Nowatorski test nurkowania w butli: metoda badania wrodzonych reakcji na stres u danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Chin J.S.R., et al. Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Artykuł opisuje behawioralną metodę oceny stresu u danio pręgowanego. W odpowiedzi na stres danio pręgowany ma tendencję do pływania na dnie zbiornika, dopóki stres nie zostanie usunięty. Przykładowy protokół opisuje krokową metodę wykonywania testu.

Protokół

1. Nowatorska konfiguracja testowa czołgu

1. Przygotuj zlewkę o pojemności 250 ml wstępnie napełnioną wodą z systemu rybnego i co najmniej dwa zbiorniki retencyjne.
2. Rankiem w dniu testu przenieś co najmniej 10 badanych dorosłych ryb danio pręgowanego, które mają być wykorzystane w każdym warunku doświadczalnym (grupa kontrolna i dorosłe osobniki doświadczalne) z obiektu rybnego do zbiornika retencyjnego, przenieś je do pomieszczenia behawioralnego i pozwól im się zaaklimatyzować przez co najmniej jedną godzinę.
   nuta: Analiza mocy powinna być przeprowadzona przed eksperymentem, ale w naszych rękach n = 10 jest zwykle wystarczające do wykrycia istotności statystycznej. Ponadto zbiornik retencyjny nie powinien zawierać więcej niż pięć osobników na litr wody. Aklimatyzacja trwająca jedną godzinę jest wystarczająca, ponieważ wykazano, że dorosłe ryby danio pręgowane przyzwyczajają się w ciągu 30 minut od nowego zbiornika. Na rytmy behawioralne wpływają również procesy okołodobowe, a zatem powtórzenia eksperymentalne wykonane w różnych dniach powinny być wykonywane w tych samych godzinach. Zazwyczaj wszystkie eksperymenty przeprowadzamy w godzinach od 11:00 do 18:00.
3. Oznacz zbiorniki w taki sposób, aby stan lub genotyp zwierząt był ślepy dla eksperymentatora.
   nuta: Eksperymenty mogą być łatwo zaślepione dla eksperymentatora, oznaczając zbiorniki za pomocą systemu liter lub cyfr (np. jeden zbiornik jest oznaczony jako "A", inny "B" itp.). Strona niezaangażowana w eksperymenty oznacza zbiorniki takim systemem i maskuje tożsamość przed eksperymentatorem do czasu zakończenia analizy.
4. Za pomocą siatki delikatnie umieść pojedynczą osobę dorosłą w wstępnie napełnionej zlewce z kroku 1.1. Pozwól dorosłej rybie zaaklimatyzować się w zlewce przez 10 minut.
   nuta: Zapisz płeć osoby dorosłej, ponieważ może to być ważne po analizie, aby poszukać różnic specyficznych dla płci.
5. Po aklimatyzacji w zlewce wprowadź rybę do nowego zbiornika (szczegóły poniżej), delikatnie wylewając wodę i dorosłe osobniki ze zlewki.
   nuta: Kroki opisane w tej sekcji opisują konfigurację nowatorskiego testu zbiornikowego. Schemat produktu końcowego przedstawiono na rysunku 1B.
   1. Umieść nowy zbiornik na środku stołu.
   2. Umieść światła podczerwone za zbiornikiem i umieść biały arkusz akrylowy lub ekran dyfuzora między zbiornikiem a źródłem światła LED.
   3. Umieść dyfuzor tak, aby maksymalnie rozchodził światło pochodzące z diod LED, a natężenie światła było wystarczające do oświetlenia nowego zbiornika. Im bliżej źródła światła znajduje się płytka, tym jaśniejsze będą światła, ale tym mniej będzie ono rozpraszane. Z kolei umieszczenie płytki dyfuzora z dala od źródła światła zmniejszy natężenie światła, ale lepiej rozprowadzi światło.
   4. Napełnij około trzech czwartych nowego zbiornika wodą z systemu rybnego.
      nuta: Woda systemowa jest wytwarzana za pomocą odwróconej osmozy wody wodociągowej, a następnie dozowania w taki sposób, aby przewodność wynosiła 900 ± 100 μS, pH było neutralne (7.2), a temperatura wynosiła 27 ± 1 °C.
   5. Przymocuj aparat do podstawy aparatu i podłącz go do komputera. Otwórz oprogramowanie do akwizycji wideo i ustaw kamerę tak, aby była skierowana w stronę przodu zbiornika i upewnij się, że cały czołg jest widoczny i że na filmie nie ma zasłoniętych obszarów. Wyreguluj zbiornik i światła podczerwone tak, aby w całym zbiorniku było wystarczające i równomierne oświetlenie obserwowane przez kamerę.
      nuta: Przed przystąpieniem do eksperymentów często przydatne może być przeprowadzenie próbnego przebiegu, w którym rejestrowany jest film przedstawiający rybę i wykonywane jest śledzenie. Zapewni to, że konfiguracja jest wystarczająca do eksperymentowania z zachowaniem.
6. Po wprowadzeniu dorosłego osobnika do nowego zbiornika rozpocznij nagrywanie z kamery i odsuń się od konfiguracji, aby zapobiec dodatkowemu stresowi ryb.
7. Po zakończeniu nagrywania wyjmij osobę z nowego zbiornika i umieść ją w nowym zbiorniku retencyjnym.
   nuta: Aby zapobiec wielokrotnemu testowaniu na tych samych osobach, należy użyć innego zbiornika retencyjnego niż ten opisany w kroku 1.2.

Wyniki

Rysunek 1. Schemat nowatorskiej konfiguracji zbiornika.(A) Wymiary trapezoidalnego zbiornika nowatorskiego o pojemności 1,8 l widziane od strony rejestrującej zbiornika. (B) Schemat konfiguracji wraz z położeniem świateł podczerwonych, kamery i barier stosowanych w celu zminimalizowania ingerencji człowieka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kamera			Używamy kamery USB Point Grey Grasshopper3 z obiektywem firmy Edmund Optics.
Filtr podczerwieni	Edmund Optyka
Program do akwizycji wideo			Korzystaj z programów takich jak Virtualdub lub FlyCapture, ponieważ można ustawić liczbę klatek na sekundę akwizycji.
Światła LED na podczerwień
Zbiornik testowy	Nurkowanie	Nr katalogowy ZT180	rozmiar: M3 1,8 litra
Statyw i zacisk lub standardowy statyw do aparatu
Zlewka 250 ml
Oprogramowanie śledzące			Używamy Ethovision XT 13 firmy Noldus Information Technology