Błyskawiczne zamrażanie i kriosekcja mózgu myszy E12.5

Summary

W tym filmie pokazane są techniki błyskawicznego zamrażania i wycinania embrionalnej tkanki mózgowej od myszy. Podano przydatne wskazówki dotyczące korzystania z kriostatu, w tym metody rozwiązywania problemów, które można zastosować podczas cięcia, aby upewnić się, że powstałe skrawki tkanek są wolne od pęknięć i innych zniekształceń.

Protocol

1. Utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie w PBS na żądany czas.
2. Tkanka sacharozy (krioprotekcja)
   1. Przygotuj 30% roztwór sacharozy w PBS w / v w probówce 2059.
   2. Płukać chusteczkę 3x w PBS (~ 5 min z bujaniem).
   3. Umieść tkankę w 30% roztworze sacharozy.  Tkanka nie tonie.
   4. Umieść chusteczkę w temperaturze 4°C na noc lub do momentu, gdy opadnie.
3. Oznacz kriomold odpowiednim rozmiarem z informacjami i orientacją.
4. Napełnij cryomold O.C.T. (unikaj pęcherzyków powietrza).
5. Przenieś tkankę do kąpieli O.C.T. i pokryj ją O.C.T.
6. Przenieś tkankę do O.C.T. w krioformie.
7. Zorientuj tkankę pod mikroskopem.
8. Wlej ciekły azot do plastikowej szalki Petriego.
9. Szybko i ostrożnie zanurz tkankę w kriofordzie do azotu. (Nie zanurzaj górnej części krioformy.)
10. Gdy O.C.T. stanie się jednolicie biały, umieść zamrożoną tkankę w zamrażarce w temperaturze -80°C do przechowywania.
11. Wyrównaj temperaturę tkanki do ~20°C przez co najmniej 30 minut przed sekcją.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue-Tek Cryomold	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
		sacharozy	30% roztwór sacharozy w PBS z
paraformaldehydem			4% paraformaldehyd w PBS