Montowanie mózgów dorosłych Drosophila: metoda przygotowania szkiełek do obrazowania konfokalnego

Ten protokół jest fragmentem Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montaż mózgów dorosłych D. melanogaster na szkiełkach mikroskopowych i obrazowanie

1. Zbuduj zjeżdżalnię "mostową". Umieść dwa "podstawowe" szkiełka nakrywkowe w odległości około 1 cm od siebie na dodatnio naładowanym szkiełku. Upewnij się, że dodatnio naładowana strona zjeżdżalni jest skierowana do góry. Przyklej szkiełka nakrywkowe do szkiełka za pomocą lakieru do paznokci, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A. Zwykle pomocne jest uszczelnienie trzech zewnętrznych krawędzi każdej szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby upewnić się, że nośniki montażowe nie przesiąkają pod tymi szkiełkami nakrywkowymi. Pozostaw lakier do paznokci do całkowitego wyschnięcia (10 - 15 min) przed kontynuacją.
2. Umieścić szkiełko podstawowe pod mikroskopem stereoskopowym i odpipetować roztwór podłoża mocującego zawierający wypreparowane mózgi do przestrzeni między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Aby zapewnić większy kontrast, warto manewrować światłami na gęsiej szyi tak, aby były równoległe do blatu.
3. Usuń dodatkowe media mocujące ze szkiełka za pomocą pipety, uważając, aby nie odpipetować mózgów z szkiełka.
4. Odsuń dodatkowe nośniki montażowe. Pozwoli to na dokładniejsze ułożenie mózgów podczas następnego kroku.
5. Używając kleszczy i mikroskopu stereoskopowego, ustaw mózgi na szkiełku w siatce z płatami czułków skierowanymi do góry.
6. Umieść szkiełko nakrywkowe ("most") na mózgach (Rysunek 1A). Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka nakrywkowego mostka w miejscu, w którym stykają się z "podstawowymi" szkiełkami nakrywkowymi.
7. Za pomocą pipety p200 powoli wypełnij środkową wnękę pod mostkiem świeżymi mediami montażowymi (Rysunek 1B). Umieszczaj po jednej kropli na otwartej krawędzi środkowego szkiełka nakrywkowego i pozwól, aby nośnik montażowy przesunął się pod środkową szkiełko nakrywkowe. Kontynuuj, aż cała wnęka zostanie wypełniona nośnikiem montażowym, a następnie uszczelnij górę i dół przezroczystym lakierem do paznokci
.
8. Po wyschnięciu lakieru do paznokci natychmiast zobrazuj szkiełka lub przechowuj je w światłoszczelnym, szczelnym pudełku na szkiełka w temperaturze -20 °C.
9. W ciągu tygodnia zobrazuj mózgi za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego z laserami wzbudzającymi i kostkami filtrującymi odpowiednimi dla wybranych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych. Obrazy Z-stack neuronów ciała grzyba są zwykle uzyskiwane przy użyciu obiektywów 20X lub 40X. Obrazowanie neuronów fotoreceptorowych siatkówki może wymagać większego powiększenia.

Rycina 1: Montowanie mózgów w ramach przygotowań do obrazowania immunofluorescencyjnego. (A) Mózgi są montowane na szkiełkach SuperFrost Plus z osłoną mostka, aby zapobiec spłaszczeniu mózgów. Dwa "bazowe" szkiełka nakrywkowe przykleja się do dodatnio naładowanego szkiełka Superfrost Plus za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, a następnie wypreparowane mózgi są umieszczane na szkiełku między nimi. Nad mózgami umieszcza się przezroczyste szkiełko nakrywkowe typu "mostek", które przylega do szkiełek nakrywkowych. (B) Po wyschnięciu lakieru do paznokci Vectashield jest powoli pipetowany pod mostkiem, aby zachować fluorescencję przeciwciała wtórnego. Przezroczysty lakier do paznokci jest następnie używany do uszczelnienia górnej i dolnej części szkiełka nakrywkowego "mostka". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.