Przygotowanie próbek do metabolomiki: metoda przygotowania próbek komórek do profilowania metabolitów

Abstract

Źródło: Zhao, Y. C. et al., Biologia systemów regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film opisuje technikę przygotowania próbek komórek raka piersi do profilowania metabolitów. Komórki raka piersi leczy się estradiolem, który wiąże się z receptorem estrogenowym alfa i powoduje zmianę składu metabolitów.

Protocol

1. Przygotowanie próbki do testów metabolomicznych

1. Hodowla komórkowa i leczenie
   1. Wysiej 400 000 komórek MCF7 na 10 cm płytkę w pożywce wzrostowej. Do każdego zabiegu należy przygotować trzy próbki. Użyj dwóch płytek w każdej próbce, aby otrzymać wystarczającą liczbę komórek do wykrycia. W dniu 3 usuń pożywkę i dodaj do komórek 5 ml świeżej pożywki z lub bez ^10-8 M Estradiolu lub E2. Utrzymuj komórki w obróbce przez 24 godziny (37 °C w nawilżonej atmosferze 5%_CO2).
2. Pobieranie próbek
   1. Dodać 5 ml lodowatego 1x PBS do płytki, odessać PBS po krótkim przechyleniu płytki kilka razy. Powtórz dwa razy i usuń jak najwięcej PBS po ostatnim praniu.
   2. Do każdej płytki dodać 750 μl wstępnie schłodzonego acetonu i zeskrobać komórki. Połączyć komórki w acetonie z dwóch płytek w probówce o pojemności 2 ml na lodzie.
   3. Liczba komórek do normalizacji
      1. Do każdego zabiegu należy użyć dwóch dodatkowych płytek do ilościowego oznaczania komórek. Aby odłączyć komórki od płytki, dodać 2 ml buforu HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075%_NaHCO3 i 1 mM EDTA) do każdej płytki i inkubować przez 5 minut.
      2. Zebrać i dobrze wymieszać komórki, pipetując komórki w buforze HE. Użyj łącznie 20 μl roztworu komórek, aby policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
3. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przed wysłaniem do centrum metabolomiki w celu identyfikacji i ilościowego określenia metabolitów za pomocą analizy spektrometrii mas chromatografii gazowej (GC-MS).