Systemiczne i miejscowe dostarczanie leków w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego w modelach gryzoni

Podsumowanie

Gruntowne testy przedkliniczne leków działających w ośrodkowym układzie nerwowym często obejmują ocenę i porównanie biodystrybucji leku w zależności od konkretnych dróg podania. W niniejszym materiale zaprezentowano na myszach trzy powszechnie stosowane metody podania ogólnoustrojowego (dożylne, dosytnieniowe oraz doustne), a także metodę podania miejscowego (podanie wspomagane konwekcją).

Streszczenie

Gruntowne badania przedkliniczne leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) obejmują analizę dróg podania oraz biodystrybucji substancji w celu oceny skuteczności terapeutycznej. Spośród dwóch głównych klasyfikacji podawania leków — miejscowego i ogólnoustrojowego — podejścia ogólnoustrojowe są często preferowane ze względu na łatwość aplikacji. Jednak podawanie ogólnoustrojowe może skutkować osiągnięciem nieoptymalnego stężenia leku w OUN, co może prowadzić do błędnych wniosków dotyczących skuteczności substancji. Metody miejscowego podawania leków są bardziej inwazyjne, lecz mogą być niezbędne do osiągnięcia terapeutycznych poziomów leku w OUN. W niniejszym materiale prezentujemy prawidłową technikę trzech dróg ogólnoustrojowego podawania leków: wstrzyknięć dożylnych, wstrzyknięć doszprownych oraz zgłębnika dożołądkowego. Dodatkowo przedstawiamy metodę miejscowego podawania leku do mózgu: konwekcyjną metodę dostarczania (CED). W celu obrazowania in vivo oraz weryfikacji prawidłowego podania leku wykorzystano związki znakowane fluorescencyjnie. Metody są zaprezentowane na modelach mysich, ale można je łatwo dostosować do zastosowania u szczurów.

Protokół

1. Metody podaży systemowej

Choć systemiczne podawanie leków nie jest najskuteczniejszą metodą osiągania wysokich stężeń preparatów w OUN, jest ono wygodne i dobrze tolerowane przez pacjentów. W niniejszym materiale zaprezentujemy prawidłowe procedury dla trzech rutynowo stosowanych metod podawania systemicznego: iniekcji dożylnej, iniekcji dosmaxWidth peritonealnej oraz zgłębnika doustnego.

A. Iniekcja dożylna (iniekcja do żyły ogonowej)

1. Przed rozpoczęciem procedury należy zapisać masę ciała każdej myszy. Podobnie jak we wszystkich badaniach przedklinicznych, masę ciała należy monitorować regularnie (co najmniej dwa razy w tygodniu), aby ocenić potencjalną toksyczność leku. Jednorazowo nie należy wstrzykiwać objętości przekraczającej 1% masy ciała myszy. Na przykład w przypadku myszy o masie 20g nie należy wstrzykiwać więcej niż 0,2mL płynu. Wszystkie płyny wstrzykiwane dożylnie powinny zostać wysterylizowane odpowiednią metodą.
2. Mysz należy ogrzewać przez 5-10 minut za pomocą mata grzewczego lub lampy grzewczej w celu rozszerzenia żyły ogonowej. W przypadku stosowania lampy grzewczej należy przez cały czas monitorować mysz, aby uniknąć hipertermii.
3. Mysz przenosi się do urządzenia stabilizującego, które unieruchamia zwierzę, zapewniając jednocześnie dostęp do żyły ogonowej (patrz wideo). W ogonie myszy widoczne są cztery naczynia: naczynia po stronie grzbietowej i bocznych to żyły, a naczynie po stronie brzusznej to tętnica. Aby uzyskać dostęp do żyły ogonowej, ogon myszy należy chwycić w najbardziej dystalnym punkcie i obrócić o 90 stopni tak, aby żyła była skierowana do góry. Miejsce wstrzyknięcia należy oczyścić gazikiem nasączonym alkoholem, a następnie wprowadzić strzykawkę insulinową 28g do żyły, skierowując ścięcie igły do góry (patrz wideo). Jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w żyle, powinna przesuwać się swobodnie i bez oporu. Lek należy wstrzykiwać powoli, przy stałym nacisku, przez 5-10 sekund. Jeśli na ogonie pojawi się pęcherz, należy przerwać wstrzykiwanie, ponieważ oznacza to, że igła nie znajduje się już w żyle.
4. Po wstrzyknięciu należy delikatnie uciskać miejsce wkłucia, aż krwawienie ustanie. Zazwyczaj trwa to 30-60 sekund. Mysz należy monitorować przez 5-10 minut po iniekcji, aby upewnić się, że nie występuje dalsze krwawienie.

B. Iniekcja dosytronnicza

1. Przed rozpoczęciem iniekcji należy pobrać lek do strzykawki z igłą 28g. Należy upewnić się, że w strzykawce jest miejsce na cofnięcie tłoka przed iniekcją (np. w przypadku iniekcji 200μL, należy upewnić się, że pojemność strzykawki wynosi 300μL lub więcej).
2. Wyjąć mysz z klatki za ogon i umieścić ją na teksturowanej powierzchni, aby mysz miała się czego chwycić. Zazwyczaj wystarczająca jest pokrywa klatki. Pozwolić myszy wyprostować ciało, a następnie niedominującą ręką chwycić skórę na grzbiecie myszy, dbając o to, by lekko uścisnąć jak najwięcej skóry między kciukiem, palcem wskazującym a środkowym (patrz wideo). Przewrócić mysz tak, aby brzuch był skierowany do góry. Jeśli mysz może swobodnie poruszać głową, należy puścić chwyt i spróbować ponownie, aby uniknąć ugryzienia podczas iniekcji.
3. Dominującą ręką podnieść strzykawkę i wprowadzić igłę pod kątem 30 stopni w dolny lewy kwadrant brzucha myszy (patrz wideo). Trzymanie myszy w lekkim odwróceniu pomoże odsunąć organy od miejsca iniekcji. Aby upewnić się, że igła znajduje się w jamie otrzewnowej, należy delikatnie odciągnąć tłok strzykawki. Jeśli w strzykawce pojawi się jakikolwiek płyn lub krew, oznacza to, że igła nie znajduje się w jamie otrzewnowej i należy ją wyciągnąć. Jeśli do strzykawki nie zostanie zassany żaden płyn, należy wstrzyknąć zawartość strzykawki równomiernym naciskiem w czasie 1-5 sekund i wypuścić mysz.
4. Obserwować mysz przez 5-10 minut po iniekcji, aby upewnić się, że powróci ona do normalnego poziomu aktywności.

C. Podanie doustne (gavage)

1. Przed przystąpieniem do iniekcji zmierz masę ciała myszy. Maksymalna objętość, jaką można podać drogą zgłębnika (gavage), wynosi 10mL na kilogram masy ciała. Na przykład maksymalna objętość dla myszy o masie 20g wyniosłaby 200μL. Próba podania większych objętości może spowodować refluks, co doprowadzi do niepełnego podania leku. Jeśli konieczne jest podanie objętości większych niż wskazano powyżej, w ciągu 24 godzin można podać do trzech dawek.
2. Aby uniknąć przebicia przełyku, ważne jest zmierzenie długości igły zgłębnika dla każdej myszy. Przyłóż zakrzywioną igłę do zgłębnika z zaokrąglonym końcem o rozmiarze 18g do ostatniego żebra myszy, a następnie zaznacz długość na wysokości czubka głowy myszy za pomocą niezmywalnego markera (patrz wideo). Podczas podawania preparatu zaznaczenie to będzie punktem zatrzymania podczas wprowadzania igły do pyska myszy.
3. Utrzymaj mysz, stosując ten sam chwyt dłonią, co przy iniekcji doszpikowej. Wprowadź igłę zgłębnika do pyska, nad język, a następnie przesuń igłę przez gardło. Nie wprowadzaj igły poza punkt zatrzymania. Igła powinna wchodzić gładko, bez żadnego oporu (patrz wideo). Jeśli poczujesz opór, przerwij procedurę i wycofaj igłę, aby uniknąć wstrzyknięcia płynu do płuc.
4. Po umieszczeniu igły w odpowiedniej pozycji naciśnij tłok w ciągu 1-5 sekund, a następnie wyjmij igłę pod tym samym kątem, pod którym została wprowadzona. Obserwuj mysz przez 5-10 minut, zwracając szczególną uwagę na wszelkie oznaki trudności w oddychaniu, które mogą wskazywać na dostanie się płynu do płuc.

2. Dostarczanie miejscowe

Ostra konwekcyjna metoda dostarczania leków (CED)

A. Konstrukcja sondy

Kaniula do CED dla gryzoni, odporna na refluks, nie jest jeszcze dostępna w sprzedaży. W niniejszej pracy zaprezentujemy metodę konstrukcji kaniuli, która została zaadaptowana z metody opisanej po raz pierwszy przez Krauze et al (Krauze 2005).

• Kaniula składa się z trzech części (Rysunek 1): rurki krzemionkowej o średnicy 100uM, przez którą przepływa infuzat, sztywnej metalowej igły zapewniającej wsparcie strukturalne oraz elastycznej rurki teflonowej służącej do ładowania infuzatu.
• Aby uzyskać sztywną metalową igłę, należy użyć otwartego płomienia do stopienia plastiku w cewniku Surflo IV (stilet 24g), a następnie za pomocą pęsety wyjąć metalową igłę. Reszta cewnika może zostać zutylizowana. Za pomocą żyletki należy odciąć odcinek rurki krzemionkowej (OD 0,163mm), nieco dłuższy niż metalowa igła. Rurkę krzemionkową należy zanurzyć w małej kropli szybkoutwardzalnego kleju na bazie cyjanoakrylanu (np. Krazy Glue), dbając o to, aby nie doprowadzić do kontaktu kleju z końcami rurki. Następnie należy wsunąć rurkę krzemionkową do metalowej igły i pozostawić do wyschnięcia na 5 minut.
• Po wyschnięciu rurka krzemionkowa powinna być mocno przymocowana do igły. Końce krzemionki należy przyciąć tak, aby 2mm rurki krzemionkowej wystawał z ostrza igły, a 3mm rurki krzemionkowej wystawał z jej płaskiego końca (patrz wideo).
• Należy odciąć odcinek rurki teflonowej o długości 20 cm. Metalową igłę należy zanurzyć w małej kropli kleju, ponownie dbając o to, aby nie dostał się on na końce rurki krzemionkowej, co mogłoby zapchać kaniulę. Igłę należy wsunąć do rurki teflonowej na głębokość 1cm. Pozostawić do wyschnięcia na 1 minutę. Za pomocą pistoletu do kleju należy nanieść kroplę kleju na gorąco na połączenie metalowej igły i rurki teflonowej (patrz wideo). Należy upewnić się, że całe połączenie jest pokryte z każdej strony i pozostawić do wyschnięcia na co najmniej 1 godzinę. Kaniule można przygotować z tygodniowym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej.

B. Procedura infuzji

• Aby przygotować obszar operacyjny, wszystkie powierzchnie należy spryskać środkiem dezynfekującym, np. 2% roztworem chlorheksydyny. Podczas procedury należy stosować sterylne rękawice chirurgiczne. Następnie powierzchnie należy przykryć chłonnymi obłożeniami. W obszarze operacyjnym należy przygotować następujące materiały:
  • Mata grzewcza do utrzymania temperatury ciała myszy
  • Dwie małe szalki Petriego; jedna zawierająca 3% nadtlenek wodoru, a druga zawierająca 2% chlorheksydynę
  • Sterylna gaza i patyczki bawełniane
  • Sterylne skalpele jednorazowe (numer 21)
  • Sterylne igły 22G
  • Stereotaktyczny przyrząd do myszy
  • Strzykawkowy pompa do dozowania z kontrolowaną prędkością
  • Autoklawowany zszywacz do skóry myszy, zszywki i usuwacz zszywek
• Aby przygotować kaniulę CED, należy podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml do rurki teflonowej za pomocą zestawu plastikowych adapterów do strzykawek. Kaniulę należy przymocować do zestawu stereotaksycznego w taki sposób, aby była prostopadła do powierzchni operacyjnej (patrz wideo). W celu dezynfekcji kaniuli należy napełnić strzykawkę 1 ml 70% etanolem i nacisnąć tłok, aby przepuścić etanol przez kaniulę. Proces ten należy powtórzyć, używając sterylnej soli fizjologicznej, a następnie sprawdzić, czy w miejscach połączeń kaniuli nie występują żadne wycieki. Aby zdezynfekować zewnętrzną część kaniuli, należy ją delikatnie przetrzeć gazikiem nasączonym 70% etanolem.
• Wypełnij kaniulę sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie odciągnij tłok strzykawki tak, aby do kaniuli dostał się niewielki pęcherzyk powietrza. Pęcherzyk ten oddzieli wlew od soli fizjologicznej znajdującej się w kaniuli. Następnie nabierz wlew do strzykawki (patrz wideo). Podłącz strzykawkę do pompy infuzyjnej i zapowietrz pompę, uruchamiając kaniulę na krótki czas.
• Uspokój mysz, podając w zastrzyku środek anestetyczny, a następnie przygotuj skórę, przecierając ją kilkukrotnie (przez 5–10 sekund) sterylną gazą nasączoną 2% roztworem chlorheksydyny. Aby zapewnić odpowiednie nawilżenie podczas zabiegu, do oka myszy należy nanieść maść oftalmiczną. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie strzałkowe wzdłuż centrum czaszki o długości około 1,5 cm (patrz wideo). Następnie oczyść powierzchnię czaszki za pomocą patyczka kosmetycznego nasączonego 3% roztworem nadtlenku wodoru. Należy uważać, aby nadtlenek wodoru nie dostał się do oczu myszy. Na tym etapie linie szwów czaszki powinny być widoczne; jeśli nie są, delikatnie przemyj czaszkę nowym patyczkiem nasączonym 3% roztworem nadtlenku wodoru.
• Zidentyfikuj bregma (Rysunek 2) następnie odmierzyć 2 mm w prawo i 1 mm tylnie od tej struktury, aby zlokalizować miejsce infuzji. Za pomocą sterylnej igły 22G delikatnie wykonać otwór w czaszce w tym punkcie, obracając igłę przy kontakcie z kością (patrz w filmie). Należy unikać forsownego wciskania igły w głąb czaszki.
• W tym momencie mysz należy umieścić w aparacie stereotaktycznym i rozpocząć podawanie anestetyku drogą wziewną (patrz. wideo). Anestetyk należy podawać w niskim stężeniu (1%), uważnie monitorując częstość oddechów myszy i odpowiednio dostosowując dawkę środka anestetycznego.
• Umieść kaniulę nad otworem w czaszce, a następnie opuść ją na 3 mm poniżej powierzchni czaszki. Rozpocznij infuzję, stosując następujące szybkości i czasy trwania:

  0.1 μL/min przez 5 minut
  0.2 μL/min przez 5 minut
  0.5 μL/min przez 5 minut
  .8 μL/min przez 7,5 minuty
  WYŁ. przez 1 minutę

• Po zakończeniu infuzji powoli usuń kaniulę i przemyj czaszkę 3% nadtlenkiem wodoru. W miejsce otworu nałóż sterylny wosk kostny (patrz wideo). Za pomocą pęsety zbliż brzegi skóry nad czaszką i zamknij ranę za pomocą zszywek. W celu pooperacyjnego uśmierzenia bólu należy podać buprenorfinę.
• Monitoruj mysz po zabiegu, aż odzyska ona przytomność i sprawność ruchową. Ze względu na czas trwania procedury, pełny powrót do aktywności może potrwać do jednej godziny. W tym czasie umieść klatkę z myszą na podkładce grzewczej, aby zapobiec hipotermii; nie umieszczaj myszy w trakcie rekonwalescencji w jednej klatce z innymi aktywnymi myszami.
• Zszywki skórne należy usunąć tydzień po operacji.

C. Obrazowanie in vivo

Infuzat znakowany fluorescencyjnie może być obrazowany po podaniu metodą CED, a zmiany w intensywności oraz lokalizacji sygnału mogą być monitorowane. Zazwyczaj najlepiej jest odczekać 2-3 godziny po infuzji przed przystąpieniem do obrazowania, aby mysz mogła dojść do siebie po zabiegu.

• Do znieczulenia podczas obrazowania należy zastosować niskie stężenie anestetyku wziewnego. Mysz należy umieścić grzbietem do góry w stacji obrazowania (np. IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Obraz należy zarejestrować, stosując odpowiednie ustawienia filtra dla obrazowanego fluoroforu. W przypadku CED prawidłowa infuzja powinna wykazać obecność większości materiału w mózgu w pobliżu miejsca infuzji (Rysunek 3).

3. Reprezentatywne wyniki

Brak reakcji niepożądanej po podaniu terapii jest istotnym wskaźnikiem prawidłowego wykonania wstrzyknięcia. Na przykład po wstrzyknięciu do żyły ogonowej nie powinno nastąpić żadna zmiana w wyglądzie (np. rozmiarze, kolorze) ogona. Pojawienie się pęcherzyka lub obrzęku po wstrzyknięciu do żyły ogonowej wskazywałoby na podanie terapii drogą podskórną, a nie dożylną. W przypadku wstrzykiwań doszpikowych, wybrzuszenie skóry lub odbarwienie brzucha może wskazywać na wstrzyknięcie podskórne lub uszkodzenie struktur wewnętrznych. Podczas zgłębnikowania przełykowego u myszy trudności w oddychaniu lub kaszel mogą wskazywać na to, że płyn został wstrzyknięty do płuc, a nie do żołądka.

W przypadku CED funkcji neurologicznych ma się kluczowe znaczenie dla oceny powodzenia podania terapii. Mysz wykazująca drgawki lub hemiparezę mogła zostać poddana nieprawidłowej infuzji. Jeśli zastosowano fluorescencyjny infuzat, do oceny powodzenia podania można wykorzystać obrazowanie in vivo (Rycina 3). Jeśli infuzat nie zlokalizował się w miejscu wstrzyknięcia, infuzja nie powiodła się.

Rysunek 1: Kaniula CED i zestaw chirurgiczny. Przedstawiono podstawowe elementy zestawu chirurgicznego do dostarczania wspomaganego konwekcją. Pompa do mikroinfuzji (A) jest podłączona do kaniuli infuzyjnej (B, pokazana w powiększeniu u góry). Rama stereotaktyczna (C) służy do pozycjonowania sondy. Na obrazie nie przedstawiono sprzętu do ogrzewania i znieczulania, który jest również stosowany podczas procedury.

Rysunek 2: Linie szwów czaszki myszy. Miejsce infuzji CED (czerwona gwiazdka) można zlokalizować poprzez zidentyfikowanie przecięcia szwu strzałkowego i czołowego (bregma), a następnie odmierzenie 2 mm bocznie i 1 mm tylnie od bregma.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki skutecznej CED. Liposomy znakowane dalekoczerwonym barwnikiem fluorescencyjnym zostały wprowadzone do mózgu myszy za pomocą CED i obrazowane zarówno in vivo, jak i ex vivo. Skuteczna infuzja objawia się sygnałem fluorescencyjnym zlokalizowanym w miejscu infuzji zarówno in vivo (A), jak i ex vivo (B). Sygnał powinien być zlokalizowany w infuzowanej półkuli bez wycieku do półkuli przeciwległej.

Rysunek 4: Reprezentatywny obraz udanej CED do pnia mózgu szczura. Do pnia mózgu szczura wprowadzono liposomy znakowane fluorescencyjnie. U szczurów można wprowadzić do 20μL. Zwiększona grubość czaszki szczura oraz głębokość iniekcji uniemożliwiły obrazowanie in vivo, lecz prawidłową lokalizację infuzji można było zweryfikować za pomocą obrazowania ex vivo wypreparowanego mózgu.

Dyskusja

Przedkliniczna ocena skuteczności każdego środka terapeutycznego musi uwzględniać właściwości farmakologiczne substancji oraz charakterystykę docelowej tkanki. Choć systemowe metody podawania są zazwyczaj łatwiejsze w zastosowaniu i lepiej tolerowane przez pacjentów, selektywność bariery krew-mózg często wymusza miejscowe dostarczanie terapii w leczeniu chorób OUN. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy jedną z metod bezpośredniego dostarczania leków do mózgu: CED. Inne formy miejscowego podawania do mózgu obejmują bezpośrednią administrację do płynu mózgowo-rdzeniowego, wtryskiwanie bolusa bezpośrednio do guza oraz iniekcje dokomorowe. W przypadku tych metod krytyczne znaczenie ma zdolność dyfuzji preparatu terapeutycznego, przy czym słaba dyfuzja ogranicza obszar pokrycia do kilku milimetrów od miejsca wstrzyknięcia (Jain 1989, Bobo 1994). W przeciwieństwie do nich, CED wykorzystuje nadciśnienie w celu zwiększenia obszaru dystrybucji leku (Bobo 1994), umożliwiając jednocześnie celowane dostarczenie substancji terapeutycznej do konkretnych struktur neuroanatomicznych. W naszym laboratorium z powodzeniem przeprowadziliśmy procedurę CED w pniu mózgu, a także w jądrze ogoniastym i skorupie u gryzoni (Rysunek 4).

Zdolność do przeprowadzania CED w modelach gryzoni stała się coraz bardziej istotna w związku z rosnącym zainteresowaniem maksymalizacją skuteczności terapeutycznej przy leczeniu różnych typów chorób OUN. CED można wykorzystać do dostarczania różnych substancji, w tym oczyszczonych białek, leków małocząsteczkowych oraz wirusów (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). Zakres chorób, które mogą być leczone za pomocą CED, obejmuje nowotwory OUN (Yamashita 2007), a także choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona (Gill 2003). W miarę rozwoju badań nad CED wzrasta analogicznie zapotrzebowanie na obrazowanie in vivo terapii podawanej tą metodą. Choć obrazowanie fluorescencyjne zaprezentowane w niniejszym materiale prawdopodobnie nie byłoby widoczne przez ludzką czaszkę, inne metody wykorzystujące jednoczesną infuzję środków kontrastowych do MRI (Dickinson 2008) budzą zainteresowanie pod kątem oceny możliwości monitorowania infuzatów u pacjentów z chorobami OUN.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2% Chloreksydyna	Fisher Scientific	NC9756995	znana jako Nolvasan”
Igła 20g	BD Biosciences	305175
Igła 28g (ze strzykawką)	Fisher Scientific	22-004-270	znana jako strzykawka insulinowa
3% Nadtlenek wodoru	Fisher Scientific	H312P-4	Przechowywać z dala od światła
Patyczki bawełniane	Fisher Scientific	23-400-100	Autoklawować przed użyciem
Klej na bazie cyjanoakrylanu	Fisher Scientific	NC9592632	znany jako Krazy Glue”
Skalpele jednorazowe	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	Nr 21
Gaza	Fisher Scientific	22028563	Autoklawować przed użyciem
Podkładka grzewcza	Dunlap	HP950
Kaniula dożylna	Fisher Scientific	14-841-20
Pompa infuzyjna	BASi	MD-1000, MD-1001
Oprogramowanie Living Image	Caliper Life Sciences	Kontakt w celu uzyskania wyceny
Maść oftalmiczna	Cardinal Health	1272830	znana jako Akwa Tears”
Plastikowe adaptery do strzykawek	Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	Pasują do strzykawek z Luer Lock
Przewody krzemionkowe	Polymicro Technologies	2000020
Zszywacz do skóry, zszywki, usuwacz	Stoelting Co.	59020
Rama stereotaktyczna	Stoelting Co.	51725
Przewody teflonowe	Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences	Kontakt w celu uzyskania wyceny