$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem z Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Lay Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).
1. Budowa komory, montaż, konfiguracja testu
- Niech warsztat mechaniczny zbuduje akrylowe komory do składania jaj (Rysunek 1A-D). Rysunek techniczny różnych elementów przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1-3. Zdjęcia w wysokiej rozdzielczości można również znaleźć tutaj (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Włóż plastikowe arkusze do załadowczej (górnej) części komory, jak pokazano na Rysunek 1C. Służy ona jako dolna powierzchnia podczas załadunku much do poszczególnych aren składania jaj.
- Znieczul samice na podkładce CO2 i załaduj je pojedynczo do każdej areny składania jaj. Odczekaj ~30 minut, aby muchy zregenerowały się po CO2 i zaaklimatyzowały się w nowym środowisku.
- Przygotuj podłoża z agarozy.
- Dla wygody przechowuj gotową butelkę stopionej 1% agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.
- Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać żądaną ilość roztworu sacharozy (2 M) i wymieszać z odpowiednią ilością agarozy. Na przykład, aby przygotować substrat sacharozy o objętości 150 mM, umieść 750 μl 2 M roztworu sacharozy w probówce, a następnie napełnij probówkę agarozą do oznaczenia 10 ml.
- Przygotuj zwykły substrat w ten sam sposób, ale dodaj wodę destylowaną zamiast roztworu sacharozy.
UWAGA: Końcowe stężenie agarozy w tym protokole wynosi nieco mniej niż 1%. Z naszego doświadczenia wynika, że dokładne stężenie agarozy nie ma znaczenia, o ile jest kontrolowane tak, aby mieściło się w granicach ~0,9 - 1,1% i że oba substraty mają takie samo stężenie agarozy.
- Weź substrat (dolny) część komory i odpipetuj 1,000 μl substratu agarozy do każdego koryta, jak pokazano na Rysunek 1D.
- Pozostaw agarozę do zastygnięcia na ~30 min.
- Gdy podłoża agarozowe i muchy będą gotowe, zmontuj wszystkie trzy części komory do składania jaj, a następnie wyjmij plastikowe arkusze.
- Umieść komory w inkubatorach muchowych.
UWAGA: Długość eksperymentów ze składaniem jaj może się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Zazwyczaj przeprowadzamy eksperyment O/N (14 - 16 godzin). Nie zaobserwowano również istotnego wpływu czasu okołodobowego na preferencje dotyczące składania jaj.
- Znieczulić samice, wstrzykując CO2 do komory. Zdemontuj komorę, wyrzuć znieczulone muchy do kostnicy na muchy (tj. pustej puszki po kawie wypełnionej olejem kukurydzianym). Zrób zdjęcia wyników do prowadzenia ewidencji (patrz Rysunek 2).
- Policz liczbę jaj ręcznie i oblicz wskaźniki preferencji do analizy. Obliczyć wskaźnik preferencji jako (Na - Nb)/(Na + Nb), gdzie Na i Nb reprezentują odpowiednio liczbę jaj w miejscu a w porównaniu z miejscem b.
