Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do przeprowadzania fotokonwersji białek fluorescencyjnych przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Opisujemy procedury fotokonwersji oczyszczonych próbek białek, a także optycznego uwydatniania z użyciem dwóch sond w żywych komórkach z wykorzystaniem mOrange2 i Dronpa.

Streszczenie

Fotokonwertowalne białka fluorescencyjne (pc-FPs) to klasa białek fluorescencyjnych o właściwościach „optycznego zakreślacza”, co oznacza, że kolor fluorescencji może ulec zmianie pod wpływem ekspozycji na światło o określonej długości fali. Optyczne zakreślanie umożliwia nieinwazyjne znakowanie subpopulacji cząsteczek fluorescencyjnych, dzięki czemu jest idealną metodą do śledzenia pojedynczych komórek lub organelli.

Krytycznymi parametrami dla wydajnej fotokonwersji są natężenie oraz czas ekspozycji na światło fotokonwersyjne. Jeśli natężenie jest zbyt niskie, fotokonwersja będzie przebiegać powoli lub w ogóle nie zajdzie. Z drugiej strony, zbyt duże natężenie lub zbyt długa ekspozycja mogą doprowadzić do fotoblaknięcia białka, co zmniejszy wydajność fotokonwersji.

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do konfiguracji konfokalnego mikroskopu skaningowego do zastosowań w fotokonwersji pc-FP. W pierwszej kolejności opisujemy procedurę przygotowania próbek w formie kropel oczyszczonego białka. Taka forma próbki jest bardzo wygodna do badania właściwości fotofizycznych białek fluorescencyjnych pod mikroskopem. Następnie wykorzystamy próbkę w formie kropli białka, aby pokazać, jak skonfigurować mikroskop do fotokonwersji. Na koniec zaprezentujemy, jak przeprowadzić optyczne uwydatnianie (optical highlighting) w żywych komórkach, w tym podwójne optyczne uwydatnianie z użyciem mOrange2 oraz Dronpa.

Protokół

1. Przygotowanie próbek kropli białek fluorescencyjnych

Próbka kropli białka fluorescencyjnego składa się z emulsji 1-oktanolu i wody, w której faza wodna zawiera białko fluorescencyjne. Emulsja ta zostaje umieszczona pomiędzy szkiełkiem podstawowym a kwadratowym szkiełkiem nakrywką o boku 22 mm w celu zastosowania w badaniach mikroskopowych.

1. Przed przygotowaniem próbek kropli białek fluorescencyjnych należy oczyścić szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe, a następnie pokryć je środkiem hydrofobowym.
2. Szkło należy oczyścić, myjąc przez 5 minut w acetonie, i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. (Opcjonalnie, po czyszczeniu szkło można poddać działaniu czyszczarki plazmowej przez 30 sekund, aby uzyskać optymalne wyniki powlekania).
3. Należy przygotować 2% roztwór metylotrimetoksysilanu w acetonie i powlec szkło poprzez 2-minutową inkubację w tym roztworze. Po powleceniu należy wyjąć szkło z roztworu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Następnie należy spłukać je 70% etanolem z butelki z rozpylaczem i ponownie pozostawić do wyschnięcia. (Opcjonalnie, na tym etapie szkło można wyprać przez 1 godzinę w temperaturze 80°C, aby kowalencyjnie związać powłokę ze szkłem). Powleczone szkło można przechowywać przez co najmniej miesiąc.
4. Białka fluorescencyjne są oczyszczane jako białka z tagiem His₆ z E. Coli ¹. Należy zmierzyć widmo absorbancji oczyszczonego białka i przygotować roztwór stokowy o gęstości optycznej ~0,1 w buforze STE (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA), zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodatkowo należy przygotować 10 ml mieszaniny 1-oktanolu i buforu STE w stosunku 1:1 w 15 ml probówce stożkowej i energicznie wymieszać. Po wymieszaniu należy odstawić próbkę do całkowitego rozdzielenia faz. Fazą górną jest 1-oktanol. (Uwaga: Ze względu na silny zapach 1-oktanolu ważne jest stosowanie zamkniętego pojemnika na odpady dla wszystkiego, co miało kontakt z 1-oktanolem).
5. Aby przygotować emulsję, należy nanieść do probówki do wirówki mikroporowej 45 μl 1-oktanolu i 5 μl białka fluorescencyjnego. Należy kilka razy opukać probówkę palcem, aby zapoczątkować tworzenie emulsji, a następnie poddać probówkę sonikacji przez 30 sekund w kąpieli sonikacyjnej. W międzyczasie należy przygotować powleczone szkiełko przedmiotowe i nakrywkę. Po sonikacji emulsja powinna być całkowicie mętna. Natychmiast po sonikacji należy nanieść 4 μl emulsji ze środka probówki na powleczone szkiełko przedmiotowe i przykryć ją powleczoną nakrywką.
6. Jeśli procedura została wykonana prawidłowo, emulsja powinna równomiernie rozprzestrzenić się między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką. W ciągu kilku minut próbka powinna stać się stabilna, składając się z fluorescencyjnych kropli o grubości ~10 μm i zróżnicowanej średnicy. Największe krople znajdują się blisko centrum próbki, a mniejsze są zlokalizowane dalej, w stronę krawędzi.

2. Przygotowanie eksperymentu fotokonwersji

Poniższa procedura stanowi ogólną strategię przygotowania eksperymentu z fotokonwersją białek fluorescencyjnych. Procedurę tę można zastosować zarówno w przypadku białek oczyszczonych, jak i żywych komórek.

1. Poniższe parametry stanowią ogólny punkt wyjścia do konfiguracji eksperymentu fotokonwersji:
   obiektyw imersyjny olejowy 40x 1.3NA
   Rozmiar obrazu = 512 x 512 pikseli
   Zoom skanowania = 4
   
   Czas ekspozycji piksela (dwell time) = 6 μsec.
   Rozdzielczość Z (wielkość otworu pinhole) = 3 μm
2. Skonfiguruj dwa kanały detekcji dla fluorescencji początkowej i fotokonwertowanej, a także „kanał fotokonwersji”. W tym przykładzie wykorzystamy oczyszczone białko mOrange2, które jest fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym zmieniającym kolor z pomarańczowego na czerwony. Formę pomarańczową wykrywa się przy wzbudzeniu 561 nm, a fluorescencję zbiera się w zakresie od 570 nm do 630 nm. Fotokonwertowaną formę czerwoną wykrywa się przy wzbudzeniu 633 nm, a fluorescencję zbiera się w zakresie od 640 nm do 700 nm. Dla „kanału fotokonwersji” wybierz wzbudzenie 488 nm i zbieraj fluorescencję w zakresie od 490 nm do 540 nm. (Uwaga: obrazowanie w kanale fotokonwersji nie jest ściśle wymagane).
3. Użyj kanału do obrazowania fluorescencji początkowej z ciągłym skanowaniem, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.
4. Aktywuj kanał fotokonwersji i wybierz niską moc lasera. Rozpocznij obrazowanie serii time-lapse i stopniowo zwiększaj moc lasera do fotokonwersji, aż do zaobserwowania znaczącego wybielania fluorescencji początkowej. Kontynuuj skanowanie, dopóki fluorescencja początkowa nie zostanie wybielona w około 75%.
5. Dezaktywuj kanał fotokonwersji i aktywuj kanał detekcji fluorescencji fotokonwertowanej. Rozpocznij obrazowanie z wysokim wzmocnieniem detektora i niską mocą lasera, a następnie stopniowo zwiększaj moc lasera, aż do wykrycia fluorescencji fotokonwertowanej. Po wykryciu fluorescencji fotokonwertowanej można dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora dla uzyskania optymalnej jakości obrazu.
6. Na koniec należy zoptymalizować moc lasera używaną do fotokonwersji oraz czas trwania fotokonwersji. Zwiększenie mocy lasera do fotokonwersji przyspieszy tempo konwersji, jednak zbyt duża moc lasera doprowadzi do fotowybielenia białka.
7. Po ustaleniu optymalnej mocy i czasu trwania lasera do fotokonwersji, parametry te można wykorzystać do konfiguracji standardowego modułu fotowybielania lub FRAP, a „kanał fotokonwersji” nie będzie już potrzebny.

3. Optyczne podkreślanie z użyciem podwójnej sondy mOrange2 i Dronpa

Ze względu na przesunięte w stronę czerwieni właściwości widmowe, mOrange2 może być stosowane w połączeniu z zielonym fotoprzekładalnym białkiem fluorescencyjnym Dronpa do dwuzondowego optycznego podkreślania, co pozwala na selektywne wyróżnienie 4 poszczególnych populacji komórek (organelli).

1. Komórki hoduje się w szalkach MatTek z szklanym dnem i transfekuje na 24 godziny przed obrazowaniem, stosując standardową procedurę transfekcji Lipofectamine2000¹.
2. Należy przygotować mikroskop do fotokonwersji mOrange2 zgodnie z opisem w sekcji 2.
3. Należy skonfigurować mikroskop do fotoprzełączania Dronpa. Fluorescencję Dronpa można obrazować, korzystając z „kanału fotokonwersji” mOrange2 (patrz krok 2.2). (Uwaga: Należy zminimalizować moc lasera używaną do obrazowania Dronpa, ponieważ zbyt wysoka moc spowoduje inaktywację Dronpa). Należy dodać kanał do fotoaktywacji Dronpa. Do fotoaktywacji stosujemy dwufotonową ekscytację 800 nm, ale można to również osiągnąć przy użyciu ekscytacji 405 nm. Należy określić moc lasera wymaganą do obrazowania, fotoaktywacji i fotoinaktywacji fluorescencji Dronpa.
4. Ostrzeżenie: Fotokonwersja mOrange2 oraz inaktywacja Dronpa zachodzą podczas ekscytacji 488 nm. Ze względu na wysoką moc lasera wymaganą do fotokonwersji mOrange2, doprowadzi to również do inaktywacji fluorescencji Dronpa. Z drugiej strony, inaktywacja Dronpa zachodzi już przy znacznie niższej mocy lasera i może być przeprowadzona bez znaczącej fotokonwersji mOrange2.
5. Po ustawieniu parametrów fotokonwersji mOrange2 i fotoprzełączania Dronpa, optyczne wyróżnianie za pomocą podwójnej sondy osiąga się poprzez następujące kroki. Po pierwsze, należy inaktywować fluorescencję Dronpa w całym polu widzenia za pomocą ekscytacji 488 nm o niskiej mocy. Po drugie, należy wybrać obszar zainteresowania i przeprowadzić fotokonwersję mOrange2 za pomocą ekscytacji 488 nm o wysokiej mocy. Na koniec należy wybrać obszar zainteresowania, aby aktywować fluorescencję Dronpa.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Przygotowanie próbki kropli. A) Prawidłowo przygotowana próbka kropli. B) Próbka przygotowana bez powlekania szkiełka przedmiotowego i nakrywki. C) Próbka przygotowana bez dodania 0,1% BSA.

Rycina 2. Wpływ mocy i czasu trwania lasera do fotokonwersji na fotokonwersję mOrange2. Pojedyncze kropelki zawierające białko mOrange2 były poddawane ciągłej fotokonwersji przy użyciu różnych wartości mocy lasera 488 nm. Relatywna moc lasera wykorzystana do fotokonwersji wynosiła 10% (linia ciągła), 25% (linia przerywana) i 100% (linia kropkowana). A) Gatunek fluorescencyjny pomarańczowy. B) Fotokonwertowany gatunek fluorescencyjny czerwony.

Rycina 3. Optyczne podkreślanie z użyciem podwójnej sondy mOrange2 i Dronpa. A) Komórka wykazująca ekspresję mOrange2-Histone H2B i Dronpa-Mito przed fotokonwersją, wykazująca pomarańczową fluorescencję w jądrze oraz zieloną fluorescencję w mitochondriach. B) Fluorescencję Dronpa wyłączono za pomocą wzbudzenia 488 nm o niskiej mocy, co spowodowało minimalną fotokonwersję mOrange2. C) mOrange2 został poddany fotokonwersji do koloru czerwonego za pomocą wzbudzenia 488 nm o wysokiej mocy. D) Fluorescencję Dronpa ponownie włączono, stosując dwufotonowe wzbudzenie 800 nm. Panele stanowią nałożenie obrazów fluorescencyjnych na obraz z kontrastu różnicowego (DIC).

Dyskusja

Oczyszczona próbka białka fluorescencyjnego w formie kropli jest bardzo wygodnym formatem do charakterystyki fotofizycznej białek fluorescencyjnych, na przykład do badania kinetyki fotoblaknięcia i kinetyki fotokonwersji. Ekstremalnie mała objętość kropli (~20 picoliter) ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z fotoblaknięciem i fotokonwersją, które mogą być trudne do wykonania w systemach opartych na kuwetach. Ponadto, jak pokazano tutaj, próbka w formie kropli jest idealnie dostosowana do konfiguracji mikroskopu konfoka...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lamelki do mikroskopu	VWR international	48312-003
Szkiełka zakrywkowe 22 mm	Corning	2940-245
1-oktanol	Sigma-Aldrich	O4500
metylotrimetoksysilan	Sigma-Aldrich	M6420
Szalki MatTek	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019