Spektrometria mas ruchliwości jonów fali T: podstawowe procedury eksperymentalne do analizy kompleksu białek

Summary

Mobilność jonów-spektrometria mas to nowa technologia rozdzielania jonów na podstawie ich przekroju poprzecznego i masy. Metoda dostarcza trójwymiarowych informacji na temat ogólnej topologii i kształtu kompleksów białkowych. W tym miejscu przedstawiamy podstawową procedurę ustawiania i optymalizacji przyrządów, kalibracji czasów dryftu i interpretacji danych.

Abstract

Ruchliwość jonów (IM) to metoda, która mierzy czas potrzebny jonowi na przejście przez ogniwo pod ciśnieniem pod wpływem słabego pola elektrycznego. Prędkość, z jaką jony przechodzą przez obszar dryfu, zależy od ich wielkości: duże jony doświadczają większej liczby zderzeń z gazem obojętnym tła (zwykle N₂), a zatem przemieszczają się wolniej przez urządzenie IM niż jony o mniejszym przekroju poprzecznym. Ogólnie rzecz biorąc, czas potrzebny jonom na migrację przez gęstą fazę gazową rozdziela je, zgodnie z ich przekrojem zderzenia (Ω).

Niedawno, spektrometria IM została połączona ze spektrometrią mas i wydano spektrometr masowy mobilności jonów Synapt (IM-MS) o fali biegnącej (fala T). Integracja spektrometrii mas z ruchliwością jonów umożliwia dodatkowy wymiar separacji i definiowania próbek, uzyskując trójwymiarowe widmo (masa do ładunku, intensywność i czas dryfu). Ta technika separacji pozwala na zmniejszenie nakładania się widma i umożliwia rozdzielczość heterogenicznych kompleksów o bardzo podobnych proporcjach masy lub masy do ładunku, ale różnych czasach dryfu. Co więcej, pomiary czasu dryftu dostarczają ważnej warstwy informacji strukturalnych, ponieważ jest Ω związane z ogólnym kształtem i topologią jonu. Korelację między zmierzonymi wartościami czasu dryftu a Ω oblicza się przy użyciu krzywej kalibracyjnej wygenerowanej z białek kalibru o zdefiniowanych przekrojach¹.

Siła podejścia IM-MS polega na jego zdolności do definiowania upakowania podjednostek i ogólnego kształtu zespołów białkowych przy stężeniach mikromolowych i warunkach zbliżonych do fizjologicznych¹. Kilka ostatnich badań IM zarówno pojedynczych białek^2,3, jak i niekowalencyjnych kompleksów białkowych^4-9 z powodzeniem wykazało, że struktura czwartorzędowa białka jest zachowana w fazie gazowej i podkreśliło potencjał tego podejścia w badaniu zespołów białek o nieznanej geometrii. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis analizy kompleksów białkowych IMS-MS przy użyciu instrumentu Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS (Waters Ltd; jedyny obecnie dostępny komercyjny instrument IM-MS)¹⁰. Opisujemy podstawowe kroki optymalizacji, kalibrację przekrojów kolizyjnych oraz metody przetwarzania i interpretacji danych. W ostatnim kroku protokołu omówiono metody obliczania teoretycznych wartości Ω. Ogólnie rzecz biorąc, protokół nie próbuje objąć każdego aspektu charakterystyki zespołów białek IM-MS; Jego celem jest raczej zapoznanie się z praktycznymi aspektami metody dla nowych badaczy w tej dziedzinie.

Protocol

Procedura, którą opisujemy, skupia się wyłącznie na analizie IM-MS kompleksów białkowych. Dlatego sugerujemy, aby badacze niezaznajomieni z dziedziną strukturalnego MS skorzystali z etapów przygotowania próbki, kalibracji przyrządów oraz procedur optymalizacji MS i tandemowych MS opisanych w Kirshenbaum i in. 2009 https://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten obejmuje niskie mikromolowe stężenia kompleksu (1-20 μM) w lotnym buforze, takim jak octan amonu (0,005 - 1 M, pH 6-8). Biorąc pod uwagę, że na kapilarnę nanoprzepływową zużywa się 1-2 μl, sugerujemy 10-20 μl jako minimalną objętość, aby umożliwić optymalizację warunków SM.

Część 1: Pozyskiwanie widma spektrometrii mas ruchliwości jonów

1. Ustaw spektrometr masowy na następujące tryby pracy: Mobility-TOF, akwizycja jonów dodatnich i tryb V.
2. Włącz wszystkie gazy (API, Trap i IMS). Używamy N₂ do separacji IM i Ar do pułapki/transferu. Zalecane wartości początkowe to 1,5 ml/min dla obszaru pułapki i przepływ gazu 24 ml/min dla urządzenia IMS.
3. Ustaw zakres akwizycji m/z. W przypadku nieznanego kompleksu białkowego sugerujemy początkowe zastosowanie szerokiego zakresu mas, który można następnie zredukować do pożądanych wartości. Równolegle dostosuj profil MS, aby uzyskać maksymalną wydajność transmisji. W przypadku dużych kompleksów zakres masy akwizycji należy ustawić w zakresie od 1 000 do 32 000 m/z, a profil MS na Auto. W przeciwnym razie profil można ustawić zgodnie z poniższą tabelą: m/z Zatrzymanie (%) Rampa (%) 960 szt. 10 20 3200 szt. Rozdział 30 Rozdział 40 Numer katalogowy: 10667    
4. Sprawdź ustawienie RF i w razie potrzeby dostosuj do wartości odpowiednich dla dużych kompleksów białkowych, a więc:   źródło pułapka Ims przelać Przesunięcie RF 450 szt. 380 szt. 380 szt. 380 szt. Wzmocnienie RF 0 0 0 0 Limit częstotliwości radiowych 450 szt. 380 szt. 380 szt. 380 szt.
5. Zastosuj napięcie kapilarne (1,050-1,400 V) i niskie ciśnienie nanoprzepływu (0,00-0,03 bara). Po rozpoczęciu natryskiwania spróbuj zmniejszyć ciśnienie nanoprzepływu do minimalnej wartości. Ponadto dostosuj położenie kapilary w stosunku do stożka.
6. Dostosuj parametry akwizycji MS, aby uzyskać dobrze rozdzielone widmo MS: gradient ciśnienia wzdłuż instrumentu i stożek próbkowania, a także stożek ekstrakcji, odchylenie, ustawienia pułapki i potencjału transferu powinny być zoptymalizowane (szczegółowo opisane w powiązanym protokole JoVE Kirshenbaum i in. 2009 https://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954). Chociaż parametry te są zależne od próbki, warunki, które zastosowaliśmy do uzyskania widm MS o różnych masach jonów, od peptydów po kompleksy białkowe, przedstawiono w tabeli 1 (patrz również rys. 1). Aby zminimalizować aktywację kompleksu, staraj się stopniowo zmniejszać (w krokach co ~ 10 V) stożek próbki, napięcia pułapki i polaryzacji bez zmiany położenia piku.
7. Po uzyskaniu optymalnego widma masowego należy dostosować profil czasu dryftu. Podczas analizy zespołów białkowych optymalne warunki zarówno do pomiarów masy, jak i ruchliwości są często niezgodne; Dlatego ważne jest, aby zachować odpowiednią równowagę między tymi dwoma. Ogólnie rzecz biorąc, wykres ruchliwości jonów powinien być zoptymalizowany w taki sposób, aby piki były rozłożone w całym zakresie czasu dryfu, a profil piku był gładki, zbliżając się do rozkładu Gaussa (rys. 2A, 2B). Znaczna asymetria pików może być związana ze słabą separacją wielu konformacji.
8. Zasadniczo można dostroić trzy parametry: prędkość fali T, wysokość fali T i natężenie przepływu gazu IMS, aby zoptymalizować separację ruchomości. Zwiększenie prędkości fali T poszerzy profil rozkładu czasu dryftu, podczas gdy zwiększone wartości wysokości fali T go zawęzi. Podobnie, zwiększenie przepływu gazu IMS przesunie profil czasu dryftu w kierunku wyższych wartości (minimalny przepływ gazu IMS powinien wynosić 10 ml/min). Sugerujemy pozostawienie dwóch z trzech dostępnych zmiennych stałych i optymalizację trzeciej do momentu, aż widmo IM zostanie dobrze rozdzielone (rys. 2B). W tym celu należy ustawić prędkość fali T i przepływ gazu odpowiednio na 250 m/s i 24 ml/min. Następnie, jako punkt wyjścia, ustaw wysokość fali T na 3 V i stopniowo zwiększaj ją w krokach co 1 V. Ogólnie rzecz biorąc, większe jony będą wymagały większych wysokości fal. Zazwyczaj nie ma potrzeby modyfikowania ciśnienia IMS; jednakże, gdy do strojenia wymagane są wysokie napięcia polaryzacji, zmniejszenie gazu IMS umożliwi obniżenie wartości napięcia polaryzacji, a co za tym idzie, zmniejszenie aktywacji kompleksu białkowego. Ogólnie rzecz biorąc, można osiągnąć maksymalną rozdzielczość 10-12 t/Δt.
9. Gdy warunki nie są zoptymalizowane (niska wysokość fali T lub wysoka prędkość fali T i/lub wysokie ciśnienie IM), jony nie będą skutecznie przechodzić przez urządzenie IM, a ich podróż może trwać dłużej niż czas wymagany do uwolnienia następnego pakietu jonów do komórki ruchomości. W rezultacie, nowy pakiet jonów zostanie uwolniony z regionu pułapki, zanim poprzedni pakiet zostanie dostarczony do regionu popychacza. Doprowadzi to do efektu "roll-over", w którym pik obserwowany w pierwszej części widma czasu dryfu jest identyczny z pikiem jonów na krawędzi ogona (rys. 2C). Ten artefakt można wyeliminować, zwiększając wysokość fali T oraz zmniejszając prędkość fali T i ciśnienie IMS. Ponadto czas uwalniania pułapki można regulować. Ponadto ważne jest, aby sprawdzić, czy wysokość fali T transferu jest ustawiona na co najmniej 5 V. Aby zapobiec wyciekowi jonów w kierunku celi IMS, zalecamy utrzymanie maksymalnej wysokości pułapki ruchowej na maksymalnym poziomie (30 V).
10. Niska prędkość i duża amplituda fal T transferu może prowadzić do "falowania" profilu rozkładu dryfu w czasie (rys. 2D). Ten artefakt występuje, gdy separacja ruchliwości jonów (czas przybycia/dryfu jonów) nie jest utrzymywana w regionach Transfer i ToF, ze względu na częściową synchronizację między częstotliwością popychacza a prędkością fali T. Aby wyeliminować ten efekt, należy dostosować czas pchania lub prędkość fali T transferu. Ponieważ częstotliwość popychacza jest związana z zakresem masy, ten artefakt może pojawić się ponownie, gdy ten parametr zostanie zmieniony. Wysokość fali T wywiera niewielki wpływ, chociaż jej zmniejszenie może również pomóc w wyeliminowaniu zmarszczek.
11. Po zoptymalizowaniu wyżej wymienionych parametrów można uzyskać dane IM-MS.

Część 2: Badanie przesiewowe warunków eksperymentalnych w celu zapewnienia pomiarów mobilności rodzimych struktur

Aby osiągnąć wysoce rozdzielcze piki MS, często aktywowane są kompleksy białkowe w spektrometrze masowym, aby ułatwić usuwanie resztek wody i składników buforowych¹¹. Jeśli jednak energia aktywacji wzrośnie powyżej wartości progowej, częściowe rozwinięcie może zostać wywołane, tworząc wiele stanów pośrednich¹², które prawdopodobnie nie odpowiadają natywnej strukturze stanu roztworu (rys. 3A-C). W rezultacie, pik czasowy dryfu może być przesuwany i poszerzany, co odzwierciedla niejednorodną populację rozwiniętych struktur.
Aby uzyskać dane dotyczące czasu dryftu zgodne ze strukturami fazy roztworu, konieczne jest dokładne kontrolowanie napięć używanych do przyspieszania jonów, przed separacją IM. Co więcej, w przypadku wysokiej rozdzielczości MS lepiej jest zwiększyć napięcie transferu niż pułapki. Gdy urządzenie IM jest ustawiane, najpierw następuje obszar transferu i analizator TOF, stąd aktywacja następuje po pomiarze IM, a jony pozostają nienaruszone, a dokładność MS można zwiększyć.

Aby sprawdzić, czy akwizycja danych odbywa się w warunkach, które utrzymują natywną strukturę kompleksu, zaleca się, aby dane były rejestrowane w różnych warunkach eksperymentalnych i rozwiązywania, a nie według jednego, zoptymalizowanego zestawu parametrów:

1. Zwiększaj napięcia kapilarne i stożkowe w sposób stopniowy, jednocześnie monitorując wpływ na widmo czasowe dryftu.
2. Podobnie jak w kroku 1, zwiększaj napięcie zderzenia pułapki w sposób stopniowy i zbieraj dane w odstępach 10 V.
3. Aby zidentyfikować rozwinięte konformacje i ocenić uzyskane dane, należy ręcznie wywołać dysocjację kompleksu białkowego poprzez miareczkowanie próbki kwasem octowym w zakresie pH 2-7 i zapisać dane (ryc. 3B).

Część 3: Korelacja między wartościami czasu dryfu a obszarami przekroju poprzecznego

W przeciwieństwie do konwencjonalnych pomiarów IM, w których zmierzone wartości czasu dryfu są liniowo powiązane z Ω, w systemie IMS T-wave pole przekroju poprzecznego jest definiowane metodą kalibracji. W ten sposób, zamiast pomiaru bezwzględnego, generowana jest względna korelacja wykładnicza między zmierzonymi czasami dryftu a Ω^1,13:

gdzie t_D to zmierzony czas dryfu, a X to stała proporcji, którą można wyprowadzić z krzywej kalibracyjnej. Kalibracja jest wykonywana poprzez pomiar czasów dryftu jonów o znanych Ω (mierzonych na podstawie konwencjonalnych eksperymentów IM).

1. Pomiary czasu dryftu są kalibrowane przy użyciu zdenaturowanych białek, cytochromu C koni, mioglobiny serca konia i ubikwityny bydlęcej o znanych przekrojach kolizyjnych. W tym celu należy przygotować roztwory 10 μM w proporcji objętościowej 49/49/2, woda/metanol/kwas octowy (stosowane odczynniki przedstawiono w tabeli 3).
2. Pozyskaj dane IM-MS dla białek kalibru w dokładnie tych samych warunkach, które są używane dla docelowego białka lub kompleksu białkowego: (Część 1). Wszystkie napięcia i wartości ciśnienia powinny być identyczne, aby zachować ustawienia separacji IM.
3. Dla każdego stanu naładowania białek kalibru wyodrębnić eksperymentalną wartość czasu dryftu (t_D) (opisaną w części 4).
4. Skoryguj każdy z czasów dryftu kalibru (t_D) (Tabela 2) za pomocą następującego równania: , gdzie m/z jest stosunkiem masy do ładunku obserwowanego jonu, a c jest współczynnikiem opóźnienia Enhanced Duty Cycle (EDC)¹. Jego wartość, zwykle z zakresu od 1,4 do 1,6, zależy od instrumentu. Wartość EDC jest wskazywana w menu System | Ustawienia pobierania | Zakładka Konfiguracja akwizycji.
5. Korzystając z bazy danych przekrojów prof. Davida Clemmera:
   http://www.indiana.edu/~clemmer/Research/cross section database/Proteins/protein_cs.htm¹⁴ popraw każdy z przekrojów kalibru zarówno dla stanu ładunku jonowego, jak i zredukowanej masy.
   , gdzie_{Ω C} jest skorygowanym przekrojem czynnym, Ω jest przekrojem literaturowym, z jest stanem ładunku jonowego, m jest masą cząsteczkową jonu kalibrantowego, a M_G jest masą cząsteczkową gazu tła IM (zwykle N₂).
6. Wykres In(t_D) w stosunku do In(Ω_C) (rys. 4A).
7. Otrzymana krzywa odpowiada następującemu równaniu: Parametry X i A można wyodrębnić, dopasowując wykres do zależności liniowej. Nachylenie X odpowiada wykładniczemu współczynnikowi proporcji, a A reprezentuje stałą określoną przez dopasowanie.
8. Oblicz współczynnik korelacji dopasowania r², korzystając z równania Pearsona: . Dopuszczalne wartości dla r² są większe niż 0,95 (rys. 4B). Niższa wartość współczynnika korelacji może wynikać z:
   
   1. Niepełne rozwinięcie się kalibrantów białkowych. Doprowadzi to do poszerzenia pików z powodu niejednorodnego składania się stanów pośrednich.
   2. Z naszego doświadczenia wynika, że postarzana próbka może pogorszyć widma IM.
   3. Odmienne warunki eksperymentalne stosowane dla białek o różnej kalibrze. W tym przypadku wykreślenie danych dla każdego białka z osobna powinno wygenerować różne współczynniki korelacji, choć każdy z nich powinien być wyższy niż 0,95.
   4. Zaszumione dane oraz nieprawidłowe wygładzanie i centrowanie rozkładu czasu dryftu.
   5. Błąd w obliczeniach.
9. Skoryguj czas dryftu kalibru za pomocą wyznaczonego współczynnika wykładniczego X, wyznaczonego w kroku 7:
10. W ramach walidacji należy ponownie wykreślić Ω_C w porównaniu z i zdefiniuj współczynnik korelacji. Należy spodziewać się wartości wyższych niż 0,95.
11. Zgodnie z procedurą opisaną w Kroku 4, skoryguj zmierzony czas dryftu docelowego białka lub kompleksu białkowego:
12. Skalibruj czas dryftu docelowego kompleksu białko/białko za pomocą czynnika wykładniczego X, zdefiniowanego w kroku 7:
13. Obliczyć Ω docelowego kompleksu białko/białko, używając stałej A określonej dla dopasowania, zdefiniowanej w kroku 7: .
14. Dla każdego warunku doświadczalnego kroki od 2 do 13 należy powtórzyć. Definiując pole przekroju poprzecznego nieznanego białka lub kompleksu białkowego, zalecamy, aby każdy eksperyment powtórzyć co najmniej trzy razy i określić odchylenie standardowe tych potrójnych pomiarów.

Część 4: Definiowanie wartości czasu dryfu

Wymagane oprogramowanie: MassLynx i Driftscope (Waters).

1. Otwórz widmo IM-MS za pomocą oprogramowania Driftscope.
2. Z menu głównego wybierz Widok i odznacz Chromatogram, Czas dryfu i Widmo (opcjonalnie), pozostawiając aktywną tylko mapę 2D wyświetlającą czas dryfu w funkcji m/z.
3. Na pasku menu wybierz kolejno opcje Wyświetlacz |Opcje |Wyświetl panel edytora i dostosuj wartości progu intensywności, aby zminimalizować szum tła (w większości przypadków to ustawienie można zdefiniować jako Min=30-40% i Max=100% zliczeń).
4. Wybierz Wyświetl |Skala intensywności mapy 2D, a pojawią się trzy opcje: Skala liniowa, Skala logarytmiczna i Skala pierwiastka kwadratowego. Wybór skali logarytmicznej (logarytmiczna transformacja danych) skompresuje kod koloru intensywności i umożliwi jednoczesne pojawienie się szerokiego zakresu intensywności (w przeciwieństwie do opcji liniowych i pierwiastków kwadratowych, przy których widoczne będą tylko najbardziej intensywne szczyty).
5. W panelu paska narzędzi kliknij przycisk Użyj narzędzia Zaznaczanie. Ta opcja aktywuje różne opcje wyboru i umożliwia wybór odpowiedniego regionu w spektrum. Najbardziej precyzyjnym narzędziem jest Enable Region of Interest Selections, za pomocą którego można narysować granicę wokół obszaru zainteresowania, wykluczając w ten sposób wszystkie zbędne dane i piki szumów. Podobnie, opcje Wybór ortogonalny i Wybór pasma są przydatne, gdy obszar zainteresowania nie jest otoczony nadmiarowymi szczytami.
6. Po wybraniu obszaru zainteresowania użyj polecenia Zaakceptuj bieżące zaznaczenie, aby usunąć niepotrzebne informacje.
7. Eksportuj dane do MassLynx, zachowując informacje o czasie dryfu.
8. W MassLynx otwórz chromatogram zapisanego widma czasowego dryfu i połącz przedziały czasowe. Odpowiednie widmo masowe otworzy się automatycznie.
9. Zastosuj funkcję wygładzania, definiując rozmiar okna i liczbę parametrów wygładzania (powinny być dostrojone specjalnie dla każdego widma, używając wartości minimalnych).
10. W razie potrzeby zastosuj odejmowanie linii bazowej.
11. Wyśrodkuj widmo i zmierz masę, aby potwierdzić tożsamość białka i dokładność masy.
12. Dla każdego stanu naładowania połącz zakres m/z. Automatycznie pojawi się odpowiednie spektrum czasowe dryfu. Wygładź i wyśrodkuj profil czasu dryfu, a następnie zdefiniuj wartość czasu dryfu, wskazując środek ciężkości każdego szczytu.

Część 5: Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie instrumentu Synapt HDMS wskazujące główne parametry przestrajalne akwizycji IMS-MS. Parametry eksperymentalne używane do pomiarów IM-MS są oznaczone zgodnie z ich położeniem w przyrządzie. Wiązka jonów jest pokolorowana na czerwono, a ciśnienie w każdym regionie jest oznaczone za pomocą kodu kolorystycznego. Panel na spodzie ilustruje gradient potencjału wzdłuż instrumentu oraz różnice potencjałów definiujące energie zderzeń pułapki i transferu, a także potencjał polaryzacji. Odczyty zwrotne wszystkich potencjałów są odnoszone do statycznego napięcia niezrównoważenia, które zwykle jest ustawione na 120 V.

Rysunek 2. Rozkłady czasu przybycia ruchliwości jonów dla białka Gβυ.

A. Wysoka prędkość fali T prowadzi do wąskiego rozkładu profilu czasowego dryfu. Wykres ilustruje rozkład czasu przybycia stanów ładunku 16+ (czerwony), 15+ (zielony), 14+ (niebieski) i 13+ (magenta), a także całkowity profil czasu dryfu (w kolorze czarnym) białka G_βυ.

B. Zoptymalizowane widmo czasu dryfu z gładkim kształtem piku Gaussa. Etykiety w podobnych kolorach jak w A.

C. Efekt "przetaczania", który występuje, gdy czas potrzebny jonom na przejście przez komórkę ruchomości jest dłuższy niż odstęp między wstrzyknięciami nowych pakietów jonów do urządzenia. W rezultacie, rozszerzony szczyt czasu dryfu pojawia się na początku spektrum. Efekt ten można wyeliminować, zwiększając wysokość fali T i zmniejszając prędkość fali T i ciśnienie IMS.

D. Sztuczne "tętnienia" powstają, gdy prędkość fali T transferu i częstotliwość popychacza są częściowo zsynchronizowane. Efekt ten można przezwyciężyć, dostosowując częstotliwość popychacza lub prędkość fali T transferu.

Rysunek 3. Wpływ warunków aktywacji jonów i częściowej denaturacji na widma IM-MS hemoglobiny. Wykres czasu dryftu w funkcji m/z dla kompleksu hemoglobiny tetramerycznej, przy użyciu wodnego roztworu 10 mM octanu amonu (pH = 7,6) (A, C) i dodatku 0,1 % kwasu octowego (B). Dane uzyskane przy użyciu napięcia energii zderzenia pułapki 13 V (A, B) i 35 V (C) Chociaż we wszystkich trzech panelach widmo masowe (rzutowane na górze) wygląda podobnie, z szeregiem ładunków tetramerycznych wyśrodkowanym na 4000 m/z, profil czasowy dryfu (rzutowany po bokach) jest inny (całkowity rozkład czasu dryfu jest zaznaczony na czarno, a profil 16+ jest w kolorze czerwonym). Dłuższy czas dryftu częściowo zdenaturowanej próbki, otrzymanej w B, oraz jonów aktywowanych w fazie gazowej, otrzymanych w C, wskazuje na pewien stopień rozwinięcia. Obserwacja ta pokazuje, że nawet jeśli zmierzona masa odpowiada nienaruszonemu kompleksowi, jego struktura roztworu jest zaburzona. W związku z tym konieczna jest dokładna kontrola warunków doświadczalnych.

Rysunek 4. Generując krzywą kalibracyjną, można skorelować pomiary czasu dryftu i przekroje poprzeczne kolizji.

A. Zmierzone wartości czasu dryftu wielokrotnych stanów naładowania cytochromu C koni (okręgi), mioglobiny serca konia (trójkąty) i bydlęcej ubikwityny (kwadraty) zestawiono z wartościami Ω literaturowej skorygowanymi zarówno o stan ładunku jonowego, jak i zredukowaną masę. Dopasowanie daje funkcję liniową odpowiadającą: ln(Ω_C )=Xln(t_D')+A. Wyznaczony współczynnik wykładniczy (X), stała dopasowania (A) i współczynnik korelacji są wyświetlane na wykresie dla danych uzyskanych przy prędkości fali T 350 m/s i statycznej wysokości fali 11 V. B. Histogram rozkładów współczynników korelacji uzyskany z 10 kolejnych eksperymentów kalibracyjnych.

Próbka białka / Parametry techniczne GluFibrino-
peptyd
monomer
1,6 kDa Mioglobina

monomer
17 kDa Hemoglobina

tetramer
67 kDa Transferyna

monomer
80 kDa GroEL

14-mer
801 kDa Ciśnienie docisku, mBar 4.4 5.0 5.1 5.1 6,5 Ciśnienie syfonu, mBar Wymiary: 1,6x10-2 Rozmiar: 2,4x10-2 Rozmiar: 2,4x10-2 Wymiary: 2,6x10-2 Wymiary: 2,8x10-2 Ciśnienie IMS, mBar Wymiary: 4,4x10-1 Wymiary: 4,4x10-1 Wymiary: 4,4x10-1 Wymiary: 4,4x10-1 4,2x10-1 szt. Napięcie stożka próbkowania, V Rozdział 46 Rozdział 80 Rozdział 80 Rozdział 80 Rozdział 118 Napięcie stożka ekstrakcyjnego, V Pytanie 1.7 1 1 1 3 Napięcie polaryzacji, V 20 20 25 25 50 Rozdział Energia zderzenia pułapki, V 20 15 15 15 Rozdział 80 Przenieś energię zderzenia, V 5 12 12 12 15

Tabela 1. Warunki eksperymentalne stosowane do analizy makrocząsteczek.

Białko standardowe Masa cząsteczkowa (m) Opłaty (z) m/z Przekrój kolizji (w 2) Cytochrom C Numer katalogowy: 12213 10 1222.3 2226 TGL     11 1111.3 2303 TGL     12 1018.8 2335 TGL     13 940,5 pkt. 2391 szt.     14 873.4 2473 TGL     15 815.2 2579 TGL     16 764,3 pkt. 2679 TGL     17 719,4 pkt. 2723 TGL     Rozdział 18 679,5 pkt. 2766 TGL   Mioglobiny Numer katalogowy: 16952 11 1542,1 szt. 2942 TGL     12 1413,7 TGL 3044 TGL     13 1305.0 3136 SZT.     14 1211,9 szt. Numer katalogowy: 3143     15 1131.1 3230 TGL     16 1060,5 szt. 3313 SZT.     17 998,2 zł 3384 TGL     Rozdział 18 942,8 pkt. Numer katalogowy: 3489     Rozdział 19 893.2 Numer katalogowy: 3570 TGL     20 848,6 3682 TGL     21 808.2 3792 TGL     22 Rozdział 22 771,6 pkt. Numer katalogowy: 3815   Ubikwityna Numer katalogowy: 8565 8 1071,6 TGL 1442 SZT.     8 1071,6 TGL Rok 1622     9 952,7 TGL Rok 1649     10 857,5 KM Rok 1732     11 779,6 pkt. Rok 1802

Tabela 2. Wartości białek kalibru i ich przekrojów czynnych wyznaczone za pomocą konwencjonalnych pomiarów IMS¹⁴.

Urządzeń firma Numer katalogowy Generator RF Synapt HDMS-32K Wody Sp. z o.o.   P-97 Flaming-Brązowy ściągacz do mikropipet Instrumenty Sutter P- 97 Powlekarka napylająca Nauki o mikroskopii elektronowej EMS550 Mikroskop dwuokularowy Nikon   Odczynniki firma Numer katalogowy Octan amonu Sigma- Aldrich Sigma, A2706 CsI 99,999% Sigma- Aldrich Aldrich, 203033 metanol Sigma- Aldrich Fluka, 34966 kwas octowy Fisher Naukowy AC12404 Mioglobina koni (z serca konia) Sigma- Aldrich Zobacz materiał M1882 Cytochrom c koni (z serca konia) Sigma- Aldrich Zobacz materiał C-2506 Ubikwityna bydlęca (z czerwonych krwinek) Sigma- Aldrich U6253 powiedział: hemoglobina Sigma- Aldrich Zobacz materiał H2625 gaz Komentarze Azot o czystości 99,999% 8 metr sześcienny cylindra Argon, czystość 99,999% 8.8 metrów sześciennych

Tabela 3. Odczynniki i sprzęt.

Discussion

Opisany tu protokół umożliwia zdefiniowanie przekroju zderzenia białek lub kompleksów białkowych o nieznanej strukturze trójwymiarowej, w celu dostarczenia informacji o ich ogólnym kształcie, upakowaniu podjednostek i topologii. W tym celu, po przedstawieniu wartości przekrojów kolizyjnych, konieczne jest przekształcenie tych wartości w szczegóły konstrukcyjne. Proces ten wymaga dodatkowych wysiłków eksperymentalnych, a także analizy obliczeniowej, które zostały pokrótce omówione poniżej.

Na początek zaleca się analizę białek lub kompleksów białkowych o znanej strukturze. Pomiary te mogą zapewnić użyteczną kontrolę jakości metodologii i umożliwią ocenę dokładności parametrów akwizycji poprzez porównanie teoretycznych i zmierzonych wartości Ω. Teoretyczne pola przekroju czynnego można obliczyć na podstawie współrzędnych struktury krystalicznej za pomocą oprogramowania MOBCAL^15,16 , które jest oprogramowaniem opartym na otwartym kodzie źródłowym w języku FORTRAN, umożliwiającym edycję kodu zgodnie z potrzebami operatora. Do przeprowadzenia takich obliczeń wymagane jest zmodyfikowanie programu w taki sposób, aby liczba obliczeń iteracyjnych wykonywanych na strukturę wejściową była zwiększona i aby akceptowane były pliki współrzędnych zawierające dużą liczbę atomów¹.

Niedawno zaproponowano strategię IM-MS do definiowania układów topologicznych podjednostek w zespołach wieloskładnikowych^4,6. Metoda polega na monitorowaniu szlaków dysocjacji zespołów białkowych na mniejsze składniki. Dysocjację tę uzyskuje się poprzez kontrolowane dostosowanie warunków fazy roztworu, co powoduje rozkład podkompleksów odzwierciedlających "bloki budulcowe" zespołów. Jednoczesny pomiar wartości Ω zarówno nienaruszonego kompleksu, jak i produktów demontażu generuje ograniczenia strukturalne, które są następnie wykorzystywane do obliczania modeli topologicznych kompleksów białkowych. Podstawowym założeniem leżącym u podstaw tej metodologii jest to, że wygenerowane podkompleksy zachowują swoje natywne potwierdzenia, a ostatnie badania wykazały, że struktura roztworu produktów demontażu jest zachowana i nie doszło do większych przegrupowań ani w fazie roztworu, ani w fazie gazowej^4,6.

Ostatnim krokiem w przypisywaniu struktury czwartorzędowej jonom kompleksu białkowego w fazie gazowej jest dopasowanie wartości przekroju czynnego zderzenia do modeli generowanych komputerowo. Metody modelowania są stosowane w celu zbadania różnych możliwych układów topologicznych podjednostek, a ich wartości Ω in silico są obliczane i porównywane z wartościami eksperymentalnymi. Obecnie stosuje się tylko kilka podejść obliczeniowych, takich jak metoda gruboziarnista typu kulowego, która przybliża średnicę podjednostek^1,8. Ogólnie rzecz biorąc, dziedzina ta jest wciąż w początkowych latach i konieczny jest dalszy rozwój, aby podejście to było ogólne i miało zastosowanie do szerokiego zakresu kompleksów.