$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ten protokół jest zaczerpnięty z Teoh et al, Quantitative Approaches for Study Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Kwantyfikacja struktury mięśniowej ściany ciała
- Obrazowanie fluorescencyjne struktury mięśniowej ściany ciała
- Uzyskaj szczep (na przykład RW1596) przenoszący transgen stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))), który znakuje włókna miozyny GFP.
UWAGA: Wprowadzenie transgenu do organizmu zwierząt można osiągnąć poprzez skrzyżowanie interesującego szczepu ze zwierzętami, które już wykazują ekspresję transgenu, lub poprzez mikrowstrzyknięcie DNA do dystalnego ramienia gonady. Fenotyp "toczenia" indukowany przez mutację rol-6 w tym transgenie ułatwia wizualizację mięśni. Mięśnie ściany ciała biegną wzdłuż strony grzbietowej i brzusznej, które zwykle są niewidoczne u zwierząt typu dzikiego, ponieważ zwykle leżą na jednej z bocznych stron. Allel rol-6 (su1006) indukuje skręcanie zwierząt, odsłaniając w ten sposób niektóre komórki mięśniowe do obrazowania.
- Zobrazuj zwierzęta za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z kamerą ze sprzężonym urządzeniem o wysokiej rozdzielczości (CCD), obiektywem 40X lub wyższym, filtrem GFP i oprogramowaniem do akwizycji.
- Dostosuj czas ekspozycji i intensywność oświetlenia, aby zapobiec przesyceniu obrazów.
- Przechwytywanie i zapisywanie obrazów mięśni (powiększenie 400X) z części zwierzęcia zawierającej co najmniej jedną widoczną widoczną komórkę mięśnia skośnego. Unikaj obszarów z pojedynczą komórką mięśniową, która jest niekompletna lub sekcji, które są nieostre. Wyklucz również obrazy ze skrajnych przednich i tylnych obszarów oraz obszarów przylegających do sromu.
UWAGA: Jeśli zwierzę nie ma ani jednej widocznej pełnej komórki mięśniowej, delikatnie przesuń szkiełko nakrywkowe, aby obrócić zwierzę tak, aby odsłonić całą komórkę.
- Pomiar powierzchni komórek mięśniowych
- Otwórz obraz w oprogramowaniu Fiji (wersja 2.0.0 została użyta w tym badaniu).
- Użyj zaznaczenia wielokąta, aby ostrożnie obrysować pojedynczą ukośną komórkę mięśniową. Dostosuj linię wielokąta na końcu, przeciągając kropkę zakotwiczenia, aby poprawić obrysowywanie.
- Przejdź do zakładki Analizuj w górnej części oprogramowania i kliknij Zmierz, aby obliczyć obszar zaznaczenia. Zostanie wyświetlona oddzielna tabela wyników zawierająca powierzchnię i inne pomiary. Jeśli w tabeli wyników brakuje pomiaru powierzchni, przejdź do opcji Ustaw pomiary na karcie Analiza i sprawdź, czy pole obszaru jest zaznaczone. Podobnie odznacz inne pomiary, które nie są potrzebne.
- W przypadku komórek mięśniowych ze zdegenerowanym/brakującym regionem prześledź brakujący obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów i ponownie kliknij przycisk Zmierz. Jeśli w komórce jest wiele przerw, prześledź każdą przerwę osobno.
- Oblicz stosunek powierzchni przerwy do całej pojedynczej komórki mięśniowej. Wysoki współczynnik wskazuje na większy stopień zwyrodnienia mięśni z powodu dużych luk w komórce. Jeśli nie ma brakujących regionów, jak to często obserwuje się u zwierząt typu dzikiego, współczynnik zostanie obliczony jako zero.
UWAGA: Jako kontrola, oceń również wizualnie defekty struktury mięśniowej i porównaj wyniki z pomiarem ilościowym. Jest to szczególnie przydatne, jeśli szczep jest badany po raz pierwszy w laboratorium. W przypadku oceny fenotypowej należy ocenić zwierzęta jako wadliwe lub niewadliwe na podstawie integralności włókien. Na przykład zwierzęta z utratą wyraźnych prążków włókien, zbrylaniem się GFP lub lukami w komórkach mięśniowych z powodu rozpadu strukturalnego, zostałyby ocenione jako wadliwe.