$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z de Vries and Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Generuj muchy Channelrhodopsin
- Cross UAS-ChR2 leci z wybranym przez Ciebie sterownikiem Gal4, używamy G105-Gal4, który ulega ekspresji w neuronach Foma-1 w płacie wzrokowym.
- Aby wyeliminować możliwość wizualnej reakcji na stymulację światłem niebieskim, obie linie muchowe znajdują się na tle w+norpA.
- Efekt końcowy: w+norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Po zbliżeniu się dorosłych muszek należy umieścić wybrane samice na świeżym pokarmie, uzupełnionym 10 μM all-trans-retinalem (kofaktor wymagany dla ChR2) i chronionym przed światłem, przez 3 dni przed wykonaniem testu behawioralnego.
2. Przygotuj 10 μM Całkowicie Trans-Retinal Enhanced Food
- Rozpuść 100 mg all-trans-retinalu w 17,6 ml 95% etanolu, aby uzyskać 20 mM siatkówki. Utrzymuj all-trans-retinal chroniony przed światłem przez cały czas.
- Rozpuść standardowy pokarm na muchy z mąki kukurydzianej w kuchence mikrofalowej i ostudź do ciepła
.
- Wymieszać 50 μl 20 mM all-trans-retinal z fiolkami zawierającymi 10 ml pokarmu dla much.
- Pozostawić fiolki do ostygnięcia i chronić przed światłem.
3. Wyposażenie
- Końcówki do pipet: Standardowe końcówki do pipet o pojemności 1 000 μl są nacinane w pobliżu końcówki, tworząc pory o średnicy ~2,25 mm.
- Platforma (patrz Rysunek 1).
- Podstawa Delrin o wymiarach 17 cm x 25 cm została skonstruowana z gwintowanymi otworami w każdym rogu, aby dopasować złącza węży płynu chłodzącego 1/4" NPT.
- Pionowy uchwyt, wykonany z Delrin, jest przymocowany do środka podstawy. Wymiary całkowite to 25 mm X 40 mm X 65 mm (szerokość X głębokość X wysokość). Rowek o szerokości 10 mm biegnie przez całą długość uchwytu, ze śrubą skrzydełkową na dole. Do górnej części uchwytu przymocowana jest platforma o wymiarach 25 mm X 40 mm X 10 mm z otworem o średnicy 3,5 mm wyrównanym z rowkiem w uchwycie.
- Tablice LED (patrz Rysunek 1).
- Cztery ramiona węża płynu chłodzącego o długości ~18 cm są przymocowane do podstawy platformy za pomocą złącza węża płynu chłodzącego. Wąż płynu chłodzącego służy tylko jako podpora konstrukcyjna i nie służy do chłodzenia.
- Odpowiednio rozmieszczone rowki są wycinane w ostatnim kawałku węża chłodziwa każdego ramienia, aby przymocować radiator do końca każdego ramienia.
- Niebieska dioda LED Rebel Tri-Stars jest montowana do każdego radiatora za pomocą wstępnie przyciętej termicznej taśmy klejącej. Do każdej soczewki Tri-Star przymocowana jest soczewka Carclo 18° Tri-Star.
- Diody LED Tri-Stars są podłączone do sterowników prądu stałego BuckPuck i zasilacza zgodnie ze specyfikacją. Ustaliliśmy naszą konfigurację tak, aby każdy BuckPuck zasilał szeregowo dwie Tri-Stary.
- Oświetlenie wszystkich czterech diod LED Tri-Stars o natężeniu 700 mA dało natężenie promieniowania na poziomie 713 W/m2 na naszej platformie.
- Kamera: Kamera jest zamontowana na małym statywie i skupia się na górnej części platformy.
4. Test behawioralny
- Krótko znieczulić muchy na lodzie.
- Umieść pojedyncze muchy w końcówkach pipet, używając taśmy do zamknięcia obu końcówek końcówki.
- Po tym, jak muchy się obudzą i będą aktywnie badać końcówkę pipety, usuń taśmę i umieść pipetę w rowku w pionowym uchwycie. Śruba skrzydełkowa służy do zamocowania końcówki pipety na miejscu i zamknięcia dolnej części końcówki.
- Gdy mucha bada końcówkę pipety (zwykle 30 - 60 sekund), rozpocznij nagrywanie z kamery tuż przed tym, jak mucha wynurzy się z końcówki na platformę.
- Po tym, jak mucha pojawi się na platformie, odczekaj 1-2 sekundy i włącz niebieskie diody LED. Użyj timera, aby ręcznie zmierzyć czas, aż mucha rozpocznie lot.
