Test paraliżu wywołanego pływaniem (SWIP): metoda ilościowego określania lokomocji za pośrednictwem dopaminy u C. elegans

Poniższy protokół jest fragmentem Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).

SWIP

UWAGA: Opisujemy ręczną metodę oceny SWIP u dzikich robaków leczonych AMPH. Pokrótce omawiamy również śledzenie robaków i dalszą analizę kinetyki robaków za pomocą automatycznego narzędzia do śledzenia robaków i oprogramowania śledzącego, które zostały wcześniej opisane przez Hardawaya i wsp.

1. Ręczna metoda testowania SWIP
   1. Podwielokrotność 40 μl roztworu sacharozy o stężeniu 200 mOsm/l, z 0,5 mM AMPH lub bez, do szklanej płytki punktowej. Pod stereoskopem wybierz 8-10 robaków w późnym stadium L4 za pomocą szpikulca lub platynowego kilofa i zanurz szpikulec w płytce zawierającej roztwór, aż robaki odejdą od kilofa i wpłyną do roztworu. Zanotuj liczbę robaków pobranych do studni, uruchom stoper, obserwuj i zapisuj liczbę robaków wykazujących SWIP w każdej minucie.
   2. Skopiuj surowe dane do arkusza kalkulacyjnego i oblicz procent robaków sparaliżowanych, dzieląc liczbę robaków sparaliżowanych co minutę przez całkowitą liczbę robaków testowanych w całym teście i pomnóż przez 100. Skopiuj wartości procentowe do dowolnego oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk i wykreśl dane z wartościami procentowymi na osi Y i czasem na osi X przy użyciu formatu wykresu XY.
   3. Wykonaj dwukierunkową ANOVA, a następnie analizę post-hoc (np. test Bonferroni po teście) w celu zbadania istotności statystycznej wśród grupy kontrolnej, AMPH i czasu leczenia.
2. Zautomatyzowana analiza SWIP
   1. Wykonuj automatyczną analizę pojedynczego robaka na raz. Protokół konfiguracji kamery, oprogramowanie do śledzenia robaków i skrypt do uruchamiania analizy oprogramowania śledzącego są szczegółowo opisane w Hardaway i wsp.
   2. Krótko mówiąc, umieść pojedynczy hermafrodytę późnego stadium L4 w szklanej płytce punktowej, używając szpikulca do rzęs, jak opisano w metodzie ręcznej w sekcji 1.1.2. Nagrywaj filmy z pływania jednego robaka na raz i użyj oprogramowania do śledzenia robaków, aby obliczyć częstotliwość zgięć ciała.
   3. Postępuj zgodnie ze skryptem dostarczonym z oprogramowaniem śledzącym, aby uzyskać częstotliwość młócenia robaków i wygenerować mapy cieplne na podstawie danych o młóceniu robaków.