Spektrometria mas sprzężona z mobilnością jonów to rozwijająca się technologia fazy gazowej, która rozdziela jony na podstawie ich przekroju czynnego zderzeń oraz masy. Metoda ta dostarcza trójwymiarowych informacji o ogólnej topologii i kształcie kompleksów białkowych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podstawową procedurę konfiguracji i optymalizacji instrumentu, kalibracji czasów dryfu oraz interpretacji danych.
Artykuł metodologiczny
Spektrometria mas z mobilnością jonów w polu falowym T: podstawowe procedury eksperymentalne w analizie kompleksów białkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mobilność jonowa (IM) jest metodą mierzącą czas, w jakim jon przemieszcza się przez komorę pod ciśnieniem pod wpływem słabego pola elektrycznego. Prędkość, z jaką jony pokonują obszar dryfu, zależy od ich wielkości: duże jony ulegają większej liczbie zderzeń z gazem obojętnym w tle (zazwyczaj N2), przez co przemieszczają się przez urządzenie IM wolniej niż jony o mniejszym przekroju. W ujęciu ogólnym czas migracji jonów przez gęstą fazę gazową pozwala na ich rozdzielenie zgodnie z ich przekrojem zderzeniowym (Ω).
Niedawno spektrometrię IM połączono ze spektrometrią mas, w wyniku czego wprowadzono do użytku spektrometr mas z mobilnością jonową (IM-MS) Synapt wykorzystujący falę wędrującą (T-wave). Integracja spektrometrii mas z mobilnością jonową umożliwia dodatkowy wymiar separacji i definiowania próbki, co daje widmo trójwymiarowe (stosunek masy do ładunku, intensywność oraz czas dryfu). Ta technika separacji pozwala na zmniejszenie nakładania się widm i umożliwia rozdzielenie heterogenicznych kompleksów o bardzo zbliżonej masie lub stosunkach masy do ładunku, ale różnych czasach dryfu. Co więcej, pomiary czasu dryfu dostarczają ważnej warstwy informacji strukturalnych, ponieważ Ω jest powiązane z ogólnym kształtem i topologią jonu. Korelację między zmierzonymi wartościami czasu dryfu a Ω oblicza się za pomocą krzywej kalibracyjnej wygenerowanej z białek kalibracyjnych o zdefiniowanych przekrojach1.
Potencjał podejścia IM-MS tkwi w możliwości określenia upakowania podjednostek oraz ogólnego kształtu kompleksów białkowych w stężeniach mikromolarnych i w warunkach zbliżonych do fizjologicznych1. Kilka niedawnych badań IM dotyczących zarówno pojedynczych białek2,3, jak i niekowalencyjnych kompleksów białkowych4-9, z powodzeniem wykazało, że czwartorzędowa struktura białek jest zachowana w fazie gazowej, oraz podkreśliło potencjał tej metody w badaniu kompleksów białkowych o nieznanej geometrii. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy opis analizy IMS-MS kompleksów białkowych z wykorzystaniem instrumentu Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS (Waters Ltd; jedynego obecnie dostępnego komercyjnie instrumentu IM-MS)10. Opisujemy podstawowe kroki optymalizacji, kalibrację przekrojów czynnych zderzeń oraz metody przetwarzania i interpretacji danych. Ostatni etap protokołu omawia metody obliczania teoretycznych wartości Ω. Ogólnie rzecz biorąc, protokół nie ma na celu wyczerpania każdego aspektu charakterystyki kompleksów białkowych metodą IM-MS; jego celem jest wprowadzenie nowych badaczy w tej dziedzinie w praktyczne aspekty tej metody.
Protokół
Opisana przez nas procedura koncentruje się wyłącznie na analizie kompleksów białkowych za pomocą IM-MS. Dlatego sugerujemy, aby badacze nieznający dziedziny strukturalnej spektrometrii mas zapoznali się z etapami przygotowania próbek, kalibracją instrumentów oraz procedurami optymalizacji MS i tandemowej MS opisanymi w pracy Kirshenbaum et al. 2009 https://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954. W ujęciu ogólnym protokół ten wymaga niskich stężeń mikromolowych kompleksu (1-20 μM) w buforze lotnym, takim jak octan amonu (0,005 - 1 M, pH 6-8). Biorąc pod uwagę, że na jedną kapilarę nanoflow zużywa się 1-2 μl, sugerujemy objętość minimalną 10-20 μl, aby umożliwić optymalizację warunków MS.
Część 1: Pozyskiwanie widma spektrometrii mas z mobilnością jonów
- Ustaw spektrometr mas w następujących trybach pracy: Mobility-TOF, akwizycja jonów dodatnich oraz tryb V.
- Włącz wszystkie gazy (API, pułapkę i IMS). Używamy N22 do separacji IM oraz Ar dla pułapki/transferu. Zalecane wartości początkowe to 1,5 ml/min dla obszaru pułapki oraz przepływ gazu 24 ml/min dla urządzenia IMS.
- Ustaw zakres akwizycji m/z. W przypadku nieznanego kompleksu białkowego zalecamy początkowe zastosowanie szerokiego zakresu mas, który następnie można zredukować do pożądanych wartości. Równolegle należy dostosować profil MS w celu uzyskania maksymalnej wydajności transmisji. Dla dużych kompleksów zakres akwizycji masy powinien zostać ustawiony w przedziale 1 000–32 000 m/z, a profil MS na Auto. W przeciwnym razie profil można ustawić zgodnie z poniższą tabelą:
m/z czas przebywania (%) rampa (%) 960 10 20 3200 30 40 10667 - Sprawdź ustawienie RF i w razie potrzeby dostosuj je do wartości odpowiednich dla dużych kompleksów białkowych, w następujący sposób:
Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Pułapka IMS Transfer Przesunięcie RF 450 380 380 380 Wzmocnienie RF 0 0 0 0 Limit RF 450 380 380 380 - Przyłożyć napięcie kapilarne (1 050–1 400 V) i niskie ciśnienie nanoprzepływu (0,00–0,03 bar). Po zainicjowaniu rozpylania należy spróbować zredukować ciśnienie nanoprzepływu do minimalnej wartości. Dodatkowo należy dostosować położenie kapilary względem stożka.
- Dostosuj parametry akwizycji MS, aby uzyskać dobrze rozdzielone widmo MS: należy zoptymalizować gradient ciśnienia wzdłuż instrumentu, stożek próbkowania oraz stożek ekstrakcji, ustawienia bias, potencjały pułapki (Trap) i transferu (Transfer) (szczegóły znajdują się w powiązanym protokole JoVE Kirshenbaum) i wsp. 2009 https://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954). Choć parametry te zależą od próbki, warunki zastosowane do pozyskiwania widm MS dla różnych mas jonów, od peptydów po kompleksy białkowe, przedstawiono w Tabeli 1 (patrz również Rys. 1). Aby zminimalizować aktywację kompleksu, należy stopniowo obniżać (w krokach ok. 10 V) napięcia stożka próbkowania (sample cone), pułapki (Trap) oraz napięcie polaryzujące (bias), nie zmieniając położenia piku.
- Po uzyskaniu optymalnego widma mas należy dostosować profil czasu dryfu. Podczas analizy kompleksów białkowych optymalne warunki dla pomiarów masy i mobilności są często niekompatybilne; dlatego istotne jest znalezienie odpowiedniego kompromisu między tymi dwoma parametrami. Ogólnie rzecz biorąc, wykres mobilności jonów powinien zostać zoptymalizowany w taki sposób, aby piki były rozłożone w całym zakresie czasu dryfu, a profil piku był gładki i zbliżony do rozkładu Gaussa (Rys. 2A, 2B). Znaczna asymetria piku może wynikać ze słabej rozdzielczości wielu konformacji.
- Zasadniczo do optymalizacji rozdziału według mobilności można dostroić trzy parametry: prędkość fali T (T-wave velocity), wysokość fali T (T-wave height) oraz szybkość przepływu gazu w IMS. Zwiększenie prędkości fali T poszerzy profil rozkładu czasu dryfu, natomiast zwiększenie wartości wysokości fali T go zawęzi. Analogicznie, zwiększenie przepływu gazu w IMS przesunie profil czasu dryfu w stronę wyższych wartości (minimalny przepływ gazu w IMS powinien wynosić 10 ml/min). Sugerujemy pozostawienie dwóch z trzech dostępnych zmiennych na stałym poziomie i optymalizację trzeciej do momentu uzyskania dobrze rozdzielonego widma IM (Rys. 2B). W tym celu należy ustawić prędkość fali T na 250 m/s oraz przepływ gazu na 24 ml/min. Następnie, jako punkt wyjścia, należy ustawić wysokość fali T na 3 V i stopniowo zwiększać ją w przyrostach o 1 V. Generalnie większe jony wymagają większych wysokości fal. Zazwyczaj nie ma potrzeby modyfikowania ciśnienia w IMS; jednak w przypadku konieczności zastosowania wysokich napięć polaryzujących (bias voltages) w celu dostrojenia, zmniejszenie ilości gazu w IMS pozwoli na obniżenie wartości napięcia polaryzującego, a w konsekwencji na ograniczenie aktywacji kompleksów białkowych. Ogólnie można osiągnąć maksymalną rozdzielczość na poziomie 10-12 t/Δt.
- W przypadku braku optymalizacji warunków (niska amplituda fali T, wysoka prędkość fali T i/lub wysokie ciśnienie w komorze IM), jony nie będą przemieszczać się przez urządzenie IM w sposób efektywny, a ich droga może zająć więcej czasu, niż jest wymagane do uwolnienia kolejnego pakietu jonów do komory mobilności. W konsekwencji nowy pakiet jonów zostanie uwolniony z obszaru pułapki (Trap), zanim poprzedni pakiet dotrze do obszaru wypychacza (pusher). Doprowadzi to do efektu „nakładania się” (roll-over), w którym piki obserwowane w pierwszej części widma czasu dryfu są identyczne z pikami jonów znajdujących się na krawędzi spływu (Rys. 2C). Artefakt ten można wyeliminować poprzez zwiększenie amplitudy fali T oraz zmniejszenie prędkości fali T i ciśnienia w IMS. Dodatkowo można dostosować czas uwalniania z pułapki (Trap release time). Ponadto istotne jest zweryfikowanie, czy amplituda fali T w obszarze transferu (Transfer T-wave height) jest ustawiona na co najmniej 5 V. Aby zapobiec wyciekowi jonów do komory IMS, zaleca się utrzymywanie maksymalnego poziomu amplitudy pułapki mobilności (30 V).
- Niska prędkość i wysoka amplituda fal przenoszących (Transfer T-waves) mogą prowadzić do powstawania „zmarszczek” (rippling) w profilu rozkładu czasu dryfu (Rys. 2D). Artefakt ten występuje, gdy rozdzielenie jonów ze względu na ich ruchliwość (czas przybycia/dryfu jonów) nie zostaje zachowane w regionach Transfer i ToF, co wynika z częściowej synchronizacji częstotliwości pushera z prędkością fal przenoszących. Aby wyeliminować ten efekt, należy dostosować czas pushera lub prędkość fal przenoszących. Ponieważ częstotliwość pushera jest powiązana z zakresem mas, artefakt ten może pojawić się ponownie po zmianie tego parametru. Wysokość fal T-wave ma niewielki wpływ, choć jej zmniejszenie może również pomóc w eliminacji zmarszczek.
- Po zoptymalizowaniu wyżej wymienionych parametrów można przystąpić do pozyskiwania danych IM-MS.
Część 2: Przesiewowe badanie warunków eksperymentalnych w celu zapewnienia pomiarów mobilności struktur natywnych
Aby uzyskać wysoką rozdzielczość pików MS, kompleksy białkowe są często aktywowane wewnątrz spektrometru mas, co ma na celu usunięcie resztkowej wody i składników buforu11. Jeśli jednak energia aktywacji zostanie zwiększona powyżej wartości progowej, może dojść do częściowego rozfałdowania, prowadząc do powstania wielu stanów pośrednich12, które prawdopodobnie nie odpowiadają natywnej strukturze w stanie roztworu (Rys. 3A-C). W rezultacie pik czasu dryfu może ulec przesunięciu i poszerzeniu, co odzwierciedla heterogenną populację struktur rozfałdowanych.
Aby uzyskać dane dotyczące czasu dryfu spójne ze strukturami w fazie roztworu, niezbędna jest staranna kontrola napięć stosowanych do przyspieszania jonów przed separacją IM. Ponadto, dla uzyskania wysokiej rozdzielczości MS preferowane jest zwiększenie napięcia Transfer zamiast napięcia Trap. Ponieważ urządzenie IM jest rozmieszczone przed obszarem Transfer i analizatorem TOF, aktywacja następuje po pomiarze IM i jony pozostają niezakłócone, podczas gdy dokładność MS może zostać zwiększona.
Aby potwierdzić, że akwizycja danych odbywa się w warunkach utrzymujących natywną strukturę kompleksu, zaleca się rejestrowanie danych w zakresie różnych warunków eksperymentalnych i roztworów, zamiast opierać się na pojedynczym, zoptymalizowanym zestawie parametrów:
- Stopniowo zwiększać napięcia kapilary i stożka, monitorując ich wpływ na widmo czasu dryfu.
- Podobnie jak w kroku 1, stopniowo zwiększać napięcie kolizyjne pułapki (Trap collision voltage), zbierając dane w odstępach 10 V.
- W celu zidentyfikowania rozfałdowanych konformacji i oceny uzyskanych danych, manualnie wywołać dysocjację kompleksu białkowego poprzez miareczkowanie próbki kwasem octowym w zakresie pH od 2-7 i zarejestrować dane (Rys. 3B).
Część 3: Korelacja między wartościami czasu dryfu a powierzchniami przekroju poprzecznego
W przeciwieństwie do konwencjonalnych pomiarów IM, w których mierzone wartości czasu dryfu są liniowo powiązane z Ω, w systemie T-wave IMS pole przekroju poprzecznego jest definiowane za pomocą podejścia kalibracyjnego. W związku z tym, zamiast pomiaru bezwzględnego, generowana jest względna korelacja wykładnicza między zmierzonymi czasami dryfu a Ω1,13: 
gdzie tD to zmierzony czas dryfu, a X to stała proporcjonalności, którą można wyznaczyć z krzywej kalibracyjnej. Kalibrację przeprowadza się poprzez pomiar czasów dryfu jonów o znanej wartości Ω (wyznaczonej w konwencjonalnych eksperymentach IM).
- Pomiary czasu dryfu kalibruje się przy użyciu zdenaturowanych białek — konnego cytochromu C, mioglobiny z serca konia oraz bydlubiego ubikwityny — o znanych przekrojach czynnych zderzeń. W tym celu należy przygotować roztwory o stężeniu 10 μM w mieszaninie woda/metanol/kwas octowy w stosunku objętościowym 49/49/2 (użyte odczynniki przedstawiono w Tabeli 3).
- Należy zebrać dane IM-MS dla białek kalibracyjnych w dokładnie tych samych warunkach instrumentalnych, które zastosowano dla białka docelowego lub kompleksu białkowego:
(Część 1). Wszystkie wartości napięć i ciśnień powinny być identyczne, aby zachować ustawienia rozdziału IM. - Dla każdego stanu ładunku białek kalibracyjnych należy wyodrębnić eksperymentalną wartość czasu dryfu (tD) (opisano w Części 4).
- Każdy z czasów dryfu kalibratorów (tD) (Tabela 2) należy skorygować za pomocą następującego równania:
, gdzie m/z jest stosunkiem masy do ładunku obserwowanego jonu, a c jest współczynnikiem opóźnienia Enhanced Duty Cycle (EDC)1. Jego wartość, zazwyczaj między 1,4 a 1,6, zależy od instrumentu. Wartość EDC jest wskazana w zakładce System | Acquisition Settings | Acquisition Setup. - Korzystając z Bazy Danych Przekrojów prof. Davida Clemmera:
http://www.indiana.edu/~clemmer/Research/cross%20section%20database/Proteins/protein_cs.htm14 należy skorygować przekrój każdego z kalibratorów pod kątem stanu ładunku jonu oraz masy zredukowanej.
, gdzie ΩC to skorygowany przekrój, Ω to przekrój z literatury, z to stan ładunku jonu, m to masa cząsteczkowa jonu kalibratora, a MG to masa cząsteczkowa gazu tła IM (zazwyczaj N2). - Należy nanieść In(tD) w funkcji In(ΩC) (Rys. 4A).
- Otrzymana krzywa odpowiada następującemu równaniu:
Parametry X i A można wyznaczyć poprzez dopasowanie wykresu do zależności liniowej. Nachylenie X odpowiada wykładniczemu czynnikowi proporcjonalności, a A reprezentuje stałą wyznaczoną z dopasowania. - Obliczyć współczynnik korelacji dopasowania r2, korzystając z równania Pearsona:
. Akceptowalne wartości r2 są większe niż 0,95 (Rys. 4B). Niższa wartość współczynnika korelacji może wynikać z:
- Niepełnego rozfałdowania białek kalibracyjnych. Prowadzi to do poszerzenia piku z powodu heterogenicznej obecności stanów pośrednich.
- W naszym doświadczeniu stara próbka może pogorszyć widma IM.
- Zastosowania różnych warunków eksperymentalnych dla różnych białek kalibracyjnych. W takim przypadku naniesienie danych dla każdego białka osobno powinno dać różne współczynniki korelacji, przy czym każdy z nich powinien być wyższy niż 0,95.
- Zaszumionych danych oraz nieprawidłowego wygładzania i centrowania rozkładu czasu dryfu.
- Błędu obliczeniowego.
- Ponownie skorygować czas dryfu kalibratora, używając wyznaczonego czynnika wykładniczego X z kroku 7:
- W ramach etapu walidacji należy ponownie nanieść ΩC w funkcji
i wyznaczyć współczynnik korelacji. Oczekiwane są wartości wyższe niż 0,95. - Zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4, należy skorygować zmierzony czas dryfu białka docelowego lub kompleksu białkowego:
- Zkalibrować czas dryfu białka/kompleksu białkowego docelowego, używając czynnika wykładniczego X zdefiniowanego w kroku 7:
- Obliczyć Ω białka/kompleksu białkowego docelowego, korzystając ze stałej wyznaczonej z dopasowania A zdefiniowanej w kroku 7:
. - Kroki od 2 do 13 należy powtórzyć dla każdego zestawu warunków eksperymentalnych. Przy wyznaczaniu pola przekroju czynnego nieznanego białka lub kompleksu białkowego zalecamy powtórzenie każdego eksperymentu co najmniej trzy razy i wyznaczenie odchylenia standardowego tych pomiarów potrójnych.
Część 4: Definiowanie wartości czasu dryfu
Wymagane oprogramowanie: MassLynx oraz Driftscope (Waters).
- Otwórz widmo IM-MS za pomocą oprogramowania Driftscope.
- Z menu głównego wybierz View i odznacz Chromatogram, Drift Time oraz Spectrum (opcjonalnie), pozostawiając aktywną jedynie mapę 2D wyświetlającą czas dryfu w funkcji m/z.
- Z paska menu wybierz Display | Options | Display Editor Panel i dostosuj wartości Intensity Threshold, aby zminimalizować szum tła (w większości przypadków ustawienie to można zdefiniować jako Min=30-40% i Max=100% counts).
- Wybierz Display | 2D Map Intensity Scale; pojawią się trzy opcje: Linear Scale, Log Scale oraz Square Root Scale. Wybór Log Scale (logarytmiczna transformacja danych) skompresuje kod kolorystyczny intensywności i umożliwi jednoczesne wyświetlenie szerokiego zakresu intensywności (w przeciwieństwie do opcji liniowej i pierwiastka kwadratowego, w których widoczne będą tylko najintensywniejsze piki).
- Z panelu paska narzędzi użyj przycisku Selection Tool. Opcja ta aktywuje różne możliwości zaznaczania i umożliwi wybór odpowiedniego obszaru w widmie. Najbardziej precyzyjnym narzędziem jest Enable Region of Interest Selections, za pomocą którego można narysować obramowanie wokół obszaru zainteresowania, wykluczając tym samym wszystkie niepotrzebne dane i piki szumu. Podobnie, opcje Orthogonal oraz Band Selection są przydatne, gdy obszar zainteresowania nie jest otoczony nadmiarowymi pikami.
- Po wybraniu obszaru zainteresowania użyj komendy Accept Current Selection, aby usunąć niepotrzebne informacje.
- Wyeksportuj dane do programu MassLynx, zachowując informacje o czasie dryfu.
- W programie MassLynx otwórz chromatogram zapisanego widma czasu dryfu i połącz przedziały czasowe (time bins). Odpowiednie widmo masowe otworzy się automatycznie.
- Zastosuj funkcję wygładzania (smoothening), definiując rozmiar okna oraz liczbę parametrów wygładzania (powinny być one dostosowane indywidualnie do każdego widma, przy użyciu minimalnych wartości).
- W razie potrzeby zastosuj odejmowanie linii bazowej (baseline subtraction).
- Wycentruj widmo i zmierz masę, aby potwierdzić tożsamość białka i dokładność masy.
- Dla każdego stanu ładunku połącz zakres m/z. Odpowiednie widmo czasu dryfu pojawi się automatycznie. Wygładź i wycentruj profil czasu dryfu, a następnie określ wartość czasu dryfu, wskazując centroid każdego piku.
Część 5: Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja instrumentu Synapt HDMS wskazująca główne parametry regulowane podczas akwizycji IMS-MS. Parametry eksperymentalne stosowane do pomiarów IM-MS są oznaczone zgodnie z ich położeniem wewnątrz instrumentu. Wiązka jonów zaznaczona jest kolorem czerwonym, a ciśnienie w każdym regionie określono za pomocą kodu kolorystycznego. Panel na dole ilustruje gradient potencjału wzdłuż instrumentu oraz różnice potencjałów definiujące energie kolizyjne pułapki (Trap) i transferu (Transfer), a także potencjał polaryzujący (Bias). Wszystkie odczyty potencjałów są odnoszone do statycznego napięcia przesunięcia (Static Offset), które zazwyczaj ustawia się na 120V.
Rysunek 2. Rozkłady czasów dotarcia w spektrometrii mobilności jonowej dla białka Gβυ.
A. Wysoka prędkość fali T prowadzi do wąskiego rozkładu profilu czasu dryfu. Wykres przedstawia rozkład czasu przybycia stany ładunkowe 16+ (czerwony), 15+ (zielony), 14+ (niebieski) i 13+ (magenta), a także całkowity profil czasu dryfu (na czarno) dla Gβυ białko
B. Zoptymalizowane widmo czasu dryfu z gładkim, gaussowskim kształtem piku. Etykiety kolorystyczne analogiczne do tych w A.
C. Efekt „przesunięcia” (tzw. roll-over effect), który występuje, gdy czas przejścia jonów przez komórkę mobilności jest dłuższy niż odstęp czasowy między wtryskami nowych paczek jonowych do urządzenia. W rezultacie wydłużony pik czasu dryfu pojawia się na początku widma. Efekt ten można wyeliminować poprzez zwiększenie wysokości fali T (T-wave height) oraz zmniejszenie prędkości fali T i ciśnienia w IMS.
D. Sztuczne „zmarszczki” powstają, gdy prędkość fali T transferowej i częstotliwość przetłaczania są częściowo zsynchronizowane. Efekt ten można wyeliminować poprzez dostrojenie częstotliwości przetłaczania lub prędkości fali T transferowej.
Rysunek 3. Wpływ aktywacji jonów i warunków częściowej denaturacji na widma IM-MS hemoglobiny. Wykres czasu dryfu w funkcji m/z dla tetramerycznego kompleksu hemoglobiny, z wykorzystaniem wodnego roztworu 10 mM octanu amonu (pH=7,6) (A, C) oraz z dodatkiem 0,1 % kwasu octowego (B). Dane pozyskano przy napięciu energii kolizyjnej pułapki wynoszącym 13 V (A, B) oraz 35 V (C). Chociaż na wszystkich trzech panelach widmo masowe (rzut na górę) wygląda podobnie, z tetrameryczną serią ładunków centrowaną wokół 4 000 m/z, profil czasu dryfu (rzuty na boki) jest inny (całkowity rozkład czasu dryfu zaznaczono kolorem czarnym, a profil 16+ kolorem czerwonym). Dłuższy czas dryfu próbki częściowo zdenaturowanej, uzyskany w B, oraz jonów aktywowanych w fazie gazowej, uzyskanych w C, wskazuje na pewien stopień rozfałdowania. Obserwacja ta pokazuje, że mimo iż zmierzona masa odpowiada nienaruszonemu kompleksowi, jego struktura w roztworze zostaje zaburzona. W konsekwencji wymagana jest staranna kontrola warunków eksperymentalnych.
Rysunek 4. Poprzez wygenerowanie krzywej kalibracyjnej można skorelować pomiary czasu dryfu z przekrojami czynnymi zderzeń.
A. Zmierzone wartości czasu dryfu dla wielu stanów ładunkowych cytochromu C konia (koła), mioglobiny z serca konia (trójkąty) oraz ubikwityny bydlęcej (kwadraty) naniesiono w funkcji literaturowych wartości Ω skorygowanych zarówno o stan ładunku jonu, jak i o masę zredukowaną. Dopasowanie daje funkcję liniową odpowiadającą równaniu: ln(ΩC )=Xln(tD')+A. Wyznaczony czynnik wykładniczy (X), stała wyznaczona z dopasowania (A) oraz współczynnik korelacji są przedstawione na wykresie dla danych pozyskanych przy prędkości fali T wynoszącej 350 m/s i statycznej wysokości fali 11 V. B. Histogram rozkładów współczynnika korelacji uzyskanych z 10 kolejnych eksperymentów kalibracyjnych.
| Próbka białka / Parametry techniczne | Peptyd GluFibrino- monomer 1.6 kDa | Mioglobina monomer 17 kDa | Hemoglobina tetramer 67 kDa | Transferryna monomer 80 kDa | GroEL 14-mer 801 kDa |
| Ciśnienie przeciwciśnienia, mBar | 4.4 | 5.0 | 5.1 | 5.1 | 6.5 |
| Ciśnienie w pułapce, mBar | 1.6x10-2 | 2.4x10-2 | 2.4x10-2 | 2.6x10-2 | 2.8x10-2 |
| Ciśnienie IMS, mBar | 4.4x10-1 | 4.4x10-1 | 4.4x10-1 | 4.4x10-1 | 4.2x10-1 |
| Napięcie stożka próbkowania, V | 46 | 80 | 80 | 80 | 118 |
| Napięcie stożka ekstrakcji, V | 1.7 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| Napięcie polaryzujące, V | 20 | 20 | 25 | 25 | 50 |
| Energia kolizyjna w pułapce, V | 20 | 15 | 15 | 15 | 80 |
| Energia kolizyjna transferu, V | 5 | 12 | 12 | 12 | 15 |
Tabela 1. Warunki eksperymentalne stosowane do analizy makromolekuł.
| Białko standardowe | Masa cząsteczkowa (m) | Ładunki (z) | m/z | Przekrój czynny zderzeń (in 2) |
| Cytochrom C | 12213 | 10 | 1222.3 | 2226 |
| 11 | 1111.3 | 2303 | ||
| 12 | 1018.8 | 2335 | ||
| 13 | 940.5 | 2391 | ||
| 14 | 873.4 | 2473 | ||
| 15 | 815.2 | 2579 | ||
| 16 | 764.3 | 2679 | ||
| 17 | 719.4 | 2723 | ||
| 18 | 679.5 | 2766 | ||
| Mioglobina | 16952 | 11 | 1542.1 | 2942 |
| 12 | 1413.7 | 3044 | ||
| 13 | 1305.0 | 3136 | ||
| 14 | 1211.9 | 3143 | ||
| 15 | 1131.1 | 3230 | ||
| 16 | 1060.5 | 3313 | ||
| 17 | 998.2 | 3384 | ||
| 18 | 942.8 | 3489 | ||
| 19 | 893.2 | 3570 | ||
| 20 | 848.6 | 3682 | ||
| 21 | 808.2 | 3792 | ||
| 22 | 771.6 | 3815 | ||
| Ubikwityna | 8565 | 8 | 1071.6 | 1442 |
| 8 | 1071.6 | 1622 | ||
| 9 | 952.7 | 1649 | ||
| 10 | 857.5 | 1732 | ||
| 11 | 779.6 | 1802 | ||
Tabela 2. Białka kalibracyjne i wartości ich przekrojów czynnych zderzeń wyznaczone za pomocą konwencjonalnych pomiarów IMS14.
| Urządzenia | Firma | Numer katalogowy |
| Generator RF Synapt HDMS-32K | Waters Ltd. | |
| Wytwornica mikropipet P-97 Flaming- Brown | Sutter Instruments | P- 97 |
| Sputter coater | Electron Microscopy Sciences | EMS550 |
| Mikroskop binokularny | Nikon | |
| Odczynniki | Firma | Numer katalogowy |
| Octczan amonu | Sigma- Aldrich | Sigma, A2706 |
| CsI 99.999% | Sigma- Aldrich | Aldrich, 203033 |
| Metanol | Sigma- Aldrich | Fluka, 34966 |
| Kwas octowy | Fisher Scientific | AC12404 |
| Mioglobina konia (z serca konia) | Sigma- Aldrich | M1882 |
| Cytochrom c konia (z serca konia) | Sigma- Aldrich | C-2506 |
| Ubikwityna bydlęca (z czerwonych krwinek) | Sigma- Aldrich | U6253 |
| Hemoglobina | Sigma- Aldrich | H2625 |
| Gazy | Uwagi | |
| Azot, czystość 99.999% | butla 8 m³ | |
| Argon, czystość 99.999% | butla 8,8 m³ | |
Tabela 3. Odczynniki i sprzęt.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół umożliwia wyznaczenie przekroju czynnego zderzeń białek lub kompleksów białkowych o nieznanej strukturze trójwymiarowej, w celu uzyskania informacji o ich ogólnym kształcie, upakowaniu podjednostek i topologii. W tym celu, po uzyskaniu wartości przekroju czynnego zderzeń, konieczne jest przekształcenie tych wartości w szczegóły strukturalne. Proces ten wymaga dodatkowych działań eksperymentalnych oraz analizy obliczeniowej, które są krótko omówione poniżej.
Na początek zaleca się analizę białek lub kompleksów białkowych o znanych strukturach. Pomiary te mogą stanowić użyteczną kontrolę jakości metodyki i umożliwić ocenę dokładności parametrów akwizycji poprzez porównanie teoretycznych i zmierzonych wartości Ω. Teoretyczne powierzchnie przekroju można obliczyć z współrzędnych struktury krystalicznej przy użyciu oprogramowania MOBCAL15,16, które jest programem open source opartym na języku FORTRAN, umożliwiającym edycję kodu zgodnie z potrzebami operatora. Do przeprowadzenia takich obliczeń wymagana jest modyfikacja programu w taki sposób, aby zwiększyć liczbę obliczeń iteracyjnych wykonywanych dla każdej struktury wejściowej oraz umożliwić akceptację plików współrzędnych zawierających dużą liczbę atomów1.
Niedawno zaproponowano strategię IM-MS służącą do definiowania układów topologicznych podjednostek w obrębie wieloskładnikowych kompleksów4,6. Metoda ta polega na monitorowaniu szlaków dysocjacji kompleksów białkowych do mniejszych komponentów. Dysocjację tę osiąga się poprzez kontrolowaną regulację warunków w fazie roztworu, co prowadzi do powstania rozkładu podkompleksów odzwierciedlającego „bloki budulcowe” kompleksów. Jednoczesny pomiar wartości Ω zarówno dla nienaruszonego kompleksu, jak i produktów dysocjacji, generuje ograniczenia strukturalne, które są następnie wykorzystywane do obliczania modeli topologicznych kompleksów białkowych. Podstawowym założeniem tej metodologii jest to, że powstałe podkompleksy zachowują swoje konformacje zbliżone do natywnych; zresztą niedawne badania wykazały, że struktura roztworowa produktów dysocjacji zostaje zachowana i nie dochodzi do istotnych przetasowań ani w fazie roztworu, ani w fazie gazowej4,6.
Ostatnim krokiem w przypisywaniu struktury czwartorzędowej jonom kompleksów białkowych w fazie gazowej jest dopasowanie wartości przekroju czynnego zderzeń do modeli generowanych komputerowo. Podejścia modelowe są stosowane w celu zbadania różnych możliwych układów topologicznych podjednostek, a ich wartości Ω in silico są obliczane i porównywane z wartościami eksperymentalnymi. Obecnie stosuje się jedynie kilka podejść obliczeniowych, takich jak gruboziarnista metoda sferyczna, która przybliża średnicę podjednostek1,8. Ogólnie rzecz biorąc, dziedzina ta znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju i wymagane są dalsze prace, aby uczynić to podejście uniwersalnym i możliwym do zastosowania w szerokim zakresie kompleksów.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują członkom grupy Sharon za krytyczną recenzję oraz wkład w przygotowanie rękopisu. Jesteśmy wdzięczni za wsparcie Programów Morasha i Bikura, Izraelskiej Fundacji Nauki (granty nr 1823/07 i 378/08), Centrum Badań nad Biomembranami im. Josefa Cohna Minerva, Programu Stypendialnego dla Młodych Naukowców Rodziny Chais, Fundacji Abrahama i Sonii Rochlin; Wolfson Family Charitable Trust; Centrum Struktury i Montażu Biomolekularnego im. Helen i Miltona A. Kimmelmana; spadkobiercom Shlomo i Sabine Beirzwinsky; Meil de Botton Aynsley oraz Karen Siem z Wielkiej Brytanii.
Bibliografia
- Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes. Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).
- Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).
- Smith, D. P. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).
- Leary, J. A. Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors. J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).
- Lorenzen, K. Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly. J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).
- Pukala, T. L. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).
- van Duijn, E. Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry. J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).
- Ruotolo, B. T. Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water. Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).
- Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. Aspects of native proteins are retained in vacuum. Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).
- Giles, K. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).
- McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes. J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).
- Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes. Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).
- Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).
- Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections. J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).
- Mesleh, M. F. Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential. J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).
- Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).
Przedruki i uprawnienia
