Ten protokół jest fragmentem Chiu et al., Asmarking Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp.(2010).
1. Ładowanie much do rurek aktywności i systemu monitorowania aktywności lokomotorycznej
- Przed załadowaniem much do probówek aktywnościowych włącz inkubatory, które będą używane do przechowywania monitorów aktywności. Dostosuj temperaturę za pomocą elementów sterujących inkubatora i ustaw reżim światła/ciemności za pomocą sterownika światła systemu DAM LUB własnego systemu sterowania oświetleniem inkubatora zgodnie z pożądanym projektem eksperymentalnym. Czas potrzebny na załadowanie much do rurek do ćwiczeń powinien być wystarczający, aby temperatura się ustabilizowała.
- Znieczulić muchy dwutlenkiem węgla.
- Użyj cienkiego pędzla, aby delikatnie przenieść pojedynczą muchę do rurki aktywności.
- Chwyć środek pojedynczego kawałka przędzy o długości około pół cala za pomocą cienkich kleszczyków i włóż przędzę do nieżywnościowego końca rurki aktywności, aby zatkać otwór i zapobiec ucieczce muchy podczas eksperymentu, jednocześnie umożliwiając przepływ powietrza do rurki. Alternatywnie do zamknięcia otworu można użyć plastikowych nasadek z małymi otworami (Trikinetics, Inc.).
- Upewnij się, że rurki są ułożone na bokach, dopóki mucha się nie obudzi, w przeciwnym razie istnieje ryzyko, że mucha przyklei się do jedzenia.
- Włóż rurki do monitorów aktywności. W nowszym, bardziej kompaktowym modelu monitorów Trikinetics (Trikinetics DAM2 i DAM2-7) konieczne jest przytrzymanie rur na miejscu za pomocą gumek, aby zapewnić, że wiązka podczerwieni przechodzi przez rurkę w pozycji środkowej.
- Umieść monitory aktywności w inkubatorach i podłącz je do systemu zbierania danych za pomocą przewodów telefonicznych. Sprawdź za pomocą oprogramowania do zbierania danych DAM System, aby upewnić się, że wszystkie monitory są prawidłowo podłączone i dane są zbierane z każdego z nich. Monitor emituje wiązkę światła podczerwonego przez środek każdej szklanej rurki aktywnej. Aktywność lokomotoryczna much jest rejestrowana jako surowe dane binarne, gdzie "jeden" jest rejestrowany za każdym razem, gdy wiązka podczerwieni jest przerywana lub rejestrowane jest "zero", w którym wiązka podczerwieni nie jest przerywana.
2. Eksperymentalny projekt do rejestrowania danych do określania okresowości i amplitudy okołodobowej
- Muchy są synchronizowane i porywane poprzez wystawienie ich na działanie pożądanego reżimu światła/ciemności (LD) i temperatury przez 2-5 pełnych dni. Najczęściej stosowanym warunkiem porywania jest cykl światła/ciemności trwający 12 godzin światła / 12 godzin ciemności (12:12 LD) w temperaturze 25 °C. Ten ogólnie przyjęty standardowy warunek opiera się zasadniczo na założeniu, że Drosophila pochodzi z lokalizacji afrorównikowych. Studiując rytmy okołodobowe, istnieje pewna frazeologia, z którą trzeba się zapoznać. W odniesieniu do tego protokołu czas, w którym zapalają się światła w inkubatorze, definiuje się jako czas zeitgebera 0 (ZT0), a wszystkie inne czasy są względne w stosunku do tej wartości (np. w cyklu LD 12:12 ZT12 to czas, w którym światła są wyłączone). W standardowych warunkach LD 12:12 Drosophila melanogaster typu dzikiego zazwyczaj wykazuje dwa napady aktywności; jeden skoncentrowany wokół ZT0 określany jako szczyt "poranny", a drugi wokół ZT12 określany jako szczyt "wieczorny" (Rysunek 1A). Poranne i wieczorne napady są kontrolowane przez zegar endogeniczny, ale istnieją również reakcje "zaskoczenia", które są przejściowymi wybuchami aktywności w odpowiedzi na przejścia między światłem a ciemnością. Dwa dni porywania to minimum i można je wykorzystać na przykład na dużych ekranach, które są bardziej czasochłonne i są nastawione na pomiar okresów swobodnego biegu w ciągłej ciemności (patrz poniżej, krok 2). Jeśli jednak jesteś zainteresowany badaniem wzorców aktywności podczas dziennego cyklu jasnego i ciemnego, lepiej jest utrzymać muchy przez 4-5 dni w LD, aby uzyskać więcej danych. Zasadniczo, zwiększenie liczby much lub liczby dni LD w końcowej analizie danych (np. danych zbiorczych z ostatnich dwóch dni aktywności lokomotorycznej LD) wygeneruje bardziej wiarygodne dobowe profile aktywności i pomiary (np. czas porannego lub wieczornego szczytu). Co więcej, dzienny rozkład aktywności zmienia się w zależności od długości dnia (fotoperiodu) i temperatury. Głównym powodem zmiany fotoperiodu lub temperatury w stosunku do normy jest chęć zbadania, w jaki sposób dzienne wzorce aktywności ulegają sezonowej adaptacji (np. Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila może być również przyzwyczajona do dziennych cykli temperaturowych (np. Glaser i Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova i wsp., Neuron (2009)). Cykle temperaturowe, które różnią się tylko o 2-3 °C, są wystarczające, aby porwać rytm aktywności.
- Rytmy aktywności ruchowej podczas swobodnego biegania są mierzone w stałych warunkach ciemności i temperatury po zakończeniu okresu wycinkowego (patrz wyżej, krok 1). Ustawienie cyklu światła może być zmienione w dowolnym momencie w fazie ciemnej ostatniego dnia LD tak, że następny dzień eksperymentu reprezentuje pierwszy dzień DD. Siedem dni zbierania danych DD wystarcza do obliczenia okresu okołodobowego i amplitudy (np. mocy lub siły rytmu) much. Ogólnie rzecz biorąc, wielkość próby wynosząca co najmniej 16 much jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych okresów swobodnego przepływu dla danego genotypu. Nawet jeśli ktoś jest zainteresowany tylko pomiarem aktywności dobowej, nadal najlepiej jest zmierzyć okresy swobodnego biegu much w DD, ponieważ zmiany w okresie endogennym mogą zmienić dzienny rozkład aktywności w LD. Na przykład, muchy z długimi okresami endogennymi zwykle wykazują opóźnione wieczorne szczyty LD (np. patrz Rysunek 2).
- Na zakończenie eksperymentu surowe dane binarne zebrane za pomocą oprogramowania DAM System są pobierane na przenośne urządzenie do przechowywania danych, np. klucz USB.
- Surowe dane binarne są przetwarzane za pomocą DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) i sumowane w przedziały 15- i 30-minutowe podczas analizy parametrów okołodobowych lub od 1 do 5 minutowych podczas analizy parametrów snu/odpoczynku. Obecnie pięć kolejnych minut bezczynności jest standardową definicją snu/odpoczynku u Drosophila (Hendricks i wsp., Neuron (2000); Ho i Sehgal, Metody Enzymol., (2005)).
- Istnieje wiele różnych sposobów analizowania danych zebranych w systemie DAM, ale udostępniamy tylko te metody, które są rutynowo stosowane w naszym laboratorium. Microsoft Excel służy do przypisywania genotypu do różnych grup próbek. Oprogramowanie FaasX (M. Boudinot i F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francja) lub Insomniac (program oparty na Matlab; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) służą do badania parametrów okołodobowych (np. miesiączki i mocy) lub snu/odpoczynku (np. procentowy sen, średnia długość odpoczynku).
