Szybkie mrożenie i kriosekcjonowanie mózgu myszy w stadium E12.5

Podsumowanie

W niniejszym filmie zaprezentowano techniki błyskawicznego mrożenia i sekcjonowania tkanki zarodkowego mózgu myszy. Przedstawiono przydatne wskazówki dotyczące obsługi kriostatu, w tym metody rozwiązywania problemów, które można zastosować podczas cięcia, aby zapewnić, że uzyskane przekroje tkankowe będą wolne od pęknięć i innych zniekształceń.

Protokół

1. Utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie w PBS przez wybrany czas.
2. Infundować tkankę sacharozą (krioprotekcja)
   1. Przygotować 30% roztwór sacharozy w PBS w/v w probówce 2059.
   2. Przepłukać tkankę 3x w PBS (~ 5 min z kołysaniem).
   3. Umieścić tkankę w 30% roztworze sacharozy.  Tkanka nie powinna zatonąć.
   4. Przechowywać tkankę w 4°C przez noc lub do momentu, aż zatonie.
3. Oznaczyć formę do mrożenia (cryomold) o odpowiednim rozmiarze, podając informacje oraz orientację.
4. Wypełnić formę do mrożenia medium O.C.T. (unikając pęcherzyków powietrza).
5. Przenieść tkankę do kąpieli z O.C.T. i pokryć ją tym medium.
6. Przenieść tkankę do O.C.T. w formie do mrożenia.
7. Zorientować tkankę pod mikroskopem.
8. Wlać ciekły azot do plastikowej szalki Petriego.
9. Szybko i ostrożnie zanurzyć tkankę w formie do mrożenia w azocie (nie zanurzać górnej części formy).
10. Gdy O.C.T. stanie się białe i stałe, umieścić zamrożoną tkankę w zamrażarce -80°C w celu przechowywania.
11. Dostosować temperaturę tkanki do ~20°C przez co najmniej 30 min przed przystąpieniem do cięcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Forma do mrożenia Tissue-Tek Cryomold	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Roztwór sacharozy			30% roztwór sacharozy w PBS w/v
paraformaldehyd			4% paraformaldehyd w PBS