Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest niezwykle użyteczna do wizualizacji z wysoką rozdzielczością przestrzenną przedziałów subkomórkowych mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów (dendryty, kolce dendrytyczne, aksony, zakończenia aksonalne, perikaryon) w ośrodkowym układzie nerwowym, a także ich organelli wewnątrzkomórkowych i cytoszkieletu. W połączeniu z TEM, immunocytochemia przedzatapiająca pozwala na rozróżnienie elementów komórkowych o niewielkiej liczbie charakterystycznych cech i kryteriów identyfikacji (np. perikaryonów i wypustek mikrogleju przy użyciu przeciwciała przeciwko specyficznemu dla mikrogleju markerowi Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; przedstawionemu w niniejszej pracy)), identyfikację zawartości neuroprzekaźników w elementach komórkowych (np. serotoninergicznych) oraz określenie ultrastrukturalnej lokalizacji białek rozpuszczalnych lub związanych z błoną (np. receptorów 5 HT1A i EphA4). W niniejszym protokole opisujemy metodę perfuzji przezsercowej myszy utrwalaczem z akroleiną, wycięcia i sekcjonowania mózgu, a także barwienie immunoperoksydazowo-diaminobenzydynowe (DAB), zatapianie w żywicy i przygotowywanie ultrascienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą TEM. Przy rygorystycznym przestrzeganiu tej techniki możliwe jest uzyskanie doskonałego kompromisu między optymalną konserwacją ultrastruktury a detekcją immunocytochemiczną.
Protokół
1. Perfuzja zwierząt
- Dzień przed perfuzją przygotować:
- 2 L buforu fosforanowego (PB; 100 mM, pH 7.4) oraz 1 L soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu (PBS; 0.9% NaCl w 50 mM PB, pH 7.4) w wodzie dwukrotnie destylowanej. Przechowywać PBS oraz 1 L PB w temperaturze 4°C. Będą one wykorzystane do perfuzji i immunocytochemii przed zatopieniem w medium.
- 1 L 4,0% roztworu utrwalającego paraformaldehydu (PFA, pH 7.4), który wystarczy do perfuzji 6 myszy. W tym celu pod dygestorium podgrzać 1 L PB. Odważyć 40 g granularnego paraformaldehydu (PFA) i wsypać do roztworu PB, gdy osiągnie on temperaturę 60°C. Po całkowitym rozpuszczeniu PFA i uzyskaniu klarownego roztworu, schłodzić go do temperatury pokojowej (RT) i przechowywać w 4°C. - W dniu perfuzji przygotować pod dygestorium 500 mL 3,5% roztworu akroleiny w PB. Następnie przefiltrować roztwory 3,5% akroleiny i 4,0% PFA za pomocą papieru filtracyjnego.
- W celu znieczulenia myszy wstrzyknąć pentobarbital sodu (80 mg/kg) do otrzewnej za pomocą igły 27G o długości ½".
- Podczas perfuzji do krwiobiegu myszy kolejno zostanie wprowadzone 50 mL PBS, 75 mL akroleiny oraz 150 mL PFA. Aby przygotować pompę perystaltyczną, napełnić wężyk PBS i przymocować na jednym jego końcu igłę motylkową 23G o długości ¾". Drugi koniec wężyka zanurzyć w roztworze do perfuzji (PBS, akroleinie lub PFA). Ustawić prędkość pompy perystaltycznej na 20-25 mL/min dla myszy młodocianych i dorosłych. Przez cały czas trwania perfuzji należy uważać, aby w wężyku nie tworzyły się pęcherzyki powietrza.
- Przed przystąpieniem do procedury odczekać, aż znieczulona mysz przestanie reagować na bodźce bólowe, np. uciśnięcie ogona. Położyć zwierzę w kuwecie sekcyjnej i przymocować łapy taśmą. Za pomocą pęsety i nożyczek rozciąć skórę i otworzyć jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Aby zminimalizować niedokrwienie mózgu, perfuzję należy rozpocząć szybko. Przeciąć prawy przedsionek małymi nożyczkami i uruchomić pompę perystaltyczną. Trzymając serce pęsetą, wprowadzić igłę motylkową do wierzchołka lewej komory.
- Przy zmianie roztworu zatrzymać pompę perystaltyczną, przenieść wężyk z jednego roztworu do drugiego i natychmiast ponownie uruchomić pompę.
- Po przepłukaniu 150 mL PFA zatrzymać pompę perystaltyczną. Małymi nożyczkami odciąć głowę, rozciąć skórę i przełamać czaszkę między oczami. Za pomocą małej pęsety ostrożnie usuwać fragmenty czaszki, aż do momentu, gdy mózg będzie można łatwo wyciągnąć. Utrawić mózg (post-fixation) przez 2 godziny w temperaturze 4°C w PFA. Przemyć 3 razy po 10 minut w PBS.
- Natychmiast pociąć mózg w przekrojach poprzecznych (skrawki o grubości 50 μm) w schłodzonym w lodzie PBS przy użyciu wibratomu. Za pomocą cienkiego pędzla przenieść skrawki wybrane do immunocytochemii do szklanej fiolki zawierającej PBS. Pozostałe skrawki przechowywać w temperaturze -20°C w krioprotektorze (30% glikolu etylenowego i 30% glicerolu w PBS) przez okres do kilku lat.
2. Immunocytochemia przed zatopieniem
- W przypadku immunocytochemii preparaty są przetwarzane w formie wolno pływającej w szklanych fiolkach. Przez cały czas trwania procedury należy starannie dbać o to, aby preparaty nie wyschły.
- Najpierw należy usunąć PBS za pomocą pipety transferowej i natychmiast zastąpić go świeżym roztworem 0,1% borowodorku sodu w PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Preparaty należy płukać w PBS 3 razy po 10 minut, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie inkubować przez 2 godziny w RT w roztworze blokującym składającym się z PBS zawierającego 0,5% żelatyny i 5% surowicy prawidłowej zwierzęcia, u którego wytworzono przeciwciało wtórne (surowica kozia w niniejszym przykładzie barwienia Iba1).
- Inkubować przez 48 godzin z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokującym. W przypadku barwienia Iba1 należy zastosować królicze przeciwciało anty-Iba1 (1:1000).
- Preparaty należy płukać w PBS 3 razy po 10 minut i inkubować w przeciwciałach wtórnych sprzężonych z biotyną (1:1000) w roztworze blokującym przez 2 godziny w RT.
W przypadku barwienia Iba1 należy zastosować kozie przeciwciała anty-królicze IgGs. - Preparaty należy płukać w PBS 3 razy po 10 minut i inkubować ze streptawidyną-peroksydazą chrzanową (1:1000) w roztworze blokującym przez 1 godzinę w RT.
- Preparaty należy płukać w PBS przez 10 minut oraz w soli buforowanej Tris/HCl (TBS; 50 mM, pH 7,4) 2 razy po 10 minut. Aby uwidocznić znakowanie, należy inkubować preparaty z 0,05% DAB i 0,01% nadtlenkiem wodoru w TBS (roztwór świeżo przygotowany). Gdy barwienie stanie się ciemnobrązowe (patrz przykład na Rysunku 1), należy przerwać reakcję poprzez płukanie w TBS. W każdym przypadku reakcję należy zakończyć po maksymalnie 5 minutach. Preparaty należy płukać w TBS przez 10 minut oraz w PB 2 razy po 10 minut.
3. Przygotowanie do mikroskopii elektronowej
- Przenieść skrawki do PB w wielodołkowej płytce hodowlanej za pomocą cienkiego pędzla. Przygotować 1% roztwór tetraoksydy osmu w PB pod dygestorium. Usunąć PB z dołków płytki hodowlanej i rozprostować skrawki cienkim pędzlem. Natychmiast zanurzyć skrawki w 1% tetraoksydzie osmu na 30 minut w RT.
- Przenieść skrawki do szklanych fiolek, wypłukać PB 3 razy po 10 minut, a następnie odwodnić poprzez 2-minutowe zanurzenia w rosnących stężeniach etanolu: 2 razy 35%, po 1 razie 50%, 70%, 80%, 90% i 95%, 3 razy 100%, a następnie 3 razy w tlenku propylenu.
- Aby przygotować żywicę Durcupan, połączyć 20 g komponentu A, 20 g komponentu B, 0,6 g komponentu C i 0,4 g komponentu D w jednorazowym zlewce, dokładnie wymieszać do uzyskania jednolitego koloru i przelać do aluminiowej łódki wagowej. W razie potrzeby można przygotować bloki żywiczne, wlewając żywicę do form do zatapiania i utwardzając w piecu w temperaturze 55°C przez 48-72 godziny.
- Używając cienkiego pędzla wypłukanego w tlenku propylenu, wyjąć skrawki z tlenku propylenu i zanurzyć w żywicy Durcupan w celu impregnacji przez noc w RT.
- Następnego dnia umieścić aluminiową łódkę wagową w piecu w temperaturze 55°C na 10 minut, aby zmiękczyć żywicę. Za pomocą pędzla wypłukanego w tlenku propylenu pokryć folię do zatapiania ACLAR cienką warstwą żywicy, ułożyć skrawki, przykryć drugą folią do zatapiania i równomiernie rozłożyć na wierzchu lekkie obciążniki (około 2 g; np. plastikowe zakrętki od szklanych fiolek), aby pomóc w rozprowadzeniu żywicy. W celu polimeryzacji żywicy inkubować w piecu przez 48-72 godziny (w temperaturze 55°C).
- Po polimeryzacji usunąć lekkie obciążniki i folię do zatapiania znajdującą się nad skrawkami. Pod mikroskopem binokularnym wybrać kwadratowe obszary zainteresowania (około 2x2 mm) i ostrożnie wyciąć je z folii za pomocą żyletki.
- Przykleić obszary zainteresowania do końców bloków żywicznych za pomocą Superglue i utwardzić w piecu w temperaturze 55°C przez 1 godzinę.
- W ramach przygotowania do skrawania, przyciąć blok żywiczny do kształtu trapezu równoramiennego za pomocą żyletki.
- Używając ultramikrotomu i noża szklanego, usunąć klej i żywicę z powierzchni tkanki. Napełnić łódzkę noża szklanego wodą dwukrotnie destylowaną i wykonać kilka skrawków półcienkich (o grubości 0,5-1 μm).
- Przenieść skrawki na szkiełko SuperFrost za pomocą pętelki. Osuszyć skrawki, kładąc szkiełko na płycie grzewczej w temperaturze 80°C przez 1 minutę. Przykryć kilkoma kroplami 0,1% barwnika błękitu toluidyny (2 g boranu sodu i 0,2 g błękitu toluidyny w 200 mL wody dwukrotnie destylowanej) na 1 minutę. Wypłukać nadmiar barwnika wodą dwukrotnie destylowaną. Badanie skrawków pod mikroskopem świetlnym pozwoli odróżnić zabarwioną tkankę od żywicy (Rycina 2).
- Kontynuować skrawanie, aż granica między tkanką a żywicą dotrze do środka skrawków. Należy pamiętać, że poniższa procedura wymaga przeszkolenia. Zastąpić nóż szklany nożem diamentowym i napełnić łódzkę wodą dwukrotnie destylowaną. Wyciąć ultrascienkie skrawki srebrne lub srebrno-złote (o grubości 60-80 nm) i ostrożnie zebrać je na siatkach miedzianych za pomocą cienkich pęset odwróconych. Osuszyć siatki na papierze filtracyjnym.
- Aby zwiększyć kontrast, skrawki ultrascienkie można zabarwić cytrynianem ołowiu (0,03 g cytrynianu ołowiu i 0,1 mL 10N wodorotlenku sodu w 10 mL wody dwukrotnie destylowanej1). Używając cienkich pęset odwróconych, przenieść siatkę do kropli cytrynianu ołowiu na 2 minuty. Wyjąć siatkę i delikatnie wypłukać w 3 kolejnych kąpielach wody dwukrotnie destylowanej. Na koniec osuszyć siatki na papierze filtracyjnym i przechowywać je w pudełku na siatki do czasu badania w mikroskopie elektronowym (Ryciny 3-6).
4. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Przekrój barwiony przeciwciałami anty-Iba1 w świetle mikroskopu optycznego. Rozkład komórkowy Iba1 ogranicza się do mikrogleju, co wykazuje swoistość immunobarwienia. Pasek skali=100 μm.
Rysunek 2. Półcienki przekrój barwiony błękitem toluidyny w świetle mikroskopu optycznego. Zwróć uwagę na granicę między tkanką a żywicą, gdzie immunostaining będzie najbardziej intensywny w mikroskopie elektronowym.
Rycina 3. Ultracienki przekrój przedstawiający perikaryon i wypustki mikrogleju immunopozytywne względem Iba1 na poziomie mikroskopii elektronowej. Elementy strukturalne dodatnie dla Iba1 rozpoznawane są po elektronowo gęstym osadzie immunoperoksydazy-DAB. Pasek skali=2 μm.
Rycina 4. Ultracienki przekrój przedstawiający Iba1-immunopozytywne wypustki mikrogleju o różnych rozmiarach i kształtach na poziomie mikroskopii elektronowej. Pasek skali=2 μm.
Rysunek 5. Ultracienki przekrój przedstawiający w większym powiększeniu wypustkę mikrogleju Iba1-dodatnią z Rysunku 4, umożliwiający identyfikację jej organelli wewnątrzkomórkowych. Pasek skali=1 μm.
Rycina 6. Ultracienki przekrój ukazujący przy większym powiększeniu zależności ultrastrukturalne między wypustką mikrogleju dodatnią pod kątem Iba1 a pobliskimi elementami neuropila, w tym synapsami. Pasek skali=1μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy opisaliśmy protokół przygotowania tkanki mózgu myszy do immunomikroskopii elektronowej, który przy rygorystycznym przestrzeganiu procedur zapewnia doskonały kompromis pomiędzy optymalną konserwacją ultrastrukturalną a detekcją immunocytochemiczną.
W połączeniu z TEM metoda ta umożliwia rozróżnienie elementów komórkowych o niewielu charakterystycznych cechach i kryteriach identyfikacji. W szczególności barwienie immunoperoksydazowe DAB na Iba1 pozwala na identyfikację ciał k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Shao-Ming Lu i Harrisowi A. Gelbardowi za udostępnienie pompy perystaltycznej i wibratomu, a także Karen L. Bentley i Gayle Schneider z Electron Microscope Research Core Facility Uniwersytetu Medycznego w Rochester za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana z grantów NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Burroughs Wellcome Fund oraz Alfred P. Sloan Foundation przyznanych A.K.M.. M.-È.T. otrzymuje finansowanie w ramach stypendium podoktorskiego z Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital sodu (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Papier filtracyjny 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Akroleina purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Borowodorek sodu (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Paraformaldehyd w granulkach (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normalne surowica kozia | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko Iba1 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Przechowywać w -20°C, 1:1 w glicerolu |
| Biotynylowany sprzężony fragment F(ab’)2 przeciwciała koziego przeciwko króliczym IgG, specyficzny dla fragmentu Fc | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Przechowywać w -20°C, 1:1 w glicerolu |
| Streptawidyna sprzężona z peroksydazą | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Przechowywać w -20°C, 1:1 w glicerolu |
| *4% roztwór tetratlenku osmu | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Wrażliwy na światło |
| Tlenek propylenu (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Jednorazowe zlewki polipropylenowe (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminiowe naczynia wagowe (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Żywica epoksydowa Durcupan | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Forma do zatapiania | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Medium montażowe DPX do histologii | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Lamelki z podkładem żelatynowym | VWR international | 100241-864 | |
| Folie do zatapiania ACLAR (7,8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Forma kapsułkowa | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| Wysokowydajny superklej | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop do ultracienkich przekrojów | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Lamelki Superfrost | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Nóż diamentowy ultra 45° (2,5-3,5 mm) | Diatome | ||
| Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*Podczas pracy z akroleiną, paraformaldehydem i osmem należy zawsze pracować pod dygestorium, stosować rękawice nitrylowe oraz odpowiednio utylizować odpady. |
Bibliografia
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
