Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju

Podsumowanie

Niniejszy film prezentuje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Obrazy żywych kultur pokazują wypustki neurytów oraz obrazowanie poziomu wapnia z wykorzystaniem Fura-2.

Streszczenie

W niniejszym filmie prezentujemy metodę przygotowania pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Procedura rozpoczyna się od wyjęcia mózgów z osobników w 70–78 godzinie po uformowaniu puparium. Przedstawiono wyizolowane mózgi po krótkiej inkubacji w papainie, a następnie po kilku etapach przemywania w bezserowym medium wzrostowym. Zilustrowano proces mechanicznej dysocjacji każdego mózgu w 5 μl kropli medium na szkiełku nakrywkowym. Aksony i dendryty neuronów pomitotycznych zostają odcięte w pobliżu somy podczas dysocjacji, jednak neurony zaczynają regenerować wypustki w ciągu kilku godzin od wysiania. Obrazy pokazują żywe kultury w drugim dniu. Neurony kontynuują tworzenie wypustek podczas pierwszego tygodnia hodowli. Specyficzne populacje neuronalne można zidentyfikować w kulturze, wykorzystując linie GAL4 do tkankowo specyficznej ekspresji markerów fluorescencyjnych, takich jak GFP lub RFP. Rejestracje typu whole-cell wykazały, że hodowane neurony tworzą funkcjonalne, spontanicznie aktywne synapsy cholinergiczne i GABAergiczne. Krótki fragment filmu ilustruje dynamikę wapnia w hodowanych neuronach przy użyciu Fura-2 jako barwnika wskaźnikowego wapnia w celu monitorowania spontanicznych przejściowych wzrostów stężenia wapnia oraz odpowiedzi wapniowych wywołanych nikotyną w naczyniu z hodowlą neuronów. Kultury mózgów poczwarki stanowią użyteczny system modelowy, w którym narzędzia genetyczne i farmakologiczne mogą być wykorzystane do identyfikacji czynników wewnętrznych i zewnętrznych wpływających na formowanie się i funkcjonowanie synaps ośrodkowych.

Protokół

Przygotowania przed dniem hodowli:

1. Przygotować sterylny roztwór do wycinania tkanek.
2. Przygotować sterylne podłoże DMEM i przechowywać w aliquotach po 10 ml w temperaturze 4°C przez 2 tygodnie.
3. Przygotować sterylne suplementy do podłoża DDM2 i zamrozić w aliquotach po 50 lub 100 µl na 1 miesiąc.
4. Przygotować mieszaninę ConA/laminina.
5. Pokryć szkiełka nakrywkowe.
        Opcjonalnie: Przygotować sterylne CNBM i przechowywać w zamrażarce do 4 miesięcy.

W dniu hodowli

I.  Przygotowanie roztworu enzymu (ES) w komorze z laminarnym przepływem powietrza

1. Do probówki do wirowania o pojemności 15 ml wlać 5 ml roztworu do sekcji (DS).
2. Odważyć 0,8 mg L-cysteiny do probówki eppendorf 0,6 ml i dodać 150 µl DS. Pipetować wielokrotnie do całkowitego rozpuszczenia kryształów.
3. Dodać 150 ml mieszaniny DS/cysteina do 5 ml DS i dokładnie wymieszać.
4. Dodać 50 U (jednostek) papainy.
5. Dodać 7 ml 0,1 N NaOH i dokładnie wymieszać. Po aktywacji roztwór stanie się klarowny w ciągu 30 min. 
6. Przefiltrować roztwór enzymu przez filtr strzykawkowy 0,2 mm do sterylnej probówki do mikrowirowania z nakrętką o pojemności 1,5 ml
    
      Papaina: Wymagane 50 U w 5 ml DS. Każda partia różni się nieco od siebie, dlatego należy obliczyć odpowiednią ilość:
                                    37,3 mg/ml i 28,3 U/mg
                                        37,3 x 28,3 = 1055,59 U/ml   (1000 ml)
                                                                50 U  = 47,4 ml
   

II. Przygotowanie pożywki DDM2

W dniu hodowli: dodać następujące suplementy w celu przygotowania pożywki DDM2

Do 10 ml DMEM należy dodać suplementy bezpośrednio przed hodowlą:

1. 100µl transferyny
2. 100µl putrescyny
3. 100µl selenu
4. 100µl progesteronu
5. 50µl  insuliny
6. 10µl 20-hydroksyeckdyzonu

Uwaga: Przygotować wystarczającą ilość DDM2 dla wszystkich planowanych kultur (każdy mózg osadzony na pojedynczym szkiełku nakrywkowym w osobnej szalce Petriego 35 mm, 1,5 ml pożywki na kulturę)

Kroki III-VI można przeprowadzić na niesterylnym blacie laboratoryjnym i powinny one zająć 45 minut lub mniej.

III. Zbieranie poczwarek

1. Pod mikroskopem stereoskopowym pobierz 10-15 poczek ze ścianek fiolki.
2. Umieść poczki w pokrywce suchej szalki Petri o średnicy 35 mm. 

Uwaga: Zazwyczaj wykorzystujemy mózgi poczwarek w przedziale od 55 do 78 godzin po utworzeniu puparium (APF). Wypreparowanie mózgu z młodszych poczwarek jest nieco trudniejsze, ponieważ torebki głowowe mają tendencję do zapadania się, natomiast ogólny poziom wzrostu neurytów jest nieco niższy u najstarszych poczwarek. W szczepie dzikim Canton-S stadia te rozpoznaje się po pigmentacji oczu, które mają kolor od jasnobrązowego do lekko czerwonawego, przy niewielkiej ilości pigmentu w pozostałych obszarach.

IV. Dekapitacja pod mikroskopem stereoskopowym

1. Nanieś dwie krople sterylnego roztworu do sekcji na pokrywkę szalki Petriego, obok poczwarek.
2. Ostrożnie utrzymaj pojedynczą poczwarkę za pomocą precyzyjnej pęsety w lewej ręce, a w prawej ręce użyj igły 27 G przymocowanej do strzykawki 1 cc, aby usunąć kutykulę z przedniego końca poczwarki.
3. Lekko ściśnij poczwarkę pęsetą i w momencie pojawienia się głowy użyj igły 27 G, aby przeciąć szyję.
4. Za pomocą czubka igły lub pęsety przenieś głowę do kropli roztworu do sekcji.
5. Powtarzaj czynność, aż w jednej kropli znajdzie się 10-15 głów.

V. Usunięcie mózgu z głowy pod mikroskopem dissectingowym

1. W każdej dłoni trzymaj strzykawkę 1 cc z igłą o rozmiarze 27 gauge.
2. Użyj ich do ustawienia głowy muchy w kropli roztworu do sekcji w taki sposób, aby trąba była skierowana w Twoją stronę, a powierzchnia grzbietowa głowy znajdowała się na górze.
3. Wprowadź lewą igłę w trąbę, aby unieruchomić głowę, a prawą igłą wykonaj nacięcie w prawym oku, biegnące od powierzchni brzusznej do grzbietowej.
4. Wprowadź prawą igłę obok lewej w okolicy trąby, a następnie za pomocą lewej igły delikatnie uciśnij kutykulę nad lewym okiem, przesuwając mózg w stronę nacięcia w prawym oku. Mózg powinien wysunąć się przez nacięcie po prawej stronie, będąc stosunkowo nienaruszonym, często z obydwoma płatami optycznymi, a niekiedy również z pigmentowaną tkanką oka.
5. Nasuń mózg na tylną część igły i przenieś go do kropli sterylnego soli fizjologicznej do sekcji w nowej sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm.
6. Zebierz 10-15 mózgów dla każdego genotypu.
   

VI. Usunięcie płatów optycznych i obróbka enzymatyczna

1. W każdej dłoni trzymaj strzykawkę o pojemności 1 cc z igłą o rozmiarze 27 G i użyj ich, aby zebrać wszystkie mózgi w jednym małym obszarze kropli roztworu do sekcji
2. Użyj strzykawek jako narzędzi tnących, aby usunąć płaty optyczne z każdego mózgu, tak aby tkanka pozostała do hodowli w obrębie centralnego regionu mózgu.
3. Użyj pipety automatycznej 20 µl, ustawionej na 5 µl, aby przenieść wszystkie mózgi jednego genotypu do probówki Eppendorf zawierającej 1 ml sterylnego roztworu papainy.
4. Mózgi inkubuj w papainie przez 10-15 minut na rotatorze ustawionym na 60 rpm.
5. Odwiruj w wirówce przy 3000 rpm przez 3 minuty.
   

Wewnątrz sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza – wszystkie kolejne etapy, podczas których tkanka jest wystawiona na działanie powietrza, powinny być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

VII. Płukanie

1. Usunąć roztwór enzymu i zastąpić go sterylnym roztworem do mikrodissekcji.
2. Wirować przy 3000 rpm przez 3 minuty.
3. Przemyć sterylnym roztworem do mikrodissekcji łącznie 3 razy.
4. Usunąć sól fizjologiczną do mikrodissekcji i zastąpić ją DDM2.
5. Wirować i przemywać łącznie 2 razy za pomocą DDM2.
6. Przenieść mózgi wraz z medium do sterylnej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
   

VIII. Trituracja i wysiew pod mikroskopem stereoskopowym

1. Nanieś 5 ul DDM2 na środek szkiełka podstawowego.
2. Przenieś 1 mózg do tej kropli DDM2 za pomocą żółtej końcówki.
3. Pod mikroskopem, używając igieł o rozmiarze 27 G, posiekaj mózg na małe kawałki (powinno to zająć <1 minuta).
4. Pod kontrolą wzrokową odłam końcówkę  szklana pipeta, której końcówkę zwężono do postaci cienkiego punktu, tak aby większe fragmenty można było delikatnie wessać do wnętrza końcówki pipety, a następnie wypuścić z powrotem do medium. Używamy gumowych końcówek do zasysania ustami, które standardowo towarzyszą szklanym kapilarom do hematokrytu o pojemności 100 µl.
   
   UwagaNależy zadbać o to, aby w medium nie powstały pęcherzyki powietrza; optymalny rozmiar pipety należy dobrać empirycznie. Odpowiednio dobrana pipeta pozwala na dysocjację mózgu w czasie około 30 sekund na jeden organ, w wyniku czego otrzymuje się zarówno pojedyncze komórki, jak i duże skupiska. Przy obserwacji przy większym powiększeniu około 10–20% neuronów powinno nadal posiadać wypustki, a w preparacie powinny być widoczne duże skupiska. Zbyt intensywna dysocjacja spowoduje, że wszystkie komórki staną się okrągłe i ulegną tak znacznym uszkodzeniom, że nie przeżyją. Etap ten wymaga wprawy i musi być przeprowadzony szybko, ponieważ ze względu na duży stosunek powierzchni do objętości osmolalność i pH kropli DDM2 mogą szybko ulec zmianie. Tkankę należy umieścić w CO₂ do inkubatora tak szybko, jak to możliwe.
   
   
5. Na pokrywce szalki Petriego zapisz: „Genotyp, data i godzina”.
6. Umieść szalkę Petriego o średnicy 35 mm w szalce Petriego o średnicy 100 mm (z wilgotną chusteczką Kimwipe) i pozostaw do ustabilizowania w CO2₂ inkubować przez 30 min.
7. Zapełnij 35 mm szalkę 1,5 ml pożywki DDM2.
8. Przechowywać hodowle w inkubatorze przy 5% CO2₂ inkubator (23°C).
   
   UwagaJeśli nie masz dostępu do chłodzącego CO2₂ inkubator, należy użyć standardowego inkubatora do hodowli tkanek ssaków i albo umieścić go w chłodni i nagrzać do 23°C, albo umieścić w laboratorium, wyłączyć regulację temperatury i użyć lodu w tacy na dnie inkubatora, aby utrzymać temperaturę w pobliżu temperatury otoczenia.
   

IX. Dokarmianie komórek

1. W dniu 1. (następnego dnia) dodać 0,5 ml CNBM/B27 (pożywka warunkowana), aby uzyskać stosunek DDM2:CNBM/B27 w proporcji 3:1.
2. W dniu 5. wymienić 1 ml pożywki na 3:1 DDM2:CNBM/B27.
3. Kontynuować dokarmianie komórek pożywką 3:1 DDM2:CNBM/B27 co 4-5 dni.
   
   Uwaga: Kultury można hodować bez nie-neuronalnej pożywki warunkowanej, jednak neurony wydają się wówczas nieco bardziej delikatne i trudniejsze do wykorzystania w eksperymentach elektrofizjologicznych.

Dyskusja

Neurony pozyskane z mózgów embrionalnych lub postnatalnych gryzoni mogą być hodowane w pierwotnych kulturach komórkowych, w których wydłużają neuryty i tworzą funkcjonalne połączenia synaptyczne. Metody przygotowywania takich kultur są dobrze ugruntowane, a badania na kulturach neuronalnych gryzoni odegrały kluczową rolę w identyfikacji genów i czynników środowiskowych zaangażowanych w regulację tworzenia i funkcjonowania synaps (Banker and Goslin, 1991). Choć neurony owadów z różnych gatunków również mogą być hodowane i...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Konkanawalina A		Sigma-Aldrich	C-2010	Do 2,5 mL DS dodać 25 mg konkanawaliny A z fiolki. Otrzymane stężenie wynosi 10 mg/ml. Przygotować aliquoty po 90 µl i przechowywać w temperaturze -20 °C nie dłużej niż przez 3 miesiące.
Laminina		Sigma-Aldrich	L-2020	Do fiolki zawierającej 1 mg lamininy dodać 1 mL DS. Otrzymane stężenie wynosi 0,5 mg/mL. Przygotować aliquoty po 10 μL i przechowywać w temperaturze -20 °C nie dłużej niż przez 3 miesiące.
Szkiełka nakrywkowe		Bellco Glass	1943-00012	Szklane szkiełka nakrywkowe 12 mm
Roztwór ConA + lamininy				Roztwór zapasowy do powlekania szkiełek nakrywkowych, przygotowany z zapasów Con A i lamininy: do 5 mL DS dodać 83,5 μL ConA (167 μg/mL) oraz 8,35 μuL lamininy (0,835 μg/mL). Wymieszać. Przygotować aliquoty po 100 μL i przechowywać w temperaturze -20 °C nie dłużej niż przez miesiąc.
Roztwór do sekcji (DS)	Bufor			Na 500 ml: 400 ml wody ultrafiltrowanej + 25 ml roztworu zapasowego A + 14 ml roztworu zapasowego B + 3,0 g (33,3 mM) D (+)-glukozy (Sigma G-8270) + 7,5 g (43,8 mM) sacharozy (Sigma S-0389). Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1N NaOH (około 2 ml). Dopełnić objętość końcową do 500 ml wodą ultrafiltrowaną. Przelać do czystej szklanej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako "Roztwór do sekcji" i przechowywać w 4°C.
Roztwór do sekcji (DS)	Bufor			Na 500 ml: 400 ml wody ultrafiltrowanej + 25 ml roztworu zapasowego A + 14 ml roztworu zapasowego B + 3,0 g (33,3 mM) D (+)-glukozy (Sigma G-8270) + 7,5 g (43,8 mM) sacharozy (Sigma S-0389). Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1N NaOH (około 2 ml). Dopełnić objętość końcową do 500 ml wodą ultrafiltrowaną. Przelać do czystej szklanej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako "Roztwór do sekcji" i przechowywać w 4°C.
Roztwór B: HEPES	Bufor	Sigma-Aldrich	H-3375	20,97 g (9,9 mM). Dodać wodę ultrafiltrowaną do objętości 200 ml. Mieszać do rozpuszczenia i dopełnić objętość końcową do 250 ml. Przenieść do czystej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako "Roztwór B" i przechowywać w 4°C.
Roztwór A	Bufor			Na 500 ml: 80,0 g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4,0 g (5,4 mM) KCl (Sigma P-4504) + 0,24 g (0,17 mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0,3 g (0,22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Odważyć wszystkie składniki i mieszać do rozpuszczenia w 400 ml wody ultrafiltrowanej. Dopełnić objętość końcową do 500 ml. Przenieść do czystej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako "Roztwór A" i przechowywać w 4°C.
Powlekanie szkiełek nakrywkowych: Umieścić autoklawowane szkiełka nakrywkowe w 60-milimetrowej szalce Petriego. Nanieść pipetą 5 µl mieszaniny Con A/lamininy na środek każdego szkiełka. Inkubować w 37°C przez 2 godziny. Przepłukać szkiełka 3 razy, używając za każdym razem 100 µl autoklawowanej wody. Użyć próżni podłączonej do sterylnej pipety Pasteura. Podczas ostatniego płukania podnieść szkiełko pęsetą i osuszyć obie strony. Przenieść szkiełko do 35-milimetrowej szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze pokojowej do miesiąca.