Ten protokół jest fragmentem z Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).
1. Budowa Skrzynki Probierczej Wyspy
- Przygotuj tacę wykonaną z wytrzymałego materiału, takiego jak polimetakrylan metylu (PMMA), aby pomieścić warstwę wody (np. kąpiel). Upewnij się, że materiał nie jest biały.
UWAGA: Zalecane są wymiary 40 x 35 x 2,5cm3 (Rysunek 1A).
- Przygotuj pudełko (42 x 38 x 25 cm3) wykonane z wytrzymałego, przezroczystego materiału, takiego jak PMMA, które należy umieścić wokół wanny, aby zapobiec ucieczce much do przestrzeni laboratoryjnej. Umieść otwór (20 x 30 cm2) po bocznej stronie, który jest wystarczająco duży, aby eksperymentator mógł łatwo poradzić sobie z fiolkami z muchami i upuścić je na wyspę (Rysunek 1A).
- Przygotuj podwyższoną platformę o wymiarach 10 x 15 x 2,5 cm3, wykonaną z nieprzepuszczalnego materiału (PMMA lub tworzywa sztucznego), który jest wodoszczelny.
UWAGA: Platforma ta musi mieć jednolitą białą powierzchnię, aby zapewnić dobry kontrast do analizy obrazu. Rozmiar niekoniecznie jest stały, ale powinien być wystarczająco duży, aby upewnić się, że wszystkie muchy początkowo wylądują na platformie i będą miały szansę po niej chodzić (Rysunek 1A).
- Zamocuj platformę, przyklejając ją do wanny lub umieszczając ciężarki lub inne ciężkie przedmioty w skrzynce platformy, aby zapobiec zmianom położenia platformy podczas sesji eksperymentalnej/filmowej.
2. Wymagania dotyczące oprogramowania i instalacja
- Instalacja oprogramowania do rejestracji obrazu.
- Pobierz oprogramowanie do nagrywania obrazów, aby nagrać serię zdjęć wyspy (patrz tabela materiałów) i zainstaluj oprogramowanie na komputerze.
UWAGA: Oprogramowanie do nagrywania obrazów opisane w tym protokole jest obsługiwane tylko przez system Windows. Do Tabeli Materiałów została dodana alternatywa dla innych użytkowników.
3. Przygotowanie much do testowania na wyspie
- Zebrać inscenizowane muchy dla każdego warunku eksperymentalnego w znieczuleniu zimnym lub dwutlenkiem węgla (CO2), jak opisano wcześniej (przez okres 1 - 2 dni).
- Przygotować co najmniej 3 fiolki z próbkami na warunki doświadczalne, z których każda zawiera około 15 zaawansowanych much. Używaj tylko much z nienaruszonymi skrzydłami i w podobnym wieku i płci.
UWAGA: Do opisanych tutaj eksperymentów, 5 fiolek z próbkami zawierających 15 samców much o genotypach w-; Aktyna-Gal4/+ (kontrola) i w-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) pobrano w dniu eklizacji, starzano przez 4 dni i wykorzystano do przeprowadzenia testu wyspowego. RNAi, szczepy kontrolne i sterownik Actin-gal4 uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
- Pozwól muszkom zregenerować się, aby uniknąć skutków znieczulenia (co najmniej 1 dzień w przypadku stosowania CO2 ) przed przetestowaniem zebranych much w teście wyspowym w wieku zainteresowania.
4. Konfiguracja eksperymentalna
UWAGA: Zobacz Rysunek 1B.
- Do wanny wlej zimną wodę z niewielką ilością mydła i ustaw platformę na środku.
UWAGA: Mydło zmniejsza napięcie powierzchniowe wody; muchy, które dotkną wody, utoną. Zapobiega to zwiększaniu się liczby much latających w pudełku podczas postępów sesji eksperymentalnej.
- Umieść przezroczyste pudełko na wierzchu tacy i oświetl platformę od góry za pomocą lampy.
UWAGA: Oświetlenie platformy jest wymagane przede wszystkim w celu zapewnienia odpowiedniego kontrastu wideo. Odpowiednia jest do tego zwykła lampa LED 12 V.
- Umieść kamerę internetową bezpośrednio nad platformą (na zewnątrz pudełka) i podłącz ją do komputera.
- Utwórz nowe foldery na komputerze, aby przechowywać różne dane eksperymentalne przed eksperymentami.
- Postępuj zgodnie ze strukturą przykładu zilustrowaną w Rysunek 2A, aby utworzyć foldery. Na przykład, jeśli projekt eksperymentu wymaga przetestowania dwóch genotypów z pięcioma powtórzeniami każdy, najpierw utwórz główny folder zawierający datę eksperymentu. Wewnątrz folderu głównego utwórz dwa podfoldery (po jednym na genotyp). Wewnątrz folderów genotypu utwórz pięć nowych podfolderów, po jednym na replicate.
UWAGA: Do dalszej analizy niezbędne jest, aby serie obrazów odpowiadające poszczególnym eksperymentom były zapisywane w folderach o unikalnych nazwach.
5. Ustawienia wideo w sekcji "Urządzenie przechwytujące" interfejsu
- Otwórz oprogramowanie do nagrywania obrazu i w zakładce "Przechwytywanie" kliknij "Obrazy poklatkowe..." i wybierz odpowiednią kamerę internetową jako "Urządzenie przechwytujące".
- Umieść martwą muchę na wyspie; dostosuj ustawienia wideo, klikając pole "Ustawienia wideo". Przewijaj paski narzędzi, dostosowując jasność, kontrast i kolor w taki sposób, aby martwa mucha wydawała się na białym tle (Rysunek 2B). Po zakończeniu regulacji kliknij "OK".
6. Ustawienia nagrywania i zapisywania wideo w sekcji "Time-lapse" interfejsu
- Dostosuj ustawienia w "Ustawieniach filmu poklatkowego", aby zapisać eksperyment jako plik .avi. Kliknij "Przeglądaj...", wybierz katalog, w którym film będzie przechowywany, zdefiniuj nazwę filmu i naciśnij "zapisz".
UWAGA: Plik wideo nie jest używany do ilościowego określania danych; Jednak może być przydatne, aby uzyskać ogólne pojęcie o eksperymencie.
- Dostosuj ustawienia w sekcji "Ustawienia filmu poklatkowego".
- W polu kompresji wybierz "Intel IYUV code" dla kompresji wideo i wybierz "Rób jedną klatkę co 0.1 sekundy", z "Szybkością odtwarzania (obrazy na sekundę):" na 10.
- Zapisz szereg czasowy eksperymentu jako .bmp klatki, klikając "Zaawansowane..." Wybierz "Utwórz obraz .bmp dla każdej przechwyconej klatki". Kliknij "Przeglądaj". Wybierz ten sam katalog w oknie "Podczas przechwytywania filmu AVI" (jak wybrano w kroku 6.1), kliknij "Otwórz" i naciśnij "OK".
UWAGA: Zwróć uwagę, że podczas eksperymentu ramki są przechowywane jako pliki .bmp (wymagane do analizy danych). Program nazywa ramki jako "A", po których następuje numer odpowiadający sekwencji przechwytywania ramek (np. "A_number.bmp") (Rysunek 2C). Zawsze zapisuj obrazy należące do różnych eksperymentów w nowym folderze, aby mieć pewność, że poprzednio nagrane serie obrazów nie zostaną nadpisane. Należy pamiętać, że obrazy nie są automatycznie zapisywane w tym samym folderze co plik wideo, chyba że ten folder zostanie wybrany w sekcji "Przeglądaj..." po kliknięciu pola "Zaawansowane".
7. Test wyspy i zbieranie danych
- Naciśnij przycisk start w interfejsie obrazu poklatkowego w oprogramowaniu do nagrywania obrazu, aby rozpocząć nagrywanie.
- Postukać w eksperymentalną fiolkę zawierającą muchy (krok 3) 2-3 razy, aby upewnić się, że muchy znajdują się na dnie fiolki. Szybko wyjmij korek z fiolki i energicznym ruchem postukaj w fiolkę o platformę, tak aby wszystkie muchy spadły na platformę w tym samym czasie (Rysunek 1C).
- Po około 30 s naciśnij przycisk "Stop", aby zatrzymać nagrywanie.
UWAGA: Jeśli wszystkie muchy znikną z platformy, nagrywanie można zatrzymać wcześniej.
- Usuń muchy, które pozostały na platformie przez 30 sekund ręcznie po zatrzymaniu nagrywania obrazu.
- Zanim przejdziesz do nagrywania następnego eksperymentu, zmień katalog docelowy dla .bmp plików i filmów (patrz sekcja 6).
