$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Poniższy protokół jest fragmentem z Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018).
1. Zapobieganie produkcji potomstwa przez dodanie 5-Fluoro-2'-deoksyurydyny (FUdR)
- Hodować zwierzęta do fazy L4 w temperaturze 20 °C. Sprawdzić, czy zsynchronizowane zwierzęta rozwinęły się do L4 około 40 godzin po wysiewie (krok 2.1.7).
UWAGA: Czas rozwoju C. elegans będzie różny w różnych temperaturach, a tempo wzrostu zmutowanych zwierząt, dla których tempo nie zostało scharakteryzowane, musi być empirycznie przetestowane.
- Dodaj 160 μl 50x FUdR do każdej 6 cm płytki ze zwierzętami L4.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dodać FUdR na etapie L4. Dla wygody przygotuj 1,000 zapasów FUdR, rozpuszczając 1 g FUdR w 10 ml ultraczystegoH2O. Filtruj i sterylizuj materiał FUdR z filtrem 0,2 μm i strzykawką o pojemności 10 cm3. Porcjować ~1 ml bulionu do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Sprawdź płytki pod kątem obecności samców C. elegans. Usuń wszystkie samce.
UWAGA: Długość życia jest zwykle mierzona dla hermafrodytów, a nie dla samców. Hermafrodyty, które łączą się w pary, żyją krócej niż zwierzęta niesparowane, nawet w obecności FUdR. Samce są mniejsze i szczuplejsze niż hermafrodyty i można je łatwo rozpoznać po charakterystycznym haczykowatym ogonie.
- Włóż pudełko z powrotem do torby z zamkiem błyskawicznym. Powrócić do inkubatora o temperaturze 20 °C.
2. Opłacalność punktacji
- Codziennie oceniaj żywotność, delikatnie dotykając głowy zwierzęcia platynowym drutem lub rzęsą. Oceń zwierzęta, które się nie poruszają, jako martwe i usuń je z talerza (Rysunek 1A). Zapisz liczbę zaobserwowanych zmarłych dla każdego warunku dla każdego punktu czasowego obserwacji.
UWAGA: Aby zmniejszyć ryzyko błędu systematycznego, eksperymentator musi pozostać ślepy na warunki eksperymentalne i podobnie nie może odwoływać się do wyników z poprzednich punktów czasowych podczas punktacji.
- Cenzuruj zwierzęta, które pękają, umierają z powodu innych oczywistych wad rozwojowych lub pełzają po boku naczynia: usuń te zwierzęta i zapisz ich liczbę w każdym obserwowanym punkcie czasowym w celu uwzględnienia w analizie statystycznej. Dodatkowo, jeśli zostaną znalezione samce, usuń je i zapisz zaobserwowaną liczbę.
- Powtarzać od kroku 2.1 codziennie, aż żadne zwierzę nie pozostanie przy życiu.
UWAGA: Jeśli trawnik E. coli znacznie się zmniejszy lub grzyb zacznie rosnąć na talerzu, przenieś wszystkie pozostałe zwierzęta na świeży talerz z odpowiednimi RNAi i FUdR.
