$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Koyle et al., Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych, J. Vis. Exp.(2016).
1. Przygotuj klatki do składania jaj
- Przygotuj talerze agarowe z sokiem winogronowym, podgrzewając w kuchence mikrofalowej 100 ml wody, 10 g drożdży piwnych, 10 g glukozy i 1 g agaru. Doprowadź do wrzenia 3 razy w kroku 1.1 i dodaj 10 g mrożonego koncentratu soku winogronowego, aby zwiększyć widoczność jaj na talerzu agarowym.
- Gdy agar ostygnie do temperatury 55 °C, wlać 20 ml do szalek Petriego o średnicy 100 mm i pozostawić do zestalenia.
- Przykryj powierzchnię płytek agarowych pastą drożdżową, mieszając 1 g drożdży piwnych z 15 g wody. Wlej pastę drożdżową na płytkę agarową, upewniając się, że powierzchnia jest pokryta, a następnie odlej nadmiar, pozostawiając cienką pozostałość drożdży. Jeśli używanych jest wiele płytek, pastę można sekwencyjnie wlewać na wiele płyt.
- Przenieś płytki agarowe na dno klatki.
UWAGA: Pojemnik delikatesowy o pojemności 32 uncji jest dobrym substytutem akrylowych klatek na muchy.
- Zrób pokrywki do pojemników delikatesowych o pojemności 32 uncji, wycinając otwór w górze i przyklejając oddychającą siatkę do otworu za pomocą nietoksycznego kleju. Jeśli klej jest rozpuszczalny w wodzie, nie dopuścić do kontaktu pokrywki z wodą.
- Przenieś 200-300 much do pojemnika i przykryj pokrywką. Przykryj otwór zabezpieczony siatką pustą pokrywką szalki Petriego, aby zapobiec parowaniu z powierzchni agaru i w razie potrzeby dodaj wilgotną bibułkę do wnętrza pokrywki. Wysiadywać muchy w temperaturze 25 °C przez noc przez 16-20 godzin.
2. Zbieraj jajka
- Przygotuj sito do zbierania jaj, umieszczając nylonową siatkę w plastikowej tulei.
- Aby odzyskać talerz z jajami, usuń muchy z klatki, przenosząc je do pustego pojemnika. Jeśli te same muchy zostaną użyte następnego dnia, natychmiast przenieś je do nowej klatki zawierającej świeżo drożdżowy talerz agarowy z sokiem winogronowym. Muchy mogą być używane przez 3-5 kolejnych dni
- Usuń martwe muchy z agaru czystym pędzlem, uważając, aby nie rozbić agaru.
- Zbieraj jajka, płucząc płytkę agarową wodą destylowaną, delikatnie strzepując jajka z powierzchni agaru i wylewając gnojowicę na siatkę. Powtórz 3-4 razy, aż wszystkie lub większość jaj zostanie usunięta z płytki agarowej.
3. Jaja dechorionate i przejście na bezpłodną dietę
- Przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego, spryskując jej wnętrze (w tym boki) 70% etanolem. Przetrzyj spód chusteczką laboratoryjną i sterylizuj kaptur światłem UV przez ~15 min. Wysterylizuj wszystkie materiały niebiologiczne (kubki na próbki, pędzel, kleszcze, pojemnik na odpady, 400 ml wysterylizowanej wody i 100 ml 0,6% podchlorynu sodu) poprzez spryskanie etanolem i natychmiastowe umieszczenie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Sterylizuj światłem UV przez 15 minut.
- Rozpocznij pierwsze z 2 płukań podchlorynem sodu, umieszczając tuleję z jajami w kubku na próbkę o pojemności 120 ml lub innym sterylnym pojemniku. Powoli wlej ~90 ml 0,6% roztworu podchlorynu sodu do tulei, aż znajdzie się tuż pod krawędzią.
- Opłucz jajka przez 2,5 minuty. Okresowo ponownie zawieszaj jaja, przesuwając tuleję w górę iw dół w roztworze podchlorynu za pomocą kleszczy.
- Przenieść tuleję bezpośrednio do drugiego pojemnika na próbkę, wstępnie napełnionego 90 ml wybielacza, wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
- Powtórz krok 3.3 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Pod koniec drugiego wybielacza jaja powinny zacząć przylegać do boków tulei.
- Wykonaj kroki 3.7-3.8 w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Wyrzuć wybielacz i umyj tuleję sterylną wodą 3 razy. Kilkakrotnie ponownie zawieś jajka podczas każdego mycia, przesuwając tuleję kleszczami. Pod koniec trzeciego mycia większość jaj powinna być przymocowana do boku tulei.
- Za pomocą pędzla wysterylizowanego w etanolu przenieś jaja z boku tulei na sterylną dietę. Przenoś jaja pojedynczo lub w małych partiach. Staraj się o 30-50 jaj w fiolce. Pozostaw nakrętki luźne, aby tlen mógł dostać się do rurki.