagać kilku prób okluzji przed znalezieniem szwu odpowiadającego średnicy naczynia u danej szczura. Dodatkowe modyfikacje metody MCAO opisane w tym filmie obejmują okluzję bardziej dystalną, z oszczędzeniem gałęzi soczewkowoprzystkowych w celu uzyskania czystego zawału korowego17, oraz jednoczesną okluzję MCA i ipsylateralnej tętnicy szyjnej wspólnej w celu zmniejszenia przepływu krwi pobocznej6,9.
Skutki funkcjonalne udaru można ocenić za pomocą różnorodnych testów behawioralnych, w których deficyty w konkretnych zadaniach odzwierciedlone są w prostej skali punktowej. Na przykład Bederson et al.18 opracowali skalę neurologiczną oceniającą szczury pod kątem stopnia zgięcia przednich kończyn w pozycji z uniesionym ciałem, asymetrycznego oporu wobec pchnięcia bocznego oraz zachowań krążenia w otwartej przestrzeni. Szczury, które po uniesieniu opierały obie przednie kończyny o podłoże i nie wykazywały innych deficytów, oceniano jako „Normalne (0)”, natomiast szczury wykazujące jedynie zgięcie przeciwstawnej przedniej kończyny klasyfikowano jako „Umiarkowane deficyty (1)”. Szczury w stopniu „Ciężki 2” wykazywały zmniejszony opór po stronie przeciwstawnej wobec siły bocznej, a szczury w stopniu „Ciężki 3” dodatkowo przejawiały zachowania krążenia. Deficyty behawioralne z niższych stopni były zawsze obserwowane w kolejnych wyższych stopniach (np. zwierzęta w stopniach 2 i 3 również wykazywały zgięcie przedniej kończyny), a wyniki te pozwalały przewidzieć różnice w wielkości obszaru zawału18. Zatem taki prosty system punktacji umożliwia szybką, spójną i półilościową ocenę deficytów funkcjonalnych powstałych w wyniku udaru.
Pomiar zakresu zawału mózgu jest powszechnie przeprowadzany za pomocą barwienia histologicznego uszkodzeń tkanki przy użyciu TTC, fioletu krezylu (barwienie Nissla) lub hematoksyliny i eozyny. Techniki obrazowania metodą rezonansu magnetycznego, w tym MRI z obrazowaniem dyfuzyjnym w celu wizualizacji zawału wczesnych etapach po zamknięciu naczynia, pozwalają na określenie objętości zawału u każdego szczura bez konieczności pobierania tkanek. Jest to szczególnie wartościowe w badaniach mających na celu określenie skuteczności leczenia neuroprotekcyjnego po udarze; obrazowanie szczura po MCAO, ale przed podaniem leczenia, daje badaczowi pewność, że wszystkie zwierzęta doświadczalne i kontrolne przeszły na początku podobne udary, co redukuje zakłócający wpływ zmienności w indukowaniu udaru.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Protokół ten został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w School of Medicine and Public Health Uniwersytetu Wisconsin-Madison i jest zgodny z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health) dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych.
Podziękowania
Dziękujemy Beth Rauch oraz University of Wisconsin Small Animal Imaging Facility za wykonanie obrazowania rezonansem magnetycznym. Finansowanie niniejszej pracy zapewnił Department of Neurological Surgery na University of Wisconsin-Madison.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szew nylonowy 4-0 | Doccol Corporation | długość powłoki silikonowej 2-3 mm, średnica końcówki 0,39 mm | |
| Szczury z samoistnym nadciśnieniem tętniczym | Charles River Laboratories | 290-300 g, samce | |
| Pompa termoregulacyjna i podkładki Gaymar T/Pump | Gaymar Industries | ||
| Bipolarna jednostka elektrochirurgiczna Vetroson V-10 | Summit Hill Laboratories | ||
| Sterylizator szklanymi kuleczkami Germinator 500 | CellPoint Scientific | ||
| Monitor perfuzji krwi Vasamedics Bpm2Laserflo | TSI Inc. |
Bibliografia
- van Gijn, J., Dennis, M. S. Issues and answers in stroke care. Lancet. 352, Suppl 3. SIII23-27 (1998).
- Macrae, I. M. New models of focal cerebral ischaemia. British Journal of Clinical Pharmacology. 34, 302-302 (1992).
- Lee, R. M. Morphology of cerebral arteries. Pharmacol Ther. 66, 149-173 (1995).
- Sasaki, M., Honmou, O., Kocsis, J. D. A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery. Methods Mol Biol. 549, 187-195 (2009).
- Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J., Henninger, N. Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps. Brain Res. 1279, 182-188 (2009).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M., Dempsey, R. J. Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats. Neurol Res. 20, 265-270 (1998).
- Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y., Omae, T. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study. Stroke. 7, 54-60 (1976).
- Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
- Duverger, D., MacKenzie, E. T. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 449-461 (1988).
- Coyle, P. Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats. Stroke. 17, 520-525 (1986).
- Slivka, A. P. Hypertension and hyperglycemia in experimental stroke. Brain Res. 562, 66-70 (1991).
- Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412, 185-190 (2007).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156, 161-165 (2006).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical neurology. 24, 47-51 (1985).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
Przedruki i uprawnienia
