Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Streszczenie

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomicznych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Opracowanie usprawnionej procedury tworzenia i przesiewania bibliotek metagenomicznych jest zatem przydatne dla efektywnych, wysokoprzepustowych badań nad właściwościami genetycznymi i metabolicznymi niehodowlanych zbiorowisk drobnoustrojów. W niniejszym materiale w formie wideo przedstawiono kluczowe protokoły, co w naszej ocenie jest najużyteczniejszym formatem do precyzyjnego opisania długotrwałego procesu, który naprzemiennie opiera się na instrumentacji robotycznej i interwencjach manualnych. W pierwszej kolejności wykorzystano robotykę do naniesienia klonów z biblioteki na membrany makromacierzy o wysokiej gęstości, z których każda może zawierać powielone kolonie z dwudziestu czterech 384-dołkowych płytek bibliotecznych. Automatyzacja jest niezbędna w tej procedurze nie tylko ze względu na dokładność i szybkość, ale także ze względu na miniaturyzację skali, która jest wymagana, aby pomieścić dużą liczbę klonów bibliotecznych w bardzo gęstych układach przestrzennych. Po ich przygotowaniu zademonstrowano, w jaki sposób membrany makromacierzy mogą być przesiewane pod kątem poszukiwanych genów przy użyciu zmodyfikowanych wersji standardowych protokołów znakowania sond, hybrydyzacji membran i detekcji sygnału. Wizualną prezentację tych procedur uzupełniono szczegółowymi opisami pisemnymi poszczególnych etapów oraz listą wymaganych materiałów, które są dostępne online wraz z filmem.

Protokół

1. Procedura hybrydyzacji

Jedna probówka do hybrydyzacji pomieści 1 lub 2 membrany (o rozmiarze 22 by 22 cm). Na każdą probówkę do hybrydyzacji należy użyć 50 ml mieszaniny do hybrydyzacji i 0,5 mg sondy DNA (stężenie końcowe 10 ng/ml). Dla uzyskania najlepszych wyników jako sondę należy zastosować DNA oczyszczone w żelu. W przypadku zwiększania skali przygotowania sondy, należy zwiększyć liczbę probówek, a nie ilość odczynników w jednej probówce.

Przygotowanie sondy (0,5 mg DNA):

1. Rozcieńczyć 15 μl roztworu łącznika (cross-linkera) w 60 μl wody.
2. Rozcieńczyć DNA wodą do stężenia 10 ng/μl, osiągając całkowitą objętość 50 μl w mikroprobtce z nakrętką.
3. Denaturować DNA przez 5 min w wrzącej wodzie.
4. Szybko przenieść na lód i schłodzić przez 5 min. Krótko wirować.
5. Dodać 50 μl buforu reakcyjnego i delikatnie wymieszać.
6. Dodać 10 μl odczynnika znakującego i delikatnie wymieszać.
7. Dodać 50 μl rozcieńczonego roztworu łącznika z kroku 1 i delikatnie wymieszać. Delikatnie wymieszać na wortexie i krótko wirować.
8. Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min.
9. Przechowywać na lodzie do 2 h lub dodać równą objętość 100% glicerolu i przechowywać w temperaturze -20°C.
   
   Uwaga: Należy używać wody dostarczonej w zestawie. Wszystkie odczynniki należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

Przygotowanie membrany i hybrydyzacja

1. Podgrzać 50 ml buforu do hybrydyzacji oraz probówkę do hybrydyzacji do temperatury 60°C.
2. Dodać bufor do hybrydyzacji do probówki do hybrydyzacji. Zwinąć membranę(y) i umieścić w probówce do hybrydyzacji. (W przypadku dodawania 2 membran do jednej probówki, najpierw całkowicie zwinąć jedną membranę, a następnie zwinąć drugą membranę na wierzchu w tym samym kierunku).
3. Inkubować probówkę do hybrydyzacji w temperaturze 60°C przez co najmniej ½ h. (Należy upewnić się, że membrana(y) zostały całkowicie nasączone).
4. Przenieść za pomocą długiej pipety około 1 ml buforu do hybrydyzacji z probówki do hybrydyzacji do probówki zawierającej znakowaną sondę. Delikatnie wymieszać na wirówce (vortex) i krótko odwirować. Przenieść mieszaninę z powrotem do probówki do hybrydyzacji.
5. Inkubować w temperaturze 60°C przez noc.
   
   Uwaga: Podczas pracy z membranami należy używać pęsety i rękawiczek. Zawartość probówek do hybrydyzacji należy mieszać delikatnie, ponieważ zbyt silne wytrząsanie spowoduje trwałe powstanie niepożądanej piany. Membrany powinny być dodawane w stanie wilgotnym; w razie potrzeby namoczyć je w buforze do hybrydyzacji lub wodzie i odlać nadmiar cieczy przed dodaniem.

2. Procedura detekcji

Przemywanie membran

1. Podgrzać główny bufor płuczący do 60°C. (Użyć kuchenki mikrofalowej i/lub płyty grzewczej).
2. Jeśli w jednej probówce do hybrydyzacji znajdują się 2 membrany, przenieść jedną membranę do czystej, podgrzanej, pustej probówki do hybrydyzacji.
3. Krótko wypłukać probówkę do hybrydyzacji około 50 ml głównego buforu płuczącego.
4. Dodać około 100 ml głównego buforu płuczącego do probówki do hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 60°C przez 10 min.
5. Powtórzyć kroki 3 i 4.
6. Przenieść membranę do pojemnika do płukania i inkubować w co najmniej 250 ml wtórnego buforu płuczącego w temperaturze pokojowej przez 5 min.
7. Powtórzyć krok 6.
   
   Uwaga: Membrany można przechowywać we wtórnym buforze płuczącym w temperaturze pokojowej do ½ h przed generowaniem sygnału.

Generowanie i detekcja sygnału (procedura dla jednej błony)

1. Przyklej dwa kawałki folii spożywczej (SaranWrap) na płasko do blatu stołu (jeden dla kroku 2, a drugi dla kroku 4).
2. Ostrożnie usuń nadmiar buforu z membrany, dotykając jej rogów o ściankę pojemnika, a następnie przenieś membranę na folię spożywczą (stroną z próbką do góry).
3. Wlej 6-7 ml odczynnika ECF na membranę i złóż folię spożywczą tak, aby przykryła membranę. Ostrożnie rozprowadź odczynnik ECF po całej powierzchni membrany, delikatnie przesuwając chusteczką Kimwipe po folii spożywczej. Inkubuj przez 5 min.
4. Usuń nadmiar odczynnika ECF z membrany i przenieś ją na nową folię spożywczą, złóż folię nad membraną i zaklej krawędzie taśmą. Przykryj membranę folią aluminiową. Inkubuj przez 1-2 h.
5. Przygotuj szklaną płytę skanera, rozprowadzając na niej 1-2 ml odczynnika ECF. Następnie przenieś membranę na płytę szklaną (stroną z próbką do dołu) i rozprowadź kolejne 1-2 ml odczynnika ECF na membranie. Przykryj całość folią spożywczą i ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z obszaru membrany. (Na folii spożywczej można położyć sztywną płytkę, aby utrzymać membranę dociśniętą do szklanej płyty).
6. Użyj skanera fluorescencyjnego Fuji FLA-5100 (tryb „1 laser 1 image”) z następującymi ustawieniami: wzbudzenie 473 nm, filtr detekcyjny LPB (510 nm), rozdzielczość 50 μm, 16-bitowa gradacja sygnału, CH1 400 V. (Skanowanie trwa około 15-20 min dla membrany o rozmiarze 22 na 22 cm).
   
   Opcjonalnie:
   
   
7. Pozostaw na 2-4 h (lub dłużej).
8. Powtórz skanowanie zgodnie z krokiem 6.

3. Procedura płukania i przechowywania (wersja NUF)

1. Przenieść membranę do 100% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min przy delikatnym mieszaniu.
2. Wymienić na świeży 100% etanol i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. (Membrana może pozostać w etanolu przez kilka dni).
3. Zastąpić etanol wodą destylowaną i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
4. Do probówki do hybrydyzacji dodać 100 ml wody i 5 ml 10% SDS (stężenie końcowe 0,5% SDS), a następnie delikatnie wymieszać. Dodać membranę.
5. Inkubować w temperaturze 80°C przez 1 h.
6. Przenieść membranę do czystego, pustego pojemnika.
7. Do zlewki dodać 500 ml wody i 5 ml 10% SDS (stężenie końcowe 0,1% SDS), a następnie doprowadzić do gwałtownego wrzenia w kuchence mikrofalowej.
8. Wylać prawie wrzący roztwór 0,1% SDS na membranę i delikatnie mieszać przez kilka minut. Pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej.
9. Płukać w co najmniej 250 ml sterylnego 100 mM Tris pH 8 przez co najmniej 10 min.
10. Zawiń membranę w folię SaranWrap i starannie zaklej brzegi taśmą. Przechowywać w temperaturze 4°C. (Membrany nigdy nie mogą wyschnąć).

Dyskusja

Procedura strippingu nie została zoptymalizowana. Jednakże procedura strippingu podana w instrukcji producenta (po 2 płukania przez 10 min w 100% etanolu, 1 płukanie przez 1 h w 60°C w 0,5% SDS) jest niewystarczająca. Aby rozpuścić produkt reakcji ECF, konieczna jest inkubacja w 100% etanolu przez co najmniej jedną noc; wydaje się, że kilkudniowa inkubacja w 100% etanolu nie wpływa negatywnie na możliwość ponownego badania membrany. Obróbka SDS zalecana przez producenta również wydaje się niewystarczająca. NUF z sukcesem...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki do bezpośredniego znakowania AlkPhos	zestaw	Amersham	RPN3680	Zawiera odczynnik do znakowania, roztwór łącznika krzyżującego, bufor reakcyjny, wodę, kontrolne DNA, bufor do hybrydyzacji, odczynnik blokujący. Bufor do hybrydyzacji i odczynnik blokujący przechowywać w temperaturze pokojowej, pozostałe odczynniki w temperaturze 2-8°C.
Podłoże ECF	zestaw	Amersham	RPN3685	Zawiera podłoże ECF, bufor do rozcieńczania podłoża ECF. Uwaga: Opakowanie zawiera łącznie 60 ml odczynnika; należy podzielić na próbki po 10 ml w probówkach Falcon i przechowywać w temperaturze 20°C. Zużycie wynosi około 10 ml na membranę (rozmiar 22 na 22 cm).
20x bufor do płukania wtórnego	bufor			121 g Tris (stężenie końcowe 1 M), 117 g NaCl (stężenie końcowe 2 M). Dostosować pH do 10. Dopełnić wodą do 1 L. Przechowywać w temperaturze 2-8°C do 4 miesięcy.
Bufor 0,5 M NaH2PO4 pH 7	bufor			69 g NaH2PO4.H2O. Dostosować pH do 7 za pomocą NaOH. Dopełnić wodą do 1 L. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
1 M MgCl2				50,8 g MgCl2.6H2O. Dopełnić wodą do 250 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
10% (w/v) SDS				20 g SDS. Dopełnić wodą do 200 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Zestaw kombinowany RPN3692 = RPN3680 + RPN3685