$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest fragmentem Tong et al, Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion, J. Vis. Exp. (2013).
1. Eksperyment z elektrotaksją
- Umieść mikrokanalik na stoliku (najlepiej ruchomym XY) mikroskopu z zamontowaną kamerą podłączoną do monitora (rysunek 1).
- Podłącz zasilacz lub amplifier przewody wyjściowe do elektrod mikrokanału. Prosty zasilacz prądu stałego jest wystarczający, jeśli pożądany jest tylko sygnał DC, ale wzmacniacz podłączony do generatora funkcyjnego umożliwia również zastosowanie impulsowych sygnałów DC i AC.
- Podłącz rurkę wyjściową mikrokanału do jednorazowej strzykawki. Zanurzyć wylot rurki wlotowej w buforze fizjologicznym M9 i delikatnie zassać płyn do kanału, przykładając podciśnienie wewnątrz strzykawki (ręcznie lub za pomocą pompy strzykawkowej). Gdy rurki wlotowe i wylotowe są napełnione M9, odłączyć strzykawkę od rurki. Wypoziomuj obie rury na tej samej wysokości, aby zapobiec przepływowi napędzanemu hydrostatycznie.
- Przyłóż napięcie stałe do kanału i upewnij się, że rezystancja (R= V/I) wynosi około 0,6 MΩ (dla mikrokanału o długości 50 mm, szerokości 0,3 mm i głębokości ~0,1 mm).
- Jeśli jesteś zadowolony z integralności kanału, wykonaj powyższe kroki, aby załadować robaki z rozcieńczonej zawiesiny do kanału.
- Odłączyć strzykawkę i hydrostatycznie manipulować przepływem, regulując względną wysokość rurek. Użyj tej metody, aby umieścić robaka na środku kanału, a następnie ułóż obie rurki płasko na tej samej wysokości.
- Ustaw zasilanie na odpowiednie napięcie: 4-12 V/cm dla zwierząt w stadium L3, 4-10 V/cm dla L4 i 2-4 V/cm dla młodych dorosłych. Aktywuj sygnał elektryczny i pozwól robakowi na 1 minutę wstępnej ekspozycji zaaklimatyzować się w terenie. Robak powinien zacząć poruszać się w kierunku katody. Po upływie minuty użyj aparatu, aby rozpocząć nagrywanie.
- W przypadku eksperymentów z prądem przemiennym i impulsowym prądem stałym można przyjąć maksymalne czułe pole elektryczne od góry, a częstotliwość i cykl pracy sygnału można modulować zgodnie z potrzebami.
- Po zakończeniu eksperymentu usuń cały płyn (i robaki) z kanału, przepłucz go dH20 i pozostaw urządzenie na gorącej płycie w temperaturze 125 °C do wyschnięcia.
- Wyodrębnij dane lokomotoryczne z nagranych filmów ręcznie za pomocą NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) lub niestandardowego oprogramowania do śledzenia robaków opartego na MATLAB.
