$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017).
Barwienie przeciwciałami w jelicie C. elegans
- Utrwalenie
- Weź czyste szkiełko i użyj poli-L-lizyny, aby wytworzyć cienką warstwę, na której mogą przykleić się robaki. Umieść 30 μl 0,1-0,2% poli-L-lizyny na szkiełku podstawowym i umieść drugie szkiełko na kropli poli-L-lizyny, aby zrobić "kanapkę". Następnie delikatnie przetrzyj szkiełka kilka razy, aby zwilżyć całą powierzchnię obu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Oznacz matową stronę szkiełek ołówkiem.
UWAGA: 0,2% porcji poli-L-lizyny o zawartości 200 μL zostały wytworzone przez rozpuszczenie proszku w dH2O; można go przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyj poli-L-lizyny o wysokiej masie cząsteczkowej, aby poprawić przywieranie robaków. Krytyczne znaczenie ma również stężenie poli-L-lizyny. Zbyt niskie stężenia nie pozwolą robakom się przykleić, ale zbyt wysokie stężenia mogą generować fluorescencyjny sygnał tła. Zbyt gruba folia może poluzować się w całości.
- Umieść płaski metalowy klocek mocno na dnie pojemnika (np. pojemnika polistyrenowego) wypełnionego ciekłym azotem.
UWAGA: Zamiast tego można użyć suchego lodu, ale ciekły azot utrzymuje metalowy blok bardziej stabilnie na dnie pojemnika i dobrze chłodzi.
- Zbieraj robaki, zmywając je z talerzy za pomocą M9 lub wybierz różne stadia robaków (jaja, robaki L1, L2, L3 lub L4 w stadium larwalnym) na każdym szkiełku. Zazwyczaj wybieraj ~100 larw i zarodków lub ~20 dorosłych na każdy slajd. Umieść 10 μl zmytych robaków na środku szkiełka lub zbierz jaja/robaki do 10 μl M9 lub 10 μL 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
- Użyj pipety, aby rozprowadzić dużą liczbę robaków, aby uniknąć zbrylania.
Uwaga: Mieszane populacje wypłukanych robaków, ze względu na stłoczenie i różną grubość etapów, nie przylegają dobrze i są mniej efektywnie pękane przez zamrażanie (patrz poniżej), dlatego wybieranie robaków specyficznych dla danego etapu (lub zsynchronizowanych populacji) daje lepsze wyniki. Larwy trzymają się lepiej niż dorosłe osobniki, a na jednym szkiełku można umieścić więcej zwierząt.
- Przed pobraniem robaków na szkiełka przenieś je na płytkę z podłożem do wzrostu nicieni (NGM) bez bakterii OP50. Nadmiar bakterii przylegających do robaków może również przeszkadzać w przywieraniu. Uważaj, aby robaki nie wyschły.
- Delikatnie umieścić (upuścić) szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm × 22 mm w poprzek na zebranych robakach tak, aby jego krawędzie zwisały co najmniej z jednej strony szkiełka. Delikatnie ale stanowczo dociśnij jednym lub dwoma palcami do szkiełka nakrywkowego. Unikaj ścinania, które może uszkodzić integralność tkanek.
- Natychmiast i delikatnie przenieś szkiełko na metalowy blok w ciekłym azocie i pozostaw na około 5 minut do zamrożenia. Następnie jednym szybkim ruchem "zdjąć" szkiełko nakrywkowe, używając wystającej krawędzi.
UWAGA: Ten krok należy wykonać zdecydowanie i podczas zamrożenia szkiełka, aby uzyskać "pękanie" naskórka. Ostrzeżenie: Podczas pracy z ciekłym azotem należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi środków ochrony osobistej (PPE).
- Zanurzyć szkiełka mrożone w szklanym słoiku z kopliny wypełnionym metanolem na 5 minut w temperaturze -20 °C. Następnie przenieść do wypełnionego acetonem szklanego słoika Coplin na kolejne 5 minut w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Metanol i aceton należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Po utrwaleniu szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C.
UWAGA: metanol i aceton są toksyczne.
- Wyjmij szkiełka ze słoika i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej (RT) przed użyciem.