$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem artykułu Tauc et al., Izolowanie komórek macierzystych jelita od dorosłych Drosophila Midguts przez FACS w celu zbadania zachowania komórek macierzystych podczas starzenia, J. Vis. Exp. (2014).
UWAGA: Jeśli ten protokół jest używany po raz pierwszy do izolacji ISC poprzez sortowanie FAC, następujące kontrole są obowiązkowe w celu początkowego prawidłowego ustawienia parametrów FACS: Zdysocjowane komórki z dzikiego typu (np. w1118) Drosophila midguts bez Sytoxu. Zdysocjowane komórki z jelita środkowego typu dzikiego (np. w1118) Drosophila z Sytoxem (patrz Krok 3.6). Zdysocjowane komórki z jelita środkowego linii muchowej esg-Gal4, UAS-GFP bez Sytoxu.
1. Przygotowanie roztworów i potraw do sekcji jelit
- Przygotuj 4-6 fiolek, z których każda zawiera 40 samic much z linii muchowej esg-Gal4, UAS-GFP.
- Z 10x PBS roztworu podstawowego przygotować 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH2PO4·H2O, 8,4 mM Na2HPO4·2H2O, 175 mM NaCl, dostosować pH do 7,4).
- Przygotować 3,5% roztwór agarozy w 1x PBS (3,5 g agarozy klasy elektroforetycznej w 100 ml 1x PBS). Przygotuj płytki rozekcyjne, wlewając ten roztwór do szalek Petriego (średnica 8,5 cm), aby przykryć dno. Warstwa agarozy zapobiega uszkodzeniu końcówek kleszczy podczas zabiegu preparacji. Po zestaleniu się żelu należy przechowywać płytki rozwarstwiające w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 300 ml 1x PBS + 1% BSA świeżego przed preparacją i umieścić butelkę na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
- Włączyć wirówkę i pozostawić do ostygnięcia do temperatury 4 °C.
- Podpal końcówki 2 szklanych pipet Pasteura, aby wygładzić krawędzie.
- Wyczyść dwie pary kleszczyków i jedną żyletkę 70% etanolem.
- Umieść od czterech do sześciu probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do zbierania wypreparowanych jelit środkowych na lodzie.
2. Przygotowanie przewodu pokarmowego i rozwarstwienie jelita środkowego
- Znieczulić muchy z jednej fiolki (40 much) z CO2 na standardowym łóżku muchowym, odciąć głowy wszystkim muchom za pomocą żyletki i przenieść je do naczynia rozbiorowego. Wlać zimny 1x PBS/1% roztwór BSA do naczynia rozwarstwiającego, aby przykryć żel agarozowy. Muchy będą unosić się na wodzie.
- Chwyć brzuch muchy jedną parą kleszczy, trzymając klatkę piersiową drugą parą kleszczy. Oddziel klatkę piersiową od brzucha. Jelito będzie widoczne, a jelito przednie/urok najprawdopodobniej nadal będzie połączone z klatką piersiową.
- Chwyć jelito i wyciągnij je z klatki piersiowej. Aby rozłożyć jelito, chwyć plon i odciągnij jelito lekko do przodu od brzucha.
- Chwyć tylny koniec brzucha jedną parą kleszczy, a drugą parą kleszczy krawędź otwartego naskórka z przodu. Uważaj, aby nie zniszczyć wystającej tkanki jelitowej. Odciągnij tylny koniec, aby złamać naskórek i kontynuuj ciągnięcie z tyłu bardzo delikatnie, aż całe jelito zostanie wyciągnięte z jamy brzusznej. Może być konieczne wcześniejsze usunięcie plonu, jeśli jest zbyt duży, aby zmieścić się w jamie ciała.
- Usuń jelito przednie, kanaliki Malpighiego, jelito tylne i jajniki, pozostawiając odsłonięte jelito środkowe.
- Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś partię wypreparowanych jelit środkowych do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej zimny roztwór 1x PBS/1% BSA i trzymaj probówkę na lodzie. Próbki muszą zostać przetworzone w ciągu 2 godzin.
- Po zakończeniu sekcji całej partii opłucz naczynie do sekcji wodą podwójnie destylowaną, aby zmyć resztki zanieczyszczeń. Rozpocznij preparowanie następnej partii jelit środkowych (powtórz kroki 2.1–2.7). Przeanalizuj jak najwięcej partii w ciągu 2 godzin, a następnie przejdź do kroku 3.1.
3. Trawienie tkanki jelitowej w celu pobrania komórek do sortowania FAC
- Usunąć 1x PBS/1% roztwór BSA z jelita środkowego i dodać 500 μl 0,5% roztworu trypsyny-EDTA do każdej próbki.
- Dobrze wirować przez 20 sekund i inkubować próbki, delikatnie kołysząc/obracając z prędkością 20 obr./min w temperaturze pokojowej przez 25-30 minut.
- Po około 30 minutach ponownie wykonaj wir i pozwól, aby nienaruszona tkanka jelita środkowego opadła na dno rurki. Ostrożnie usunąć komórki znajdujące się w zawiesinie za pomocą pipety Pasteura ze szkła płomieniowanego i przefiltrować je przez nylonową siatkę 35 μm do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Wirować komórki w temperaturze 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Warto zauważyć, że po rozpoczęciu trawienia osad komórkowy może na początku nie być widoczny, ale stanie się widoczny w miarę postępu trawienia tkankowego.
- Ostrożnie przenieś roztwór trypsyny z powrotem do oryginalnej probówki zawierającej pozostałą nienaruszoną tkankę jelita środkowego. Unikaj przenoszenia zbyt wielu komórek z osadu.
- Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 400 μl zimnego 1x PBS/1% BSA. Probówki do mikrowirówek zawierające zdysocjowane komórki należy przechowywać na lodzie i przykryć probówki folią aluminiową, aby chronić komórki przed światłem.
- Ponownie przemieszać roztwór trypsyny zawierający pozostałą nienaruszoną tkankę jelita środkowego i umieścić próbki na kołysce na kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Powtarzaj kroki od 3.3 do 3.4.3, aż cała tkanka jelita środkowego zostanie strawiona. Połącz zdysocjowane komórki ze wszystkich probówek do mikrowirówek w jedną probówkę do mikrowirówki. Może to wymagać etapu odwirowania, jak w ppkt 3.4, ponieważ objętość wszystkich zawiesin komórkowych razem może przekraczać 1,5 ml. Utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie i chroń komórki przed światłem.
- Wirować zdysocjowane komórki w temperaturze 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu, pozostawiając około 50-100 μl 1x PBS/1% roztworu BSA w probówce mikrowirówkowej. Delikatnie zawiesić zdysocjowane komórki w 800 μl 1x PBS/1% BSA zawierającym Sytox (1:20 000).
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki Falcon o okrągłym dnie o pojemności 5 ml, filtrując komórki przez zatrzask sitka komórkowego (siatka nylonowa 35 μm). Próbki komórek należy zawsze przechowywać na lodzie i chronić przed światłem. Komórki są teraz gotowe do sortowania.
- Odpipetować 600 μl roztworu RNAlater do każdej probówki mikrowirówkowej, do której komórki zostaną posortowane w celu późniejszej izolacji RNA. W przypadku innych dalszych zastosowań komórki mogą być zbierane w innym roztworze, np. w sterylnym PBS.