Trawienie enzymatyczne i dysocjacja ręczna: metoda przygotowania zarodków C. elegans do hodowli komórkowej

Streszczenie

Źródło: Sangaletti, R. and Bianchi, L. A Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

Ten film przedstawia metodę izolacji i sterylnego hodowania embrionalnych komórek C. elegans in vitro.

Protokół

1. Dysocjacja komórek embrionalnych

1. Kolejne etapy zabiegu przeprowadzamy w sterylnych warunkach przy użyciu okapu z przepływem laminarnym. Podczas gdy zwierzęta są ubrane na talerzach bakteryjnych, mycie i leczenie roztworem do lizy zawierającym wybielacz powinno wyeliminować większość, jeśli nie wszystkie bakterie. W ten sposób użycie kaptura laminarnego na tym etapie procedury zapobiega ponownemu zanieczyszczeniu zawiesiny jaj
.
2. Zawiesić jaja granulowane w 1 ml 2 mg/ml chitynazy (bulion w buforze jaj o pH 6,5) i przenieść je do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Kołysz rurką przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Dokładny czas inkubacji zmienia się w zależności od świeżości enzymu i temperatury w pomieszczeniu i dlatego powinien być określony dla każdego preparatu. Zaleca się rozpoczęcie monitorowania jaj pod mikroskopem odwróconej hodowli komórkowej po 10 minutach inkubacji. Uwaga: z naszego doświadczenia wynika, że niskie pH zwiększa aktywność enzymatyczną chitynazy. Z tego powodu używamy buforu jaj o pH 6,5 do rozpuszczenia chitynazy (przepis opisany powyżej, gdzie pH dostosowuje się do 6,5 za pomocą NaOH).
3. Gdy ~ 80% skorupek jaj zostanie strawionych przez traktowanie chitynazą (rysunki 1 A-B), jaja osadzać przez odwirowanie przy 900 x g (~2,500 obr./min) przez 3 min. Używając pipety P1000 i sterylnych końcówek, ostrożnie usuń supernatant i dodaj 3 ml pożywki L-15.
4. Przenieś jaja na płytkę o średnicy 6 cm i delikatnie rozdziel komórki za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 18 G. Monitorować stopień dysocjacji, umieszczając kroplę zawiesiny na świeżej plastikowej szalce Petriego i oglądając pod mikroskopem. Nie należy zasysać powietrza do strzykawki podczas tej procedury, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Kontynuuj dysocjację, aż ~ 80% komórek zostanie zdysocjowanych.
5. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sterylnego filtra miliporowego 5 μm. Zawiesiny komórkowe muszą być filtrowane w celu usunięcia grudek komórek, niestrawionych jaj i wyklutych larw. Przefiltruj dodatkowe 4-5 ml świeżej pożywki L-15 przez filtr, aby odzyskać wszystkie komórki. Nie używaj nadmiernej siły na etapie filtracji, aby uniknąć uszkodzenia filtra i/lub komórek.

2. Hodowla komórek

1. Zdeocjowane komórki osadzać przez odwirowanie przy 900 x g (~2,500 obr./min) przez 3 min. Za pomocą pipetora P1000 i sterylnych końcówek ostrożnie usunąć cały supernatant. Zawiesić granulowane komórki w kompletnym podłożu L-15 i płytce 1 ml/dołek. Ilość dodanego podłoża zależy od liczby 8P użytych płytek, zbieganie się robaków na płytkach oraz rodzaj eksperymentów, które zostaną przeprowadzone na komórkach. Gęstość komórek można określić za pomocą hemocytometru. W przypadku nagrań typu patch-clamp optymalna jest gęstość powlekania ~ 230 000 komórek/^cm2.
2. Przechowywać 24-dołkową płytkę w plastikowym pojemniku Tupperware zawierającym mokre ręczniki papierowe, aby uniknąć odparowania pożywki hodowlanej. Przechowywać pojemnik w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 20 °C i przy obecności powietrza atmosferycznego.
3. Komórki są zwykle gotowe do eksperymentów w ciągu 24 godzin, kiedy różnicowanie morfologiczne i ekspresja markerów GFP są zakończone. Komórki można przechowywać w hodowli do 2 tygodni, ale zwykle są one najzdrowsze do 7-9 dni po posiewie. Pożywkę należy wymieniać raz dziennie, aby utrzymać zdrowe komórki.

Wyniki

Rycina 1. Zarodki C. elegans przed i po leczeniu chitynazą. (A) Fotografia jaj przed ekspozycją na chitynazę. Strzałka wskazuje przezroczystą i nienaruszoną skorupkę jaja otaczającą zarodek. (B) Jaja traktowane chitynazą przez 10 minut. Skorupki jaj zostały strawione i nie są już widoczne wokół zarodków. Strzałki wskazują na trzykrotnie uwolni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODCZYNNIKI
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Płyn	Invitrogen	11415-064
Surowica bydlęca	Invitrogen	Numer katalogowy: 16140-063
Penicylina-streptomycyna	Sigma	P4333-100ML
Chitynaza ze Streptomyces Griseus	Sigma	Zobacz materiał C6137-25UN
Lektyna orzechowa	Sigma	L0881-10MG
WYPOSAŻENIE
101-1000 μl Niebieskie końcówki do pipet z podziałką	Stany Zjednoczone Scentific	Numer katalogowy: 1111-2821
10 ml Sterylizowana pipeta pakowana pojedynczo	Stany Zjednoczone Scentific	Numer katalogowy: 1071-0810
Ergonomiczna pipeta o zmiennej objętości (100-1000 μl) z wyrzutnikiem końcówek	VWR Polska Sp. z o.o.	Numer katalogowy: 89079-974
Przenośna pomoc do pipetowania, Drummond	VWR Polska Sp. z o.o.	Nr kat. 53498-103
Sterylna pipeta do przenoszenia z tworzywa sztucznego	VWR Polska Sp. z o.o.	Nr kat. 14670-114
15 ml Probówka stożkowa	Stany Zjednoczone Scentific	Lata 1475-1611
Sterylne igły o rozmiarze 18	Becton, Dickinson i spółka	305196
Sterylne strzykawki 10 ml	Becton, Dickinson i spółka	305482
Plastikowe filtry strzykawkowe Corning 0,20 μm rozmiar porów	Corning	431224
Akrylowy filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 5 μm versapor	VWR Polska Sp. z o.o.	Numer katalogowy: 28144-095
60x15 mm szalka Petriego sterylna	VWR Polska Sp. z o.o.	82050-548
100x15 mm szalka Petriego sterylna	VWR Polska Sp. z o.o.	82050-912
Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm	VWR Polska Sp. z o.o.	Numer katalogowy: 48300-560
Przezroczyste płytki do hodowli komórkowych 24 dołki z płaskim dnem i pokrywką	Thomas naukowy	6902A09
Dumont #5- Kleszcze cienkie	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11254-20
Wirówka 5702	Eppendorf	22629883
Kaptur z przepływem laminarnym
Mikroskop odwrócony z obiektywem x10
Inkubator z nawilżanym powietrzem otoczenia