$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Walidacja przerzutów do płuc za pomocą indyjskiego napompowania atramentem płuc zawierających guz
UWAGA: Aby potwierdzić wyniki obrazowania guza na żywo lucyferazy, wykonaj inflację tuszem indyjskim płuc myszy zawierających guz, aby określić ilościowo guzki nowotworowe. Komórki 4T1 dają również przerzuty do innych narządów i tkanek (Ryc. 1) i dlatego w razie potrzeby należy przeprowadzić badanie histologiczne tych narządów w celu potwierdzenia przerzutów nowotworowych. W protokole tym jako przykład podano przerzuty do płuc.
- Trzymaj myszy w ich istniejącej klatce domowej w celu eutanazji. W przypadku trzymania ich z innymi zwierzętami przenieś te myszy, które nie są poddawane eutanazji, do innej klatki.
- Zdejmij górną część filtra klatkowego i zastąp ją górną częścią filtra CO2. Włącz butlę ze sprężonym gazem CO2 (100%), która jest podłączona do górnej części filtra CO2. Ustaw natężenie przepływu na 2 l/min i utrzymuj włączony CO2 przez co najmniej 10 minut. Jeśli myszy nadal oddychają po upływie 10 minut, pozostaw CO2 włączony do co najmniej 1 minuty po tym, jak myszy przestaną oddychać. Wyłącz sterowanie butlą CO2 i przepływomierz. Poczekaj jeszcze 3 minuty i zdejmij górną część filtra.
- Ofiarowaną mysz ułożyć na plecach na styropianowej desce. Przypnij nogi, aby zapewnić swobodny dostęp do tchawicy. Spryskaj myszy 70% etanolem.
- Za pomocą nożyczek przetnij wzdłuż linii środkowej brzucha myszy przez klatkę piersiową i w górę w kierunku gruczołów ślinowych. Obserwuj tchawicę. Użyj kleszczy, aby usunąć tkanki otaczające tchawicę, aby odsłonić tchawicę.
- Wsuń końcówkę pipety pod tchawicę. Trzymając końcówkę jedną ręką, delikatnie unieś tchawicę do góry i odsuń ją od ciała.
- Obróć platformę, trzymając mysz o 180°. Użyj strzykawki tuberkulinowej 1/2 CC 27 G 1/2, aby wstrzyknąć atrament indyjski (10% atramentu indyjskiego i 0,1% wodorotlenku amonu) do płuc przez tchawicę. Całkowicie napompuj płuca atramentem, aż poczujesz silny opór.
- Użyj nożyczek, aby przeciąć tchawicę. Użyj kleszczy, aby przytrzymać mysz i włóż kolejny zestaw kleszczy pod płuca i wyciągnij płaty płuc z myszy. Krótko przepłukać płuca w zlewce z wodą.
- W dygestorium chemicznym przenieś płuca do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 3 ml roztworu Fekete (50% etanolu, 6% formaldehydu i 3% lodowatego kwasu octowego). Zakręć fiolkę, aby zapobiec parowaniu roztworu.
nuta: Tkanki mogą być przechowywane w roztworze Fekete w nieskończoność.
- Po kilku minutach obserwuj guzki guza jako białe kropki na czarnych płucach (ryc. 1). Biały guzek guza jest widoczny dla oczu. Przenieś płuca do naczynia w dygestorii i policz liczbę białych plamek. Każda biała plamka reprezentuje pojedynczy guzek guza z przerzutami.
