$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Perfuzja zwierzęcia
- Dzień przed perfuzją przygotować:
- 2 L buforu fosforanowego (PB; 100 mM, pH 7.4) oraz 1 L soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu (PBS; 0.9% NaCl w 50 mM PB, pH 7.4) w wodzie dwukrotnie destylowanej. Przechowywać PBS oraz 1 L PB w temperaturze 4°C. Będą one wykorzystywane do perfuzji i immunocytochemii przed zatopieniem.
- 1 L 4.0% roztworu utrwalającego paraformaldehydu (PFA, pH 7.4), który wystarczy do perfuzji 6 myszy. W tym celu pod dygestorium podgrzać 1 L PB. Odważyć 40 g granularnego paraformaldehydu (PFA) i wsypać do roztworu PB, gdy osiągnie on temperaturę 60°C. Po upłynnieniu roztworu i całkowitym rozpuszczeniu PFA schłodzić go do temperatury pokojowej (RT) i przechowywać w 4°C.
- W dniu perfuzji przygotować pod dygestorium 500 mL 3.5% roztworu akroleiny w PB. Następnie przefiltrować roztwory 3.5% akroleiny i 4.0% PFA za pomocą papieru filtracyjnego.
- W celu znieczulenia myszy wstrzyknąć do otrzewnej pentobarbital sodu (80 mg/kg) przy użyciu igły G 27 o długości ½".
- Podczas perfuzji do krwiobiegu myszy kolejno zostanie wprowadzone 50 mL PBS, 75 mL akroleiny i 150 mL PFA. Aby przygotować pompę perystaltyczną, wypełnić dren PBS i zamocować na jednym końcu igłę motylkową G 23 o długości ¾". Drugi koniec drenu zanurzyć w roztworze perfuzyjnym (PBS, akroleinie lub PFA). Ustawić prędkość pompy perystaltycznej na 20-25 mL/min dla myszy młodzieńczych i dorosłych. Przez cały czas trwania perfuzji należy uważać, aby w drenie nie powstawały pęcherzyki powietrza.
- Przed przystąpieniem do procedury odczekać, aż znieczulona mysz przestanie reagować na bodźce bólowe, np. uciśnięcie ogona. Umieścić zwierzę w kuwecie sekcyjnej i przymocować łapy za pomocą taśmy. Pęsetą i nożyczkami rozciąć skórę i jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Aby zminimalizować niedokrwienie mózgu, perfuzję należy rozpocząć szybko. Małymi nożyczkami rozciąć prawy przedsionek i uruchomić pompę perystaltyczną. Trzymając serce pęsetą, wprowadzić igłę motylkową do szczytu lewej komory.
- Przy zmianie roztworu zatrzymać pompę perystaltyczną, przenieść dren z jednego roztworu do drugiego i natychmiast ponownie uruchomić pompę.
- Po przepłynięciu 150 mL PFA zatrzymać pompę perystaltyczną. Małymi nożyczkami odciąć głowę, rozciąć skórę i przełamać czaszkę między oczami. Używając małej pęsety, ostrożnie odłupać małe fragmenty czaszki, aż do momentu łatwego usunięcia mózgu. Przeprowadzić post-utrwalanie mózgu przez 2 godziny w temperaturze 4°C w PFA. Przemyć 3 razy po 10 minut w PBS.
- Natychmiast pociąć mózg w przekroju poprzecznym (sekcje o grubości 50 μm) w schłodzonym w lodzie PBS przy użyciu wibratomu. Za pomocą cienkiego pędzla przenieść sekcje wybrane do immunocytochemii do szklanej fiolki zawierającej PBS. Pozostałe sekcje przechowywać w temperaturze -20°C w krioprotektancie (30% glikolu etylenowego i 30% glicerolu w PBS) przez okres do kilku lat.
2. Immunocytochemia przed zatopieniem w żywicy
- W przypadku immunocytochemii skrawki są przetwarzane metodą wolnopływającą w szklanych fiolkach. Przez cały czas trwania procedury należy starannie unikać wysychania skrawków.
- Najpierw usunąć PBS za pomocą pipety transferowej i natychmiast zastąpić go świeżym roztworem 0,1% borowodorku sodu w PBS na 30 minut w RT.
- Płukać skrawki w PBS 3 razy po 10 minut, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie inkubować przez 2 godziny w RT w roztworze blokującym składającym się z PBS zawierającego 0,5% żelatyny i 5% surowicy prawidłowej zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało wtórne (w niniejszym przykładzie barwienia na Iba1 – surowica prawidłowa kozia).
- Inkubować przez 48 godzin z przeciwciałem pierwotnym w roztworze blokującym. W przypadku barwienia na Iba1 należy użyć przeciwciała króliczego anty-Iba1 (1:1000).
- Płukać skrawki w PBS 3 razy po 10 minut i inkubować w przeciwciele wtórnym sprzężonym z biotyną (1:1000) w roztworze blokującym przez 2 godziny w RT.
W przypadku barwienia na Iba1 należy użyć przeciwciał kozich anty-króliczych IgG.
- Płukać skrawki w PBS 3 razy po 10 minut i inkubować w streptawidynie-peroksydazie chrzanowej (1:1000) w roztworze blokującym przez 1 godzinę w RT.
- Płukać skrawki w PBS przez 10 minut oraz w soli buforowanej Tris/HCl (TBS; 50 mM, pH 7,4) 2 razy po 10 minut. Aby uwidocznić znakowanie, inkubować skrawki z 0,05% DAB i 0,01% nadtlenku wodoru w TBS (roztwór świeżo przygotowany). Gdy barwienie stanie się ciemnobrązowe (patrz przykład na Rysunku 1), zatrzymać reakcję, płucząc w TBS. W każdym przypadku reakcję należy zakończyć po maksymalnie 5 minutach. Płukać skrawki w TBS przez 10 minut oraz w PB 2 razy po 10 minut.
3. Przygotowanie do mikroskopii elektronowej
- Przenieść skrawki do PB w wielodołkowej płytce hodowlanej za pomocą cienkiego pędzla. Przygotować 1% roztwór tetraoksydu osmu w PB pod wyciągiem laboratoryjnym. Usunąć PB z dołków płytki hodowlanej i rozłożyć skrawki płasko za pomocą cienkiego pędzla. Natychmiast zanurzyć skrawki w 1% tetraoksydzie osmu na 30 minut w RT.
- Przenieść skrawki do szklanych fiolek, przepłukać PB 3 razy przez 10 minut, a następnie odwodnić poprzez 2-minutowe zanurzenia w rosnących stężeniach etanolu: 2 razy 35%, po 1 razie 50%, 70%, 80%, 90% i 95%, 3 razy 100%, a następnie 3 razy w tlenku propylenu.
- Aby przygotować żywicę Durcupan, połączyć 20 g komponentu A, 20 g komponentu B, 0,6 g komponentu C i 0,4 g komponentu D w jednorazowym zlewce, wymieszać dokładnie do uzyskania jednolitego koloru i przelać do aluminiowego naczynia wagowego. W razie potrzeby można przygotować bloki żywicy, wlewając ją do form do zatapiania i utwardzając w piecu w temperaturze 55°C przez 48-72 godziny.
- Za pomocą cienkiego pędzla przepłukanego tlenkiem propylenu wyjąć skrawki z tlenku propylenu i zanurzyć w żywicy Durcupan w celu impregnacji przez noc w RT.
- Następnego dnia umieścić aluminiowe naczynie wagowe w piecu w temperaturze 55°C na 10 minut, aby zmiękczyć żywicę. Za pomocą pędzla przepłukanego tlenkiem propylenu pokryć folię do zatapiania ACLAR cienką warstwą żywicy, ułożyć skrawki, przykryć drugą folią do zatapiania i równomiernie rozłożyć na wierzchu lekkie obciążniki (około 2 g; np. plastikowe zakrętki od szklanych fiolek), aby pomóc w rozprowadzeniu żywicy. W celu polimeryzacji żywicy inkubować w piecu przez 48-72 godziny (w 55°C).
- Po polimeryzacji usunąć obciążniki i folię do zatapiania z wierzchu skrawków. Pod mikroskopem binokularowym wybrać kwadratowe obszary zainteresowania (około 2x2 mm) i ostrożnie wyciąć je z folii za pomocą żyletki.
- Przykleić obszary zainteresowania do końcówek bloków żywicznych za pomocą Superglue i utwardzić w piecu w temperaturze 55°C przez 1 godzinę.
- W ramach przygotowania do skrawania, przyciąć blok żywiczny do kształtu trapezu równoramiennego za pomocą żyletki.
- Używając ultramikrotomu i noża szklanego, usunąć klej i żywicę z powierzchni tkanki. Napełnić rynienkę noża szklanego wodą dwukrotnie destylowaną i wykonać kilka skrawków półcienkich (o grubości 0,5-1 μm).
- Przenieść skrawki na szkiełko SuperFrost za pomocą pętelki. Osuszyć skrawki, kładąc szkiełko na płycie grzejnej w temperaturze 80°C przez 1 minutę. Pokryć kilkoma kroplami 0,1% barwnika błękitu toluidyny (2 g boranu sodu i 0,2 g błękitu toluidyny w 200 mL wody dwukrotnie destylowanej) na 1 minutę. Odpłukać nadmiar barwnika wodą dwukrotnie destylowaną. Badanie skrawków pod mikroskopem świetlnym pozwoli odróżnić zabarwioną tkankę od żywicy (Rycina 2).
- Kontynuować skrawanie, aż granica między tkanką a żywicą osiągnie środek skrawków. Należy pamiętać, że poniższa procedura wymaga przeszkolenia. Zastąpić nóż szklany nożem diamentowym i napełnić rynienkę wodą dwukrotnie destylowaną. Wykonać ultrascienkie skrawki srebrne lub srebrno-złote (o grubości 60-80 nm) i ostrożnie zebrać je na miedzianych siatkach za pomocą cienkich pęset odwróconych. Osuszyć siatki na papierze filtracyjnym.
- Aby zwiększyć kontrast, ultrascienkie skrawki można barwić cytrynianem ołowiu (0,03 g cytrynianu ołowiu i 0,1 mL 10N wodorotlenku sodu w 10 mL wody dwukrotnie destylowanej1). Za pomocą cienkich pęset odwróconych przenieść siatkę do kropli cytrynianu ołowiu na 2 minuty. Wyjąć siatkę i delikatnie przepłukać w 3 kolejnych kąpielach wody dwukrotnie destylowanej. Na koniec osuszyć siatki na papierze filtracyjnym i przechowywać je w pudełku na siatki do czasu badania mikroskopem elektronowym (Ryciny 3-6).
4. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Przekrój barwiony Iba1 w świetle mikroskopu optycznego. Rozkład komórkowy Iba1 jest ograniczony do mikrogleju, co wykazuje swoistość immunobarwienia. Pasek skali=100 μm.
Rycina 2. Półcienki przekrój barwiony błękitem toluidyny w mikroskopii świetlnej. Zwróć uwagę na granicę między tkanką a żywicą, gdzie immunobarwienie będzie najintensywniejsze w mikroskopie elektronowym.
Rycina 3. Ultracienki przekrój przedstawiający immunopozytywne dla Iba1 perikaryon i wypustki mikrogleju na poziomie mikroskopii elektronowej. Elementy strukturalne wykazujące pozytywność na Iba1 są rozpoznawalne dzięki elektronowo gęstemu osadowi immunoperoksydazy-DAB. Pasek skali=2 μm.
Rycina 4. Ultracienki przekrój przedstawiający Iba1-immunopozytywne wypustki mikrogleju o różnych rozmiarach i kształtach w badaniu transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Pasek skali=2 μm.
Rysunek 5. Ultracienki przekrój przedstawiający w większym powiększeniu wypustkę mikrogleju dodatnią pod kątem Iba1 z Rysunku 4, umożliwiający identyfikację jej organelli wewnątrzkomórkowych. Pasek skali=1 μm.
Rycina 6. Ultracienki przekrój ukazujący przy większym powiększeniu zależności ultrastrukturalne między wypustką mikrogleju wykazującą pozytywną reakcję z Iba1 a pobliskimi elementami neuropilu, w tym synapsami. Pasek skali=1μm.