Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do przeprowadzania fotokonwersji białek fluorescencyjnych przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Opisujemy procedury fotokonwersji oczyszczonych próbek białek, a także optycznego uwydatniania z użyciem dwóch sond w żywych komórkach z wykorzystaniem mOrange2 i Dronpa.

Streszczenie

Fotokonwertowalne białka fluorescencyjne (pc-FPs) to klasa białek fluorescencyjnych o właściwościach „optycznego zakreślacza”, co oznacza, że kolor fluorescencji może ulec zmianie pod wpływem ekspozycji na światło o określonej długości fali. Optyczne zakreślanie umożliwia nieinwazyjne znakowanie subpopulacji cząsteczek fluorescencyjnych, dzięki czemu jest idealną metodą do śledzenia pojedynczych komórek lub organelli.

Krytycznymi parametrami dla wydajnej fotokonwersji są natężenie oraz czas ekspozycji na światło fotokonwersyjne. Jeśli natężenie jest zbyt niskie, fotokonwersja będzie przebiegać powoli lub w ogóle nie zajdzie. Z drugiej strony, zbyt duże natężenie lub zbyt długa ekspozycja mogą doprowadzić do fotoblaknięcia białka, co zmniejszy wydajność fotokonwersji.

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do konfiguracji konfokalnego mikroskopu skaningowego do zastosowań w fotokonwersji pc-FP. W pierwszej kolejności opisujemy procedurę przygotowania próbek w formie kropel oczyszczonego białka. Taka forma próbki jest bardzo wygodna do badania właściwości fotofizycznych białek fluorescencyjnych pod mikroskopem. Następnie wykorzystamy próbkę w formie kropli białka, aby pokazać, jak skonfigurować mikroskop do fotokonwersji. Na koniec zaprezentujemy, jak przeprowadzić optyczne uwydatnianie (optical highlighting) w żywych komórkach, w tym podwójne optyczne uwydatnianie z użyciem mOrange2 oraz Dronpa.

Protokół

1. Przygotowanie próbek kropel białek fluorescencyjnych

Próbka kropli białka fluorescencyjnego składa się z emulsji 1-oktanolu z wodą, w której faza wodna zawiera białko fluorescencyjne. Emulsja ta jest umieszczona pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a kwadratowym szkiełkiem zakrywowym o boku 22 mm w celu zastosowania w mikroskopii.

1. Przed przygotowaniem próbek kropel białka fluorescencyjnego należy oczyścić szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe oraz pokryć je środkiem hydrofobowym.
2. Szklane elementy należy oczyścić, myjąc je przez 5 minut w acetonie, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. (Opcjonalnie, po czyszczeniu szklane elementy można poddać 30-sekundowej obróbce w oczyszczaczu plazmowym, aby uzyskać optymalne wyniki powlekania).
3. Należy przygotować 2% roztwór metylotrimetoksysilanu w acetonie i powlec szklane elementy podczas 2-minutowej inkubacji w tym roztworze. Po powleczeniu należy wyjąć szklane elementy z roztworu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Następnie należy je opłukać 70% etanolem z butelki z rozpylaczem i ponownie pozostawić do wyschnięcia. (Opcjonalnie, na tym etapie szklane elementy można wyprać przez 1 godzinę w temperaturze 80°C, aby kowalencyjnie związać powłokę z powierzchnią szkła). Powlekane elementy szklane można przechowywać przez co najmniej miesiąc.
4. Białka fluorescencyjne są oczyszczane jako białka z znacznikiem His₆ z E. Coli ¹. Należy zmierzyć widmo absorbancji oczyszczonego białka i przygotować roztwór zapasowy o gęstości optycznej ~0,1 w buforze STE (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA), zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodatkowo należy przygotować 10 ml mieszaniny 1-oktanolu i buforu STE w stosunku 1:1 w 15 ml probówce stożkowej i energicznie wymieszać. Po zmieszaniu należy pozostawić do całkowitego rozdzielenia faz. Faza górna to 1-oktanol. (Uwaga: Ze względu na silny zapach 1-oktanolu ważne jest stosowanie zamkniętego pojemnika na odpady dla wszystkiego, co miało kontakt z 1-oktanolem).
5. Aby przygotować emulsję, należy nalać do probówki do wirówki 45 μl 1-oktanolu i 5 μl białka fluorescencyjnego. Kilkakrotnie postukać w probówkę palcem, aby zainicjować tworzenie emulsji, a następnie poddać probówkę działaniu ultradźwięków przez 30 sekund w myjce ultradźwiękowej. W tym czasie należy przygotować powlekone szkiełko przedmiotowe i nakrywkę. Po sonikacji emulsja powinna być całkowicie mętna. Natychmiast po sonikacji należy nanieść 4 μl emulsji ze środka probówki na powlekone szkiełko przedmiotowe i przykryć powleczoną nakrywką.
6. Jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo, emulsja powinna równomiernie rozprzestrzenić się między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką. W ciągu kilku minut próbka powinna stać się stabilna, składając się z fluorescencyjnych kropel o grubości ~10 μm i zróżnicowanej średnicy. Największe krople znajdują się blisko centrum próbki, a mniejsze są zlokalizowane bliżej krawędzi.

2. Przygotowanie eksperymentu fotokonwersji

Poniższa procedura stanowi ogólną strategię przygotowania eksperymentu fotokonwersji białek fluorescencyjnych. Procedura ta może być stosowana zarówno w przypadku oczyszczonych białek, jak i żywych komórek.

1. Następujące parametry stanowią ogólny punkt wyjścia do konfiguracji eksperymentu fotokonwersji:
   obiektyw imersyjny 40x 1.3NA
   Rozmiar obrazu = 512 x 512 pikseli
   Zoom skanowania = 4
   
   Czas ekspozycji piksela = 6 μsec.
   Rozdzielczość Z (wielkość otworu pinhole) = 3 μm
2. Skonfiguruj dwa kanały detekcji dla fluorescencji początkowej i fotokonwertowanej, a także „kanał fotokonwersji”. W tym przykładzie zastosujemy oczyszczone białko mOrange2, które jest fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym zmieniającym barwę z pomarańczowej na czerwoną. Postać pomarańczowa jest wykrywana przy wzbudzeniu 561 nm, a fluorescencję zbiera się w zakresie od 570 nm do 630 nm. Fotokonwertowana postać czerwona jest wykrywana przy wzbudzeniu 633 nm, a fluorescencję zbiera się w zakresie od 640 nm do 700 nm. Dla „kanału fotokonwersji” wybierz wzbudzenie 488 nm i zbieraj fluorescencję w zakresie od 490 nm do 540 nm. (Uwaga: obrazowanie kanału fotokonwersji nie jest ściśle wymagane).
3. Użyj kanału do obrazowania fluorescencji początkowej z ciągłym skanowaniem, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.
4. Aktywuj kanał fotokonwersji i wybierz niską moc lasera. Rozpocznij obrazowanie serii time-lapse i stopniowo zwiększaj moc lasera do fotokonwersji, aż zaobserwowany zostanie znaczny bleaching fluorescencji początkowej. Kontynuuj skanowanie, dopóki fluorescencja początkowa nie zostanie wybielona w około 75%.
5. Dezaktywuj kanał fotokonwersji i aktywuj kanał detekcji dla fluorescencji fotokonwertowanej. Rozpocznij obrazowanie przy wysokim wzmocnieniu detektora i niskiej mocy lasera, a następnie stopniowo zwiększaj moc lasera, aż do wykrycia fluorescencji fotokonwertowanej. Po wykryciu fluorescencji fotokonwertowanej można dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora dla uzyskania optymalnej jakości obrazu.
6. Na koniec należy zoptymalizować moc lasera używaną do fotokonwersji oraz czas trwania fotokonwersji. Zwiększenie mocy lasera do fotokonwersji przyspieszy tempo konwersji, jednak zbyt wysoka moc lasera spowoduje fotobleaching białka.
7. Po ustaleniu optymalnej mocy i czasu trwania lasera do fotokonwersji, parametry te można wykorzystać do konfiguracji standardowego modułu fotobleachingu lub FRAP, a „kanał fotokonwersji” nie będzie już wymagany.

3. Optyczne podkreślanie z użyciem dwóch sond: mOrange2 i Dronpa

Ze względu na przesunięte w stronę czerwieni właściwości widmowe, mOrange2 może być stosowane w połączeniu z zielonym fotoprzełączalnym białkiem fluorescencyjnym Dronpa do dwusondowego optycznego podkreślania, co umożliwia selektywne wyróżnienie 4 oddzielnych populacji komórek (organelli).

1. Komórki hoduje się w naczyniach MatTek z szklanym dnem i transfekuje na 24 godziny przed obrazowaniem, stosując standardową procedurę transfekcji Lipofectamine2000¹.
2. Należy przygotować mikroskop do fotokonwersji mOrange2 zgodnie z opisem w sekcji 2.
3. Skonfiguruj mikroskop do fotoprzełączania Dronpa. Fluorescencję Dronpa można obrazować, korzystając z „kanału fotokonwersji” mOrange2 (patrz krok 2.2). (Uwaga: Należy zminimalizować moc lasera używanego do obrazowania Dronpa, ponieważ zbyt wysoka moc spowoduje inaktywację Dronpa). Dodaj kanał do fotoaktywacji Dronpa. Do fotoaktywacji stosujemy dwufotonowe wzbudzanie 800 nm, ale można to również osiągnąć za pomocą wzbudzania 405 nm. Określ moc lasera wymaganą do obrazowania, fotoaktywacji i fotoinaktywacji fluorescencji Dronpa.
4. Ostrzeżenie: Fotokonwersja mOrange2 oraz inaktywacja Dronpa zachodzą podczas wzbudzania 488 nm. Ze względu na wysoką moc lasera wymaganą do fotokonwersji mOrange2, doprowadzi to również do inaktywacji fluorescencji Dronpa. Z drugiej strony, inaktywacja Dronpa zachodzi już przy znacznie niższej mocy lasera i może być przeprowadzona bez istotnej fotokonwersji mOrange2.
5. Po ustawieniu parametrów fotokonwersji mOrange2 i fotoprzełączania Dronpa, optyczne wyróżnianie podwójną sondą uzyskuje się w następujących krokach. Po pierwsze, inaktywuj fluorescencję Dronpa w całym polu widzenia, stosując wzbudzanie 488 nm o niskiej mocy. Po drugie, wybierz obszar zainteresowania (ROI) i przeprowadź fotokonwersję mOrange2 przy użyciu wzbudzania 488 nm o wysokiej mocy. Na koniec wybierz obszar zainteresowania, aby aktywować fluorescencję Dronpa.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Przygotowanie próbki kropelkowej. A) Prawidłowo przygotowana próbka kropelkowa. B) Próbka przygotowana bez powlekania szkiełka przedmiotowego i nakrywki. C) Próbka przygotowana bez dodania 0,1% BSA.

Rycina 2. Wpływ mocy i czasu trwania lasera fotokonwersyjnego na fotokonwersję mOrange2. Pojedyncze kropelki zawierające białko mOrange2 były poddawane ciągłej fotokonwersji przy użyciu różnych poziomów mocy lasera 488 nm. Względna moc lasera zastosowana do fotokonwersji wynosiła 10% (linia ciągła), 25% (linia przerywana) i 100% (linia kropkowana). A) Pomarańczowe gatunki fluorescencyjne. B) Fotokonwertowane czerwone gatunki fluorescencyjne.

Rycina 3. Podwójne optyczne podkreślanie z użyciem mOrange2 i Dronpa. A) Komórka wykazująca ekspresję mOrange2-Histone H2B oraz Dronpa-Mito przed fotokonwersją, wykazująca pomarańczową fluorescencję w jądrze i zieloną fluorescencję w mitochondriach. B) Fluorescencja Dronpa została wyłączona przy użyciu wzbudzenia 488 nm o niskiej mocy, co spowodowało minimalną fotokonwersję mOrange2. C) mOrange2 uległo fotokonwersji do koloru czerwonego przy użyciu wzbudzenia 488 nm o wysokiej mocy. D) Fluorescencja Dronpa została ponownie włączona za pomocą dwufotonowego wzbudzenia 800 nm. Panele stanowią nałożenie obrazów fluorescencyjnych na obraz z kontrastem różnicowym (DIC).

Dyskusja

Oczyszczona próbka białka fluorescencyjnego w formie kropli jest bardzo wygodnym formatem do charakterystyki fotofizycznej białek fluorescencyjnych, na przykład do badania kinetyki fotoblaknięcia i kinetyki fotokonwersji. Ekstremalnie mała objętość kropli (~20 picoliter) ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z fotoblaknięciem i fotokonwersją, które mogą być trudne do wykonania w systemach opartych na kuwetach. Ponadto, jak pokazano tutaj, próbka w formie kropli jest idealnie dostosowana do konfiguracji mikroskopu konfoka...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lamelki do mikroskopu	VWR international	48312-003
Szkiełka zakrywkowe 22 mm	Corning	2940-245
1-oktanol	Sigma-Aldrich	O4500
metylotrimetoksysilan	Sigma-Aldrich	M6420
Szalki MatTek	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019