Czterokierunkowy test olfaktometryczny: metoda oceny reakcji zapachowych u Drosophila

Streszczenie

Źródło: Lin, C.C., et al. Muszki owocowe mają złożony system węchowy, potrafią rozróżniać setki substancji zapachowych i używać swojego węchu do kierowania decyzjami behawioralnymi. Ten film opisuje czterokierunkowy test olfaktometryczny, metodę badania węchowych reakcji behawioralnych u much. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak radzić sobie z muchami testowymi i jakie są krytyczne kroki podczas wykonywania testu.

Protokół

Ten protokół jest fragmentem z Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Reakcje behawioralne na atrakcyjne i odstraszające zapachy

1. Włączyć regulator temperatury i ustawić go na 25 °C.
2. Podłącz komory nawaniania (kontrolne i testowe środki zapachowe), wkładając rurkę do wylotu komory nawaniacza i do złączki wciskanej w skrzynce behawioralnej.
3. Sprawdź natężenie przepływu w każdym kwadrancie za pomocą miernika przepływu powietrza, aby upewnić się, że strumienie powietrza sterującego i zapachowego są równe 100 ml/min.
4. Wyczyść arenę do muchowania z PTFE i szklane płytki 70% etanolem 2-3 razy i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (~3-4 min).
5. Przymocuj szklane płytki do areny za pomocą zacisków.
6. Przenieś muchy bez znieczulenia CO₂ na arenę przez otwór w jednej ze szklanych płytek. Po przeniesieniu umieść okrągłą siatkę na otworze, aby zapobiec ucieczce much.
   UWAGA: Wykazano, że znieczulenie CO₂ wpływa na zachowanie Drosophila i nie powinno być stosowane w ciągu 24 godzin od eksperymentu behawioralnego.
7. Umieść arenę z muchami w światłoszczelnej komorze, podłącz cztery sterujące strumienie powietrza, łącząc rurkę dołączoną do złączki push-to-connect na skrzynce behawioralnej do rogów areny, zamknij drzwi komory i odczekaj 10-15 minut, aby muchy zaaklimatyzowały się w nowym środowisku. Jeśli to możliwe, wyłącz światła w pomieszczeniu, w którym przeprowadzane są eksperymenty, aby uniknąć możliwego minimalnego wycieku światła, który może zniekształcić wynik eksperymentu.
8. Przeprowadź 5-10 minutowy eksperyment kontrolny, w którym muchy są wystawione na działanie 4 kontrolnych strumieni powietrza.
9. Natychmiast przeanalizuj dane (patrz sekcja Analiza danych poniżej), aby upewnić się, że muchy są równomiernie rozmieszczone na arenie, a wskaźnik przyciągania jest bliski 0. Ten krok jest niezbędny, ponieważ weryfikuje, czy na arenie nie ma niekontrolowanych źródeł preferencji lub unikania (np. światło wyciekające z zewnątrz, nierównomierny rozkład temperatury, nierówna arena, zanieczyszczenie zapachami itp.). Jeśli muchy są rozmieszczone nierównomiernie lub ich aktywność lokomotoryczna jest niska, wyrzuć muchy, ponownie oczyść arenę (Krok 1.4) i użyj nowej partii much, aby powtórzyć eksperyment.
10. Podłącz testową komorę nawaniacza do konfiguracji, włączając zawory 3-drogowe lub ponownie podłączając rurki łączące.
11. Uruchom eksperyment testowy przez 5-10 minut i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w sekcji 2 poniżej (Rysunek 1). Nagrania dłuższe niż 20 minut mogą skutkować plikami danych, które mogą być trudne do przetworzenia obliczeniowego. Jeśli pożądane są dłuższe nagrania eksperymentalne, szybko zatrzymaj i ponownie uruchom program śledzący. Powoduje to ~10 sekundową przerwę między nagraniami eksperymentalnymi.
12. Odrzuć muchy.
13. Oczyść arenę i szklane płyty 70% etanolem (krok 1.4) i wymień rurki łączące w światłoszczelnej obudowie. Aby przyspieszyć eksperymenty, można użyć nowej czystej areny, a brudna arena jest czyszczona podczas wykonywania eksperymentalnych przebiegów.
14. W razie potrzeby przeprowadź kolejny eksperyment z nową partią much. Jeśli tego samego dnia przeprowadzanych jest kilka eksperymentów, należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że w systemie nie pozostał żaden nawaniacz z poprzedniego uruchomienia testowego. Zwykle nie stanowi to problemu w przypadku niskich stężeń substancji zapachowych lub CO_{2 ,} ale w przypadku wysoce skoncentrowanych bodźców może być potrzebna przerwa do 24 godzin między seriami doświadczalnymi. Ponadto wszystkie rurki za rurkami przepływowymi mogą być wymienione, jeśli podczas eksperymentów kontrolnych podejrzewa się zanieczyszczenie odorantem. Zawsze pozostawiaj suche powietrze włączone między eksperymentami, aby stale przepłukiwać system.

2. Analiza danych

UWAGA: Sugerowane oprogramowanie do śledzenia much (szczegółowo opisane w Materiałach), śledzi muchy w czasie rzeczywistym podczas akwizycji i zapisuje znacznik czasu oraz współrzędne wszystkich wykrytych much w formacie *.dat. Opracowaliśmy niestandardową procedurę Matlab do konwersji danych do formatu Matlab i analizowania danych. Przykłady kodu znajdują się w materiałach uzupełniających, ale szczegóły implementacji będą zależeć od oprogramowania używanego do pozyskiwania danych.

1. Załaduj nieprzetworzone dane. Utwórz maskę przestrzenną, która podąża za konturami areny i zastosuj maskę do nieprzetworzonych danych, aby usunąć wszystkie punkty danych, które znajdują się poza areną, ponieważ reprezentują szum (Rysunek 2A, kod uzupełniający MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Usuń wszystkie punkty danych, które poruszają się z prędkością poniżej 0,163 cm/s przez okres dłuższy niż 3 s, ponieważ dane te mogą być szumem lub generowane przez nieporuszające się muchy (Rysunek 2B, kod uzupełniający TemporalFiltering.m).
3. Wizualizuj pozostałe punkty danych, wykreślając je wszystkie naraz lub jako pojedyncze trajektorie (Rysunek 1, Kod uzupełniający SingleTrajectoryViewer.m).
   UWAGA: Lokalizacja granic zapachowych w czterech polach prawdopodobnie zależy od wielu czynników, takich jak charakterystyka każdego nawaniacza i stosowane natężenia przepływu powietrza. Na przykład wysoce lotne substancje zapachowe prawdopodobnie wypełnią kwadrant zapachu w pełniejszy sposób niż mniej lotne substancje zapachowe. W związku z tym jest prawdopodobne, że każdy środek zapachowy może wykazywać nieco inne granice zapachowe. Zastosowanie detektora fotojonizacyjnego do pomiaru granic zapachu może być problematyczne, ponieważ wykorzystuje on próżnię do pobierania próbek powietrza z określonego miejsca, a tym samym zakłóca stężenie substancji zapachowej w tym miejscu. Niemniej jednak granice zapachów można szybko oszacować na podstawie danych behawioralnych much. Na przykład granicę zapachu opartą na skumulowanych śladach much w odpowiedzi na różne zapachy można wyraźnie zaobserwować w Rysunek 1C i 1D.
4. Oblicz wskaźnik przyciągania, aby określić, czy eksperymenty kontrolne nie generują żadnej reakcji preferencji, a także uzyskać dostęp do odpowiedzi na bodziec zapachowy (lub optogenetyczny). Aby obliczyć wskaźnik przyciągania (AI), użyj ostatnich 5 minut nagrania kontrolnego lub testowego. Aby uzyskać miarę przyciągania, która mieści się w przedziale od +1 (przyciąganie bezwzględne) do -1 (odpychanie bezwzględne), do obliczenia AI stosuje się następujący wzór:
   
   gdzie test N to liczba punktów danych w kwadrancie testowym, _kontrola N to średnia liczba punktów danych w trzech kwadrantach kontrolnych. Ta miara jest intuicyjna, ponieważ żadna preferencja nie byłaby wskazywana przez wartości bliskie zeru. Jednak nie wskazuje prawidłowo proporcji całkowitej liczby much, które znajdują się w kwadrancie odorantu. Aby uzyskać tę miarę, można użyć wskaźnika procentowego (PI):
   
   gdzie N_test to liczba punktów danych w kwadrancie testu, a N_łącznie to całkowita liczba punktów danych we wszystkich czterech kwadrantach. Ta formuła zapewnia miarę, która mieści się w przedziale od 0 do 1, gdzie 0,25 odpowiada brakowi preferencji behawioralnej (Rysunek 1E i 2C, Kod uzupełniający AttractionIndex.m).
5. Uruchom 5-10 powtórzeń każdego warunku eksperymentalnego, używając nowej grupy much dla każdego powtórzenia. Porównaj indeksy przyciągania między warunkami lub względem kontroli, korzystając z nieparametrycznego testu Kołmogorowa-Smirnowa (Rysunek 1F, funkcja kstest2 w Matlabie).

Wyniki

Rysunek 1: Przykładowe dane wygenerowane przy użyciu czteropolowego testu węchowego. (A) Schemat areny czteroboiskowej. (B) Reakcje neutralne obserwuje się, gdy wszystkie cztery ćwiartki zawierają tylko perfuzję suchego powietrza. (C) Reakcje przyciągania na 6,25% rozcieńczenie octu jabłkowego perfundowanego z lewej górnej ćwiartki. (D) Zachowania odpyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System dostarczania powietrza			(Potrzebna ilość)
Przewody i łączniki
Rozdzielacze termoplastyczne NPT(F)	Cole-Parmer, Illinois, Stany Zjednoczone	Przekaźnik R-31522-31	1
Złączka redukcyjna sześciokątna (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	5232T314	1
Rurki (ID:1/8)	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 5108K43	50 stóp
Rurki (ID:1/16)	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 52355K41	100 stóp
Łączniki do rur kolczastych	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 5117K71	1 opakowanie
Złączki rurowe wtyk-to-connect	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 5779K102	4
Złączki do rur kolczastych (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 5463K439	1 opakowanie (10)
Złączki do rur kolczastych (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 5463K438	Opakowanie 2 (10)
Złączki do rur kolczastych (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 5463K4	Opakowanie 2 (10)
Złączki do rur kolczastych (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 5670K84	1
Wtyczka z sześciokątnym	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 48335K152	1
Regulator ciśnienia powietrza, filtr powietrza i przepływomierze			(Potrzebna ilość)
Urządzenie do suszenia gazów wargowych	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, STANY ZJEDNOCZONE	Model: L68-NP-303; nr urządzenia #26840	1
Ramy wielorurowe do rur przepływowych 150 mm	Cole-Parmer, Illinois, Stany Zjednoczone	Przekaźnik R03215-30	1
Ramy wielorurowe do rur przepływowych 150 mm	Cole-Parmer, Illinois, Stany Zjednoczone	Przekaźnik Przemysłowy R03215-76	1
Rury przepływowe 150 mm	Cole-Parmer, Illinois, Stany Zjednoczone	Przekaźnik R-03217-15	9
Wkład zaworu	Cole-Parmer, Illinois, Stany Zjednoczone	Przekaźnik R-03218-72	9
Precyzyjny regulator powietrza	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał 6162K13	1
Zawory Soleniod	Automatyzacja naukowa, Berkeley, Kalifornia	02-10i	4
Sterownik zaworu elektromagnetycznego	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, Kalifornia	18-sty	1
Przepływomierz elektroniczny	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, Instrumenty Krajowe) oraz	Instrumenty krajowe	NI USB-6009 (port USB-6009	1
zasilacz	Instrumenty Extech	Numer katalogowy: 382200	1
Komory zapachowe
Polipropylenowy słoik z szerokimi ustami 2 uncje; 60 ml	Nalgene powiedział:	562118-0002	Wymagane jest co najmniej 5 na eksperyment, ale dla każdego rozcieńczenia każdego środka zapachowego wymagana jest oddzielna komora. Dostępne w Container Store, część #635114)
Szklana komora zapachowa, 0.25 uncji	Butelka Sunburst	Przekaźnik LB4B	Wymagane jest co najmniej 5 na eksperyment
Zawór "In" do komory zapachowej	Smart Products, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone	214224PB-0011S000-4074	1 z tych części jest używana w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
Zawór "Out" do komory zapachowej	Smart Products, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone	224214PB-0011S000-4074	1 z tych części jest używana w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
O-ring	RT Dygert International, MN, Stany Zjednoczone	AS568-029 Buna-N O-R	1 opakowanie (100)
Arena lotów, kamera i pudełka zachowań			(Potrzebna ilość)
Zachowanie i materiał pudełka z kamerą	Międzystanowe tworzywa sztuczne, Kalifornia, Stany Zjednoczone	ABS wytłaczany (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 cal kwadratowy
Teflon do areny muchowej i wkładów komory zapachowej, grubość 3/8", 12" x 12"	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 8545K27	1
Płyty szklane, grubość 1/8", 9" x 9"	McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 8476K191	cyfra arabska
Regulator termoelektryczny o podwójnym działaniu	WAtronix Inc, CA, Stany Zjednoczone	DA12V-K-0	1
Matryca diod LED na podczerwień	Zaawansowane oświetlenie, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 matryce LED i jeden zasilacz
Jednostka klimatyzacyjna	Sklep Melcor	MAA280T-12	1
System obrazowania			(Potrzebna ilość)
Obiektyw Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm f/1.4) z mocowaniem C	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NOWY JORK, STANY ZJEDNOCZONE	PEC21211 KP	1
połączeniowy CCXC-12P05N	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NOWY JORK, STANY ZJEDNOCZONE	SOCCXC12P05N	1
Adapter do aparatu DC-700	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NOWY JORK, STANY ZJEDNOCZONE	SODC700	1
Filtr podczerwieni B+W 40,5 093	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NOWY JORK, STANY ZJEDNOCZONE	Tel. katalogowy: 65-072442	1
TiFFEN 40,5 mm Polaryzator kołowy	Amazonka		1
Kamera wideo na podczerwień	Industrial Vision Source, Floryda, Stany Zjednoczone	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
Konwerter wideo USB	The Imagingsource, Karolina Północna, Stany Zjednoczone	DFG/USB2-IT	1
iFlySpy2 (oprogramowanie do śledzenia much)	Julian Brown, Stanford, Kalfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
Oprogramowanie do przechwytywania układów scalonych	The Imagingsource, Karolina Północna, Stany Zjednoczone	(http://www.theimagingsource.com/)
rozmaity			(Potrzebna ilość)
Narzędzie obrotowe Dremel	Dremel, Racine, WI, Stany Zjednoczone	Dremel 8000-03	1
Wiertła z powłoką diamentową do cięcia szkła	Dostępne od różnych dostawców; MSC Industrial Supply Co, Melville, Nowy Jork	90606328	1