C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Streszczenie

Źródło: Davies, A. G. et al. Test do pomiaru wpływu etanolu na prędkość lokomocji Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp.(2015).

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

Protokół

Poniższy protokół jest fragmentem Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Kroki do wykonania w dniu poprzedzającym test

   1. Zbieraj robaki w stadium L4 na świeże płytki pożywki wzrostu nicieni (NGM) obsiane trawnikiem OP50 E. coli i hoduj je w temperaturze 20 °C O/N. Każdy warunek testu wymaga 10 robaków; wybierz nadmiar robaków, aby umożliwić utratę robaków O/N.
      1. Bada się tylko zwierzęta, które są dorosłe w pierwszym dniu; wiele mutantów rośnie wolniej niż dzikie. Dostosuj czas zbioru szczepów, które mają opóźnienia rozwojowe, tak, aby wszystkie testowane zwierzęta były dorosłe pierwszego dnia.
2. Kroki, które należy wykonać w dniu testu
   1. Przygotowanie do testu:
      1. Wykonaj testy na standardowych, niewysiewanych płytkach NGM 60 x 15 mm. Suszyć wszystkie płytki, które mają być używane, w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, bez pokrywek. Do każdej próby doświadczalnej należy użyć czterech wysuszonych płytek NGM; będą to płytki do oznaczania etanolu 0 mM i 400 mM oraz towarzyszące im płytki aklimatyzacyjne.
         UWAGA: Istotne jest tutaj zastosowanie płyt NGM; Różnice w składzie płytek, w szczególności ich osmolarność, mogą silnie wpływać na reakcję etanolu na dawkę, co jest spowodowane, przynajmniej częściowo, zmianami ilości etanolu zgromadzonego przez zwierzęta. Agar NGM wynosi 160 mOsm.
      2. Po wysuszeniu zważyć każdą z niewysiewanych płytek NGM, które mają być użyte w teście, i zanotować wagę. Określ objętość nośnika w płytkach na podstawie wagi pustej płytki. Aby w przybliżeniu przeliczyć masę agaru na objętość, załóżmy, że podłoże waży tyle samo, co równa objętość wody.
         UWAGA: Nasze najbardziej spójne wyniki uzyskaliśmy w przypadku pożywek NGM, które odwodniły się na tyle, że oryginalna objętość 10 ml ma objętość po wysuszeniu między 8,3 a 8,9 ml. Alternatywą dla 2-godzinnego czasu schnięcia jest suszenie do momentu, aż płytki osiągną ten zakres objętości, aby uwzględnić różnice w inkubatorach.
      3. Stopić 4 miedziane pierścienie (średnica wewnętrzna 1,6 cm) w powierzchni każdej z płytek, aby działały jako zagrody dla różnych genotypów lub grup badanych robaków. Chwyć każdy pierścień kleszczami i podgrzej w płomieniu (dobrze sprawdza się silny płomień z palnika Bunsena) przez około 3 sekundy. Natychmiast umieść pierścień na talerzu, nadal trzymając pierścień kleszczami, aby zapobiec jego "przeskakiwaniu".
         1. Upewnij się, że pierścień spoczywa płasko na powierzchni agaru, delikatnie dociskając kleszczemi w kilku miejscach na pierścieniu. Podczas umieszczania pierścienia należy uważać, aby zostawić miejsce na dodatkowe trzy pierścienie.
         2. Rozpuść trzy dodatkowe miedziane pierścienie w powierzchni płytki, uważając, aby umieścić je jak najbliżej siebie, tak aby wszystkie cztery znalazły się w polu widzenia kamery.
            UWAGA: Wykonanie dobrego uszczelnienia za pomocą agaru jest niezbędne, aby robaki pozostały w pierścieniach podczas testu. Jest mało prawdopodobne, aby pierścienie, które przeskakują na talerzu, wykonały prawidłowe uszczelnienie z agarem i mogą pozostawić blizny na agarze, co pozwala robakom zakopać się i przeszkadza w wizualizacji robaków.
         3. Dla każdej płytki testowej należy przygotować dołączoną płytkę "aklimatacyjną", która powinna być wysuszona i niewysiewana i nie będzie otrzymywać etanolu. Umieść cztery miedziane pierścienie na tych płytkach.
      4. Oznacz dolną część tabliczek obok każdego pierścienia szczepem robaka, który ma być użyty w pierścieniu, uważając, aby nie pisać w polu view samego pierścienia. Dopasuj etykiety na płytce testowej do dołączonej do niej płytki aklimatyzacyjnej.
      5. Obliczyć ilość 100% etanolu, którą należy dodać do każdej płytki testowej, tak aby końcowe stężenie wynosiło 0 mM lub 400 mM etanolu (waga do objętości). Dla każdego eksperymentu (n = 1) będzie jedna płytka etanolowa 0 mM i jedna 400 mM; Na płytkach aklimatyzacyjnych nie jest podawany etanol. Dodać etanol, pipetując go po powierzchni płytki. Użyj folii laboratoryjnej, aby uszczelnić płytkę i pozwól jej zrównoważyć się na blacie stołu przez 2 godziny.
      6. Po upływie 1,5 godziny rozpocznij etap aklimatyzacji testu, krok 2.2.
   2. Wykonaj test lokomocji: Płytki testowe
      1. Ostrożnie przenieś 10 robaków z każdej grupy eksperymentalnej do środka miedzianego pierścienia na płytce aklimatacyjnej. Usuń wszelkie jedzenie, które jest widoczne na agarze w tym momencie, delikatnie zeskrobując go wykałaczką. Zmieniaj kolejność, w jakiej grupy eksperymentalne są umieszczane na płytkach w różnych próbach eksperymentalnych, tak aby te same szczepy nie były umieszczane na płytkach w tej samej kolejności we wszystkich próbach.
         UWAGA: Celem jest przeniesienie zwierząt na płytkę z minimalnymi ilościami pokarmu, ponieważ jeśli pokarm z płytki aklimatyzacyjnej zostanie przeniesiony na płytkę testową, robaki zgromadzą się wokół pokarmu, a wpływ leku na poruszanie się zostanie zaciemniony.
      2. Uważaj, aby nie naruszyć powierzchni agaru kilofem, ponieważ pozwoli to robakom zakopać się i zakłóci test. Wysiadywać robaki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      3. Upewnij się, że pomiędzy inicjacjami każdej płytki jest odpowiedni odstęp czasu. Doświadczony eksperymentator może przesunąć 40 zwierząt, 10 na pierścień na 4 pierścienie w < 1,5 minuty, ale dopuszczalna jest dowolna interwała do 2 minut. Standardowy test obejmuje nagrywanie filmów po 10-12 minutach i 30-32 minutach ekspozycji zarówno dla etanolu 0 mM, jak i 400 mM.
      4. Uruchom płytkę aklimatacyjną dla ekspozycji 0 mM i płytkę aklimatacyjną dla ekspozycji 400 mM w odstępie około 2 minut i 30 sekund, aby umożliwić zapisanie pierwszego pliku filmowego przed rozpoczęciem drugiego filmu.
      5. Po 30-minutowym okresie aklimatyzacji przenieś robaki z płytek aklimatyzacyjnych na płytki testowe. Przenieść robaki na płytki testowe (0 mM lub 400 mM etanolu) w tej samej kolejności, w jakiej zostały dodane do płytki aklimatacyjnej, śledząc czas między wypełnieniami każdej płytki. Uszczelnij płytkę folią laboratoryjną, aby zminimalizować straty etanolu do parowania.
      6. Użyj ruchu nabierania za pomocą cienkiego spłaszczonego kilofa do robaków, aby zebrać robaki na wierzchu spłaszczonego kilofa. Wykonaj przenoszenie robaków z niewysiewanej płytki aklimatyzacyjnej na płytkę testową bez użycia bakterii, która jest powszechnie stosowana do przenoszenia robaków, ponieważ pomaga przykleić robaka do kilofa.
         UWAGA: Szybkość, z jaką zwierzęta są przenoszone na tym etapie, jest bardzo ważna, ponieważ pierwsze robaki na płytce będą wystawione na działanie etanolu dłużej niż ostatnie robaki dodane do płytki, a wcześniejsze punkty czasowe mogą wykazywać pewne efekty zależne od czasu. Jest to główny powód rotacji, które szczepy są umieszczane na płytce jako pierwsze w powtórzeniach eksperymentalnych.
   3. Wykonaj test lokomocji: Filmowanie
      1. Użyj kombinacji mikroskopu i kamery, która pozwala na jednoczesne obrazowanie wszystkich czterech pierścieni w polu widzenia (około 42x42 mm² kwadrat), takiej jak obiektyw mikroskopowy 0,5x, powiększenie 0,8x i kamera z matrycą CCD o rozdzielczości 2048x2048 pikseli 7,4 μm.
      2. Korzystaj z równomiernego oświetlenia w całym polu widzenia, co pomaga w rozpoznawaniu obiektów na etapie progu intensywności. Dobrze działa podświetlenie 3"x3".
      3. Wyobraź sobie robaki na płytce umieszczonej stroną z podłożem do góry (pokrywą do dołu), która generuje kontrast, który jest tracony podczas korzystania z podświetlenia w porównaniu z tradycyjnym mikroskopowym źródłem światła przechodzącego.
      4. Przygotuj oprogramowanie do analizy obrazu, aby uchwycić filmy poklatkowe poruszających się robaków. Ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało 12-bitowe obrazy w skali szarości co 1 sekundę, jako film 2-minutowy (120 klatek). Aby zmniejszyć rozmiar pliku wyjściowego przy zachowaniu wystarczającej rozdzielczości obrazu, należy użyć trybu łączenia w grupy 2x2 w celu przechwycenia obrazów o rozdzielczości 1024x1024 pikseli.
      5. Nagrywaj filmy. Rozpocznij nagrywanie 120-klatkowego filmu z pierwszej płytki (0 mM etanolu) 10 minut po umieszczeniu ostatnich robaków na tej płycie. Zapisz plik filmowy.
      6. Nagrać drugą płytkę (400 mM etanolu). Powtórz ten proces dla obu płytek, rozpoczynając 30 minut po umieszczeniu ostatnich robaków na pierwszej płytce (0 mM etanolu), aby uchwycić 30–32 minutowe punkty czasowe dla każdej ekspozycji.
         UWAGA: Odczekaj wystarczająco dużo czasu na zapisanie plików obrazu po każdej sesji przechwytywania przed rozpoczęciem nagrywania następnej płyty do analizy.
      7. Aby zabezpieczyć zarchiwizowane filmy na przyszłość oraz umożliwić ich otwieranie i analizowanie przez inne programy do przetwarzania obrazu typu open source należące do domeny publicznej, takie jak ImageJ, należy przekonwertować kopię każdego filmu na 8-bitowe pliki TIFF w skali szarości 256.
         UWAGA: Opisane tutaj oprogramowanie do analizy obrazu wykorzystuje zastrzeżony format pliku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C. elegans szczepy	Centrum Genetyki Caenorhabditis
60 x 15 mm płytki Petriego, potrójnie wentylowane	Greiner Bio-One	628161	Wystarczą inne marki talerzy.
agar NGM	rozmaity		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), pepton (2,5 g/L), 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Kleszcze	rozmaity		np. Fisher Scientific #10300
37 °C Inkubator	rozmaity		Do suszenia agaru
Miedziane pierścienie	Mistrz hydraulika	STK#35583 (Uszczelka z gwintem 48	Pierścienie miedziane o średnicy wewnętrznej 1,6 cm, pierścienie miedziane o średnicy zewnętrznej 1,8 cm
100% etanolu	rozmaity
Parafilm M	Bemis	Zobacz materiał PM996
Kamera CCD	Planowanie jakości	RET-4000R-F-M-12	Ta kamera ma duże pole widzenia.
Mikroskop stereoskopowy z mocowaniem C i obiektywem 0,5x	Księga Leica	MZ6	Model wycofany z produkcji, M60 jest obecnym odpowiednikiem.
Źródło światła	Schott	Numer katalogowy A08923	Podświetlenie 3"x3" zapewnia równomierne oświetlenie w całym polu widzenia
Oprogramowanie do obrazowania i śledzenia	Cybernetyka mediów	ImagePro-Plus w wersji 6.0-6.3	Nowsze wersje oprogramowania posiadają funkcje śledzenia.