Ten protokół jest fragmentem Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).
1. Przygotowanie stacji sekcyjnej
- Umieść mikroskop stereoskopowy i źródło światła z dołączonymi światłowodami na gęsiej szyi na dużym blacie. Aby promować pewne ruchy dłoni i zmniejszyć "drgania" dłoni podczas sekcji, konieczne jest zapewnienie odpowiedniej przestrzeni do odpoczynku dłoni i podłokietników wokół mikroskopu. Upewnij się, że po obu stronach mikroskopu jest około 8 - 10 cali i 4 - 6 cali między podstawą mikroskopu a krawędzią stołu.
- Napełnij 2 lub 3 dołki szklanego naczynia 9- lub 3-dołkowego 1,0 ml buforu PTN (0,1 M bufor fosforanowy sodu pH 7,2, 0,1% niejonowy środek powierzchniowo czynny, patrz Tabela materiałów dla kompletnych składników buforu) i umieść obok stacji preparacyjnej na lodzie. Nowo wypreparowane mózgi zostaną przeniesione do tego naczynia i przechowywane do etapu fiksacji.
UWAGA: Jeśli wymagane jest obrazowanie na żywo, buforem do rozwarstwiania powinien być 1x bufor soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) lub bufor HL3. Jeśli wymagana jest wewnątrzkomórkowa lokalizacja białka, PBS może być również stosowany jako alternatywny bufor do preparacji i utrwalania. Po utrwaleniu należy przeprowadzić przepuszczalność błon komórkowych za pomocą płukanek PTN zawierających 0,1% lub 0,3% detergentu niejonowego.
- Jeśli PBS jest używany do preparowania i utrwalania, końcówki pipet należy przepłukać co najmniej jeden raz buforem zawierającym detergent (takim jak PTN), aby zapobiec przywieraniu mózgu do plastikowych końcówek pipet podczas przenoszenia do probówek do mikrowirówek.
- Używając pustej szklanej lub plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm, zbuduj naczynie do rozwarstwiania zawierające elastomer silikonowy. Krótko wymieszaj składniki elastomeru zgodnie ze wskazówkami producenta, przelej do naczyń o średnicy 35 mm i pozostaw na noc do polimeryzacji na płaskiej powierzchni. Naczynia do preparowania zawierające elastomer powinny być używane do ochrony cienkich końcówek kleszczy preparacyjnych, które mogą łatwo ulec uszkodzeniu, jeśli dojdzie do kontaktu kleszczyków z twardszą powierzchnią, taką jak szklane naczynie. Regularnie kupujemy również dostępne na rynku naczynia pokryte silikonem w sklepach internetowych. Aby zwiększyć kontrast podczas sekcji, szczególnie przydatne są naczynia do rozwarstwiania z elastomeru silikonowego zawierające inaktywowany węgiel drzewny (a tym samym zabarwione na czarno).
2. Procedura sekcji mózgu dorosłego
- Znieczulić 3 - 5-dniowego dorosłego D. melanogaster za pomocą CO2 lub za pomocą lodu. Jeśli używasz lodu, umieść fiolkę zawierającą muchy do góry nogami (korkiem do dołu) w wiaderku z lodem na ~5 minut. Umieszczenie fiolki w lodzie do góry nogami zapobiega zagnieżdżaniu się much w żywności. Po znieczuleniu much umieść je na zimnej metalowej podkładce lub szalce Petriego, siedząc w lodzie lub na podkładce na muchy emitujące CO2. W przypadku preparacji mózgów w celu analizy neurodegeneracji można również użyć starszych much.
- Umieść niewielką ilość (150 - 200 μl) PTN na środku naczynia rozwarstwiającego za pomocą pipety transferowej lub pipety p200, aby utworzyć "pęcherzyk" PTN. Umieść naczynie preparacyjne pod mikroskopem stereoskopowym i wyreguluj oświetlenie i ostrość tak, aby pęcherzyk PTN wypełniał pole widzenia i był równomiernie oświetlony.
- Manipuluj muchami tak, aby były "brzuchem do góry" (tj. brzuszną stroną do góry) podczas leżenia na metalowej podkładce lub CO2 .
- Używając jednej pary kleszczy #5, chwyć odwłok muchy, która ma być wycięta i, trzymając muchę, całkowicie zanurz ją w PTN na naczyniu preparacyjnym.
UWAGA: W pozostałej części protokołu wszystkie kroki należy wykonać, gdy głowa jest zanurzona w PTN.
- Używając drugiej pary kleszczy #5, chwyć podstawę trąbki muchowej i rozsuń dwie pary kleszczy, aby odłączyć głowę muchy od ciała. Odrzuć brzuch i klatkę piersiową. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby głowica nie została zwolniona i mogła unosić się na powierzchni PTN. Gdy głowa unosi się na wodzie, może być bardzo trudno ją ponownie chwycić bez zmiażdżenia mózgu.
UWAGA: Za pomocą tej metody przerywane są połączenia między mózgiem a brzusznym rdzeniem nerwowym. Jeśli wymagane są nienaruszone połączenia między tymi regionami OUN, należy postępować zgodnie z alternatywnym protokołem sekcji. Jeśli trąba odczepi się od głowy muchy przed usunięciem głowy, w miejscu, w którym znajdowała się trąbka, pojawi się otwór. W takim przypadku chwyć głowę muchy na krawędzi otworu w pobliżu jednego oka. Następnie zdejmij głowę z umiarkowaną siłą, jednocześnie odciągając od siebie dwie pary kleszczy. Czasami, gdy głowa jest usuwana z ciała, jelito i/lub brzuszny rdzeń nerwowy pozostaje przyczepiony do głowy i powinien zostać usunięty przed kontynuowaniem sekcji.
- Podczas gdy jedna para kleszczy chwyta trąbkę, druga para powinna chwycić przyśrodkową krawędź prawego oka muchy. Powoli odsuń kleszcze od siebie. Ten krok powinien być wykonywany z niewielką ilością stałej siły bocznej. Gdy kleszcze powoli oddalają się od siebie, trąbka powinna odsunąć się od głowy i utworzyć centralny otwór w naskórku głowy. Wyrzuć trąbkę za pomocą pierwszej pary kleszczy, nie zwalniając przyśrodkowej części prawego oka z drugiej pary.
UWAGA: Mózg dorosłego D. melanogaster znajduje się w ogonowym (tj. tylnym/tylnym) obszarze głowy muchy. Dlatego należy unikać chwytania tego obszaru głowy. Idealnie byłoby, gdyby kleszcze bezpośrednio chwytały tylko rostralną (tj. przednią) część głowy w pobliżu siatkówki przyśrodkowej. Mózg i związana z nim tchawica powinny być teraz widoczne przez centralny otwór w naskórku. W tym czasie wszelkie białe, żylaste nitki tchawicy wystające z otworu można usunąć i wyrzucić.
- Drugą parą kleszczy chwyć przyśrodkową krawędź lewej siatkówki (na krawędzi środkowego otworu w naskórku głowy). Aby usunąć siatkówki i związane z nimi naskórka, powoli odciągnij kleszcze od siebie pod kątem 180°. Gdy siatkówka oddziela się od leżącego poniżej płata wzrokowego, powinieneś odczuwać lekki spadek napięcia. Postępuj powoli, aby zapobiec rozerwaniu płata optycznego.
UWAGA: Zbyt szybkie oddzielenie kleszczy na tym etapie może spowodować rozerwanie płata wzrokowego lub rozerwanie struktur ciała grzyba. Czasami naskórek zostanie usunięty, ale kawałki siatkówki pozostaną przyczepione do płata wzrokowego. W przypadku obrazowania ciał grzybów nie jest całkowicie konieczne usunięcie całej siatkówki. Jednak analiza innych obszarów mózgu (takich jak unerwienie neuronów siatkówki w płatach mózgowych wzrokowych) może wymagać całkowitego usunięcia siatkówki, jak opisano w.
UWAGA: Ponieważ siatkówka jest powoli oddzielana od leżącego poniżej płata wzrokowego mózgu, płat wzrokowy powinien być widoczny jako nieprzezroczysta biała struktura pokryta białą, żylastą tchawicą. Po usunięciu jednej siatkówki można ją wyrzucić. Analizując odnajdywanie ścieżki neuronów siatkówki, należy zachować szczególną ostrożność na tym etapie, aby zapobiec uszkodzeniu płata wzrokowego. Dostępny jest również dodatkowy protokół skoncentrowany na sekcji i obrazowaniu na żywo neuronów fotoreceptorowych.
- Teraz ostrożnie usuń jak najwięcej widocznej tchawicy. Tchawica może już zawierać lub później wypełnić się powietrzem, powodując unoszenie się mózgu i potencjalnie utratę podczas późniejszych etapów barwienia immunologicznego. Aby usunąć tchawicę, usuń ją z mózgu za pomocą bardzo ostrej pary kleszczy #5.
- Usuń pozostałą siatkówkę i otaczający naskórek, używając obu par kleszczy, aby chwycić przyśrodkowy obszar lewej siatkówki muchy. Ostrożnie rozerwij siatkówkę na pół, aby usunąć kawałki siatkówki i naskórka. W niektórych przypadkach usunięcie pozostałego naskórka bez zmiażdżenia mózgu okazuje się szczególnie trudne. W tych przypadkach stwierdziliśmy, że pozostałe pasma brzusznego rdzenia nerwowego można zamiast tego chwycić jedną parą kleszczy, podczas gdy druga para kleszczy służy do ostrożnego usunięcia ostatniej części naskórka.
- Za pomocą pipety p200 przenieś wypreparowane mózgi do jednego dołka 9- lub 3-dołkowego naczynia zawierającego PTN. Mózgi o tym samym genotypie powinny być zebrane razem w tej samej studni i trzymane na lodzie. Tkanka mózgowa powinna zostać utrwalona w ciągu godziny od sekcji. Mózgi mogą być ustalane w małych partiach i łączone, jeśli wymagana jest większa liczba mózgów. W większości przypadków doświadczony badacz może zwykle przeprowadzić sekcję mózgu i przenieść go do szklanego naczynia zbiorczego w ciągu około 3 - 5 minut.
