Przetwarzanie nóg owadów do mikroskopii fluorescencyjnej: metoda zachowania struktur nerwowo-mięśniowych do obrazowania

Ten protokół jest fragmentem Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp.(2018).

1. Sekcja i fiksacja nóg

1. Weź szklaną płytkę wielodołkową i napełnij odpowiednią liczbę studzienek 70% etanolem. Dodaj 15-20 znieczulonych CO 2-znieczulonych muszek (dowolnej płci i w każdym wieku) do każdej studzienki i za pomocą pędzla delikatnie wtrzyj muchy w roztwór etanolu, aż muchy zostaną całkowicie zanurzone.
   UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie hydrofobowości naskórka. Nie myj dłużej niż 1 minutę, ponieważ zwiększa to autofluorescencję naskórka.
2. Opłucz muchy 3 razy 0,3% roztworem detergentu niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Trzymaj muchy w tym roztworze przez co najmniej 10 minut.
   UWAGA: Nogi są lepiej zamocowane, gdy zawierają detergent, który prawdopodobnie zwiększy penetrację utrwalacza wewnątrz nogi.
3. Umieść płytkę wielodołkową na lodzie wraz z rurką z 4% paraformaldehydem (PFA).
   UWAGA: Przygotowanie świeżego 4% PFA z 16% roztworu podstawowego bez etanolu PFA ma kluczowe znaczenie.
4. Użyj kleszczy, aby usunąć głowę i brzuch much, nie uszkadzając odcinka piersiowego ani nóg.
   UWAGA: Usunięcie brzucha ułatwia trzymanie muchy i preparowanie nóg.
5. Wyciąć nogi z odcinka piersiowego za pomocą kleszczy i umieścić nogi w studzienkach zawierających 4% PFA. W tym celu delikatnie, ale stanowczo naciskaj na połączenie kloksa i klatki piersiowej za pomocą końcówki cienkich kleszczy, aż noga się odczepi.
6. Utrwalić nogi w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C (łącznie około 20 godzin).
7. Umyj nogi 0,3% roztworem detergentu niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x PBS, 5x po 20 min każdy.
8. Wymień bufor myjący na medium montażowe. Trzymaj nogę w podłożu montażowym przez co najmniej jeden dzień przed montażem, aby umożliwić jej całkowite wniknięcie w nogę.
   UWAGA: Jeśli podłoże montażowe ma dużą lepkość, rozcieńczyć podłoże mocujące do 80% za pomocą 1x PBS, ponieważ nagła zmiana lepkości może spowodować zapadnięcie się naskórka i uszkodzenie ogólnej struktury nogi. W zależności od sterownika Gal4, muchy mogą być przechowywane przez 1 do 3 tygodni w temperaturze 4 °C w mediach montażowych do momentu montażu.

2. Montaż nóg

1. Umieść około 20 μl 70% glicerolu po lewej stronie szkiełka mikroskopowego i przykryj kwadratowym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm² (Rysunek 1A,B). Odpipetować około 10 μl podłoża montażowego wzdłuż linii równoległej do prawej krawędzi szkiełka nakrywkowego i w niewielkiej odległości od niej. Dodaj kolejne 30 μl podłoża montażowego dalej po prawej stronie szkiełka (Rysunek 1C).
   UWAGA: Podczas nakładania szkiełka nakrywkowego na nogi (patrz poniżej), podłoże montażowe delikatnie rozprowadzi się pod szkiełkiem nakrywkowym i wokół nóg, nie przesuwając ich.
2. Za pomocą cienkich kleszczy wyjmij nogę z roztworu i delikatnie połóż ją na podłożu montażowym w pobliżu lewego szkiełka nakrywkowego. Zrób to samo dla każdej nogi i wyrównaj je od góry do dołu (Rysunek 1D).
   1. Podnieś i przenieś nogi w kropli pożywki trzymanej między obiema końcówkami kleszczy. Ustaw nogi na dwa sposoby: zewnętrzną stroną do góry lub do dołu.
3. Gdy wszystkie nogi (można zamontować do 6–8 nóg) są prawidłowo wyrównane, nałóż drugie szkiełko nakrywkowe na nogi tak, aby szkiełko nakrywkowe lekko spoczywało na poprzednio umieszczonym szkiełku nakrywkowym Rysunek 1E, aby zapewnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a tkanką i zapobiec uszkodzeniu nóg (Rysunek 1G).
   UWAGA: Alternatywnie użyj dołków na naklejki lub wosku ortodontycznego, aby stworzyć przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
4. Użyj lakieru do paznokci, aby zabezpieczyć pozycję szkiełek nakrywkowych w każdym rogu (Rysunek 1F).
   UWAGA: Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania.

Rysunek 1: Procedura montażu nóżek na szkiełkach mikroskopowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.